CN1932011A - 一种供者型造血嵌合体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种供者型造血嵌合体及其制备方法。该嵌合体中的终末血细胞是由人的干细胞分化、发育而来，其造血功能是由人造血干细胞发挥。该制备方法包括下列步骤：通过人单个核细胞制备移植用人造血干细胞；筛选动物并进行移植前处理；向所筛选的动物移植人造血干细胞；对所筛选的动物进行移植后的处理，得到人/动物造血嵌合体。其是替代人体采血的理想来源，可以解决目前血源不足的问题。

Description

一种供者型造血嵌合体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物细胞技术领域，特别是涉及一种造血嵌合体及其制备方法和血液代用品的应用。

背景技术

近年来，血源不足问题越来越严重，输血传播病原体的问题也越来越突出，使用血液代用品是解决这两个问题的根本办法。在文献：Crawford JH，Chacko BK，Patel RP.Regulation of vascular function by haemoglobin[J].Biochemical Society symposium.2004，71：135-42中指出，目前，已经有较好的血浆代用品用于临床，而红细胞代用品的研究至今还没有显著进展：CF4制剂已被证实只能延迟输血而不能替代输血，血红蛋白制剂(包括血红蛋白胶联制剂和血红蛋白薇囊制剂)很难解决动态调节氧气释放问题，血型转化只是一种提高现有血资源利用效率的方法，干细胞定向培养代价昂贵且有细胞突变的危险。

文献：刘红雨，兰炯采，陈军，陈强，陈宪辉，孙倩，甘茂周.人冻存脐血移植的裸鼠模型[J].中国肺癌杂志，2000，3(3)：208-211报道了人/鼠造血嵌合体的建立方法。该方法利用射线摧毁小鼠的造血系统，然后植入人类的造血干细胞(human Hemopoiesis Stem Cells，hHSC)，从而形成人/鼠造血嵌合体。除此以外，还有将hHSC植入严重联合免疫缺陷小鼠(不进行辐照处理)得到人/鼠造血嵌合体的报道。人鼠造血嵌合体虽然有人源性血细胞产生，但由于鼠的体形微小，不可能用于提供人血液代用品，只适合用作有关科研模型。要想将人/动物造血嵌合体用作人血细胞的可靠来源，所使用的动物必须是大动物。

中国专利申请号：01132231.4的发明公开了一种建立人/山羊造血干细胞异种移植模型(人/山羊造血嵌合体)的方法，该发明从人脐血分离获得hHSC，并建立了人/山羊造血干细胞异种移植模型，实验证实移植山羊静脉血中，显示hHSC扩增至1000-10000倍，稳定保持hHSC并处于不完全分化状态。该发明所建立的移植模型可为贮存和扩增人造血干/祖细胞提供潜在的活体仓库。与此相似，文献：檀英霞，王捷熙，李明，章扬培.建立人/猪造血嵌合体模型的初步探讨[J].中国实验血液学杂志，2005，13(4)：673-676报道了将hHSC移植给胎猪或新生乳猪来建立人猪造血嵌合体的方法。但是，这两种造血嵌合体都只实现了hHSC在嵌合体内的扩增，并没有实现hHSC向人红系终末细胞的分化，也就不可能用于提供人红细胞。要想用人/动物造血嵌合体用作人血细胞的可靠来源，不仅要形成造血嵌合体，还必须是由植入的hHSC行使造血功能，部分或全部代替动物的造血功能，即形成供者型人/动物造血嵌合体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种供者型造血嵌合体及其制备方法，解决了现有人/动物嵌合体不能用作人血细胞来源的问题。

