CN1174672C - 一种应用铁皮石斛激素自养型茎尖培养生产药材的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物工程技术领域。具体涉及一种激素自养型铁皮石斛茎尖大规模培养生产药材的新方法。本发明以野生铁皮石斛为原始材料，获得铁皮石斛茎尖无菌培养系，对茎尖进行诱导培养，建立了适合大规模生产的激素自养型茎尖培养系统，培养物的主要有效成分等于或高于野生铁皮石斛，二者均具有提高机体非特异性免疫功能和细胞免疫功能。

Description

一种应用铁皮石斛激素自养型茎尖培养生产药材的方法
技术领域
本发明属生物工程技术领域。具体涉及一种应用铁皮石斛茎尖培养生产药材的方法。
背景技术
石斛属(Dendrobium)为兰科的一个大属，包括1600多种[1]植物，我国约有63种，其中供药用的有30多种，主要有环草石斛(D.loddigesii)、马鞭石斛(D.fiubriatum)、铁皮石斛(D.officinale)、黄草石斛(D.chrysanthum)和金钗石斛(D.nobile)，铁皮石斛为其中最为珍贵者。中医认为石斛具有养阴清热、生津止渴和明目强身的作用，现代医学发现石斛含有多种生物碱、多糖和氨基酸，具有提高免疫、抑制血栓形成、抑制肿瘤和延缓衰老的作用。
石斛属植物自然繁殖率很低，加之人们过度采挖，其资源日渐枯竭。作为一味滋阴清热的名贵中药，近年来国内外对石斛尤其是铁皮石斛的需求量越来越大，石斛的栽培研究虽然很多，但由于石斛生长非常缓慢，目前的栽培远不能满足市场的需求。因此，有关石斛属植物的组织培养日益引起人们的重视，有关这方面的研究逐渐增多，这些研究主要集中于从不同外植体——试管苗——栽培这