为实现本发明目的而提供的一种供者型造血嵌合体，所述嵌合体中的终末血细胞是由人的干细胞分化、发育而来，其造血功能是由人造血干细胞发挥。

为实现本发明目的又提供一种上述造血嵌合体的制备方法，包括下列步骤：

通过人单个核细胞(hMNC)制备移植用hHSC的步骤；

筛选动物并进行移植前处理的步骤；

将hHSC移植给所筛选的动物的步骤；

对移植hHSC的筛选的动物进行移植后处理，得到供者型人/动物造血嵌合体的步骤。

所述人单个核细胞为人脐血单个核细胞，或者人外周血单个核细胞，或者人骨髓单个核细胞。

所述筛选动物可以是SPF动物，或者无菌动物，或者悉生动物。

所述筛选动物为15日龄以内健康乳猪或者人造血因子基因转基因乳猪。

当所述猪为15日龄以内健康乳猪时，所述移植前处理为对猪实施放射清髓，辐照剂量≥10Gy。

所述向所筛选的猪移植人造血干细胞包括下列步骤：

移植方式：腹腔注射hHSC或静脉注射hHSC或骨髓腔注射hHSC；

移植剂量：每公斤猪体重移植剂量大于1×10⁵个人造血干细胞；

移植次数：大于等于1次；

移植时机：清髓猪须于辐照后2小时内完成首次移植；

所述对对移植人hHSC的猪进行移植后处理，如果所用动物为普通猪而不是转基因猪，则移植后处理包括下面两种方案：

方案一：

移植后开始注射人造血因子，50～1000U/Kg.3d；

常规测量体温、观察皮肤、食欲改变；

清髓猪在移植后10天开始对其实施红细胞、血小板输注，直至造血重建。

方案二：

移植hHSC后立即移植人源性造血因子转染的人骨髓间充质干细胞；

移植后开始注射人造血因子，50～1000U/Kg.3d，1个月以后停止注射；

清髓猪在移植后10天开始对动物实施必要的红细胞、血小板输注，直至造血重建。

所述人源性造血因子基因转染人骨髓间充质干细胞，通过下列步骤制备：

克隆人源性造血因子基因；

用脂质体转染等方法将插入有人源性造血因子基因的pcDNA3转染到人骨髓间充质干细胞中。

如果所用动物为转基因乳猪，则移植后处理采用以下方案：

所述向所筛选猪移植人造血干细胞包括下列步骤：

移植方式：腹腔注射人造血干细胞或静脉注射人造血干细胞或者骨髓腔注射人造血干细胞；

移植剂量：每公斤乳猪体重移植剂量大于1×10⁵个人造血干细胞；

移植次数：大于等于1次；

移植时机：清水乳猪须于辐照后2小时内完成首次移植；

所述对所筛选的无菌乳猪进行移植后的处理，包括下列步骤：

清髓猪在移植后10天开始，直至造血重建。

本发明的有益效果是：本发明的造血嵌合体及其制备方法，利用补充人源性造血因子的方法来解决动物对hHSC的分子不相容性，实现了供者造血型人/动物造血嵌合体。

利用新生期动物作为构建人/动物造血嵌合体的动物，在得到对植入的hHSC免疫赦免的同时，又可以避免对胚胎期动物实施手术的复杂要求；

由于供者型人/动物造血嵌合体部分或全部由hHSC发挥造血功能，其部分或全部红细胞、血小板和白细胞是由人类的造血干细胞分化发育而来，与从人体采集的血细胞具有完全相同的基因起源、细胞表型和生物学功能，是替代人体采血的理想来源，是解决目前血源不足的理想方法。用供者型人/动物造血嵌合体作为临床用血的来源，还可望获得比从人体采血和干细胞定向培养更高的安全性：(1)供者型人/动物造血嵌合体是高度可控的生物工程产物，具有遗传背景可控性和病原学可控性，在建立相应工业标准后，可以提供没有任何病原体污染的、均一性很好的人类血细胞。解决了从人体采血一直存在的血液传播疾病问题；(2)供者型人/动物造血嵌合体的生产过程还具有高度可控性，从饲养条件到采血时基等高度可控，可以提供比从人体采血更均一、更具有活力的血细胞；(3)供者型人/动物造血嵌合体的造血过程在免疫系统的监视之下，可以及时清除突变的细胞，干细胞定向培养相比，减少突变细胞污染的机会。因此，本发明可用于提供与从人体采集的血细胞完全一致的红细胞和血小板。

附图说明

图1是本发明造血嵌合体制备方法示意图；

图2是流式细胞检测人CD34⁺细胞结果图；

图3是用流式细胞仪检测人CD71⁺细胞结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图1～3及实施例，对本发明的一种供者型造血嵌合体及其制备方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的造血嵌合体制备方法的技术原理是：

1)利用新生动物的免疫不健全和/或放射清水，避免实验动物对植入的hHSC的免疫排斥，形成稳定的人/猪造血嵌合体，

2)通过注射人源性促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)等人源性造血因子或通过转染人源性造血因子基因、转基因等方法，使人动物造血嵌合体获得hHSC向终末细胞分化所需的关键造血因子，形成供者型人动物造血嵌合体。

实施例一：

如图1所示，利用注射人源性造血因子的方法构建供者型人/猪造血嵌合体

步骤11：通过人单个核细胞(hMNC)分离、纯化、扩增制备移植用hHSC

A)采用人脐血单个核细胞，分离纯化制备hHSC；

使用的hHSC主要来源于脐血单个核细胞，选择健康、足月产妇，在胎儿自然娩出或剖腹产后，采集脐血，枸橼酸钠抗凝。抗凝脐血与等量RPMI-1640培养液充分混匀，淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNC)，按MACS-CD34⁺免疫磁珠分选试剂盒说明书对MNC进行磁标记，标记细胞通过置于磁场的分选柱，洗脱阴性细胞，将分选柱移出磁场，加压洗脱CD34⁺细胞，台盼蓝染色，计数活细胞。流式细胞仪检测CD34⁺细胞纯度。

B)也可以采用人外周血单个核细胞或者人骨髓单个核细胞分离纯化制备hHSC；

C)也可以直接使用脐血单个核细胞替代hHSC作为移植用细胞。

步骤12：筛选乳猪并进行移植前处理；

步骤121)选择4只15日龄以内健康乳猪，雌雄不拘，测量体重。

步骤122)构建完全供者型人猪造血嵌合体用乳猪需进行辐照清髓，辐照剂量为≥10Gy；构建不完全供者型人猪造血嵌合体用乳猪无需清髓。

步骤13：向所筛选的无菌乳猪移植人造血干细胞(hHSC)；

移植方式：腹腔注射hHSC或静脉注射hHSC或者骨髓腔注射hHSC。

移植剂量：每公斤乳猪体重移植剂量＞1×10⁵个hHSC。

移植次数：大于等于1次。

移植时机：清水乳猪须于辐照后2小时(2h)内完成首次移植。

步骤14：对所筛选的无菌乳猪进行移植后的处理，得到本发明的供者造血型人/猪造血嵌合体。

步骤141)移植后开始注射重组人红细胞生成素(Recombinant HumanErythropoietin，rhEPO)等人造血因子，50～1000U/Kg.3d，终身用药。

步骤142)常规测量体温、观察皮肤、食欲改变。

步骤143)清髓乳猪在移植后10天开始，必要时输注红细胞和血小板，例如有严重贫血和出血倾向时，直至造血重建。

步骤144)猪的母乳喂养或人工饲养。

所用4头乳猪移植hHSC后，均存活。为了测定本发明的供者造血型人/猪造血嵌合体的形成，对采用本发明造血嵌合体制备方法制备的人/猪造血嵌合体进行人红细胞生成检测。在hHSC移植后15天、30天、60天、120天，采集猪外周血液，密度梯度离心法分离单个核细胞，用鼠抗人CD71-FITC抗体标记，流式细胞仪测定标记阳性细胞率，结果见表1。

表1 人/猪造血嵌合体中人CD71⁺细胞的动态变化

测定时间	15天	30天	60天	120天
					人CD71+阳性细胞率(％)	13.2±5.6	52.3±11.5	26.1±8.3	9.6±4.9

以上结果说明植入的hHSC在15天左右就出现了向红细的分化，30天左右为红细造血高峰期，之后红细造血逐渐趋于平稳。该结果还说明，所得人主造血嵌合体为供者型人/猪造血嵌合体。

图2为流式细胞仪检测人CD34⁺细胞结果；图3为用流式细胞仪检测人CD71⁺细胞结果。

实施例二：

利用转染人源性基因方法构建供者型人猪造血嵌合体

与实施例一类似，不同之处在于：

21)向所筛选的乳猪移植人造血干细胞(hHSC)后，立即移植人源性红细胞生成素(hEPO)等人源性造血因子基因转染的人骨髓间充质干细胞。

其中，对于人源性造血因子基因转染人骨髓间充质干细胞，通过下列步骤而制备：

步骤211)克隆hEPO等人源性造血因子基因。从基因库(GenBank)检索基因序列，设计扩增引物(引入酶切位点BamH I和Xho I)，进行RT-PCR，回收扩增片段，测序无误后，插入到真核表达载体(pcDNA3)中。

其中，RT-PCR是现有的将RNA模板的反转录(RT)，和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。

步骤222)用脂质体转染等方法将插入有人源性造血因子基因的pcDNA3转染到人骨髓间充质干细胞中，筛选阳性克隆，进行培养扩增。

22)对所筛选的乳猪进行移植后的处理处理过程中，还包括下列步骤：

移植1月后起，不再需要注射hEPO。

实施例三：

利用转基因猪构建人猪造血嵌合体

与实施例一类似，不同之处在于：

31)所筛选的用于构建人/猪造血嵌合体的乳猪为转基因猪。

32)对所筛选的转基因猪，移植hHSC后无需注射人源性造血因子，如rhEPO等。

下面进一步详细说明本发明的供者造血型人/猪造血嵌合体的应用：

A)本发明的供者型人/猪造血嵌合体作为提供人红细胞的应用

从供者型人/猪嵌合体分离人红细胞：

从6月龄以上供者型人主造血嵌合体采集外周血400ml/次，加入人抗猪种属抗体(从人血浆中分离得到，发明人自制)，混匀，37℃保温10分钟，4℃，3500转/分钟离心8分钟，弃血浆；加入无菌生理盐水100ml，混匀，4℃，3500转/分钟离心5分钟，反复3次。为了测定所得人红细胞的生物安全性，将从供者型人主造血嵌合体采集的红细胞以及从其分离的人红细胞(O型2例、A型2例)分别与多人混合A型人血浆、多人混合B型人血浆、多人混合AB型人血浆、多人混合O型人血浆作卡式配血试验，结果见表2。

表2 从供者型人主造血嵌合体采集、分离的红细胞与人血清的反应

	混合A型血桨	混合B型血桨	混合AB型血桨	混合O型血桨
					采集的O型血	+a	+	+	+
采集的A型血	+	++++b	+	++++
					分离的O型血	-c	-	-	-
分离的A型血	-	++++	-	++++

a表示出现弱凝集；b表示出现极强凝集；c表示未见凝集。

从表2.可见，即使是用O型人造血干细胞制备的造血嵌合体，从其采集的血液将与所有血型的人血清发生凝集，估计是从供者型人/猪造血嵌合体采集的血液含有少量猪源性红细胞污染，与人血浆中的种属抗体发生凝集反应的缘故。经过从人血浆分离的种属抗体处理和洗涤后，从人/猪造血嵌合体分离的红细胞表型出与从人体采集的红细胞一样的配血特性，即O型红细胞与所有血型的血浆无凝集，A型红细胞只与B型、O型人血浆发生强凝集而与A型和AB型人血浆无凝集。

B)本发明的供者型人/猪造血嵌合体作为提供人血小板的应用

与A)类似，不同之处在于分离的目的物为人血小板。

本发明的造血嵌合体的制备方法、制品及用途，利用补充人源性造血因子的方法来解决猪对hHSC的分子不相容性，实现了供者造血型人/猪造血嵌合体；利用新生期乳猪作为构建人猪造血嵌合体的动物，在得到对植入的hHSC免疫赦免的同时，又可以避免对胚胎期动物实施手术的复杂要求。

本发明可用于提供与从人体采集的血细胞完全一致的红细胞和血小板。其优点在于：(一)从人/猪造血嵌合体采集的血细胞具有完美的生理活性和免疫学性质。供者型人/猪造血嵌合体是接受hHSC移植后，由人造血干细胞发挥造血功能的动物。它的血细胞是由人类的造血干/祖细胞分化发育而来，与从人身上采集的血细胞完全相同。(二)可以解决血源不足，特别是稀有血型血源不足的问题。使用造血嵌合体(haematopoietic chimera，HC)，可以按照需要工业化生产人血细胞，“血荒”问题就可以迎刃而解。另外，HC不仅能够提供成熟的人血细胞，也能提供人造血干细胞，利用这一特点，我们可以把稀有血型无限扩增，甚至能提供商品化的“万能红细胞”。(三)更安全。用HC来生产红细胞的方法是一种高度可控的过程。可以生产出不含病原体的红细胞，从而避免从人体采血遇到的窗口期危险，也可以避免干细胞定向培养遇到的细胞突变危险。

本发明的各个实施例只是为了更好地理解本发明进行的详细的描述，并不是对本发明所保护的范围的限定，因此，本领域普通技术人员不脱离本发明的主旨未经创造性劳动而对本明所做的改变在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1、一种供者型造血嵌合体，其特征在于：所述嵌合体中的造血功能是由人造血干细胞发挥，其部分或全部终末血细胞是由人的干细胞分化、发育而来，可用作医用人红细胞、血小板来源。

2、一种供者型造血嵌合体的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

通过人单个核细胞制备移植用人造血干细胞的步骤；

筛选动物并进行移植前处理的步骤；

将人造血干细胞移植给所筛选的动物的步骤；

对移植人造血干细胞的筛选的动物进行移植后处理，得到供者型人/动物造血嵌合体的步骤。

3、根据权利要求2所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，所述人单个核细胞为人脐血单个核细胞，或者人外周血单个核细胞，或者人骨髓单个核细胞。

4、根据权利要求2所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，所述筛选的动物为SPF动物、无菌动物或者悉生动物。

5、根据权利要求2所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，所述筛选的动物为15日龄以内健康乳猪，或者人造血因子基因转基因乳猪。

6、根据权利要求2或4或5所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，当所述猪为15日龄以内健康乳猪时；

所述移植前处理为：对猪实施放射靖髓，辐照剂量大于等于10Gy。

7、根据权利要求6所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，所述向所筛选的猪移植人造血干细胞包括下列步骤：

移植方式：腹腔注射人造血干细胞或静脉注射人造血干细胞或者骨髓腔注射人造血干细胞；

移植剂量：每公斤猪体重移植剂量大于1×10⁵个人造血干细胞；

移植次数：大于等于1次；

移植时机：清髓猪须于辐照后2小时内完成首次移植。

8、根据权利要求7所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，所述对所筛选猪进行移植后的处理，包括下列步骤：

移植后开始注射人造血因子，50～1000U/Kg.3d；

常规测量体温、观察皮肤、食欲改变；

清髓猪在移植后10天开始对其实施红细胞、血小板输注，直至造血重建。

9、根据权利要求7所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，所述对所筛选猪进行移植后的处理，包括下列步骤：

移植人造血干细胞后立即移植人源性造血因子转染的人骨髓间充质干细胞；

移植后开始注射人造血因子，50～1000U/Kg.3d，一个月以后停止注射；

清髓猪在移植后10天开始对其实施红细胞、血小板输注，直至造血重建。

10、根据权利要求9所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，所述人源性造血因子基因转染人骨髓间充质干细胞，通过下列步骤制备：

克隆人源性造血因子基因；

用脂质体转染等方法将插入有人源性造血因子基因的pcDNA3转染到人骨髓间充质干细胞中。

11、根据权利要求2或4或5所述的造血嵌合体的制备方法，其特征在于，当所述猪为转基因乳猪时；

所述向所筛选猪移植人造血干细胞包括下列步骤：

移植方式：腹腔注射人造血干细胞或静脉注射人造血干细胞或者骨髓腔注射人造血干细胞；

移植剂量：每公斤乳猪体重移植剂量大于1×10⁵个人造血干细胞；

移植次数：大于等于1次；

移植时机：清水乳猪须于辐照后2小时内完成首次移植；

所述对所筛选的无菌乳猪进行移植后的处理，包括下列步骤：

清髓猪在移植后10天开始对其实施红细胞、血小板输注，直至造血重建。

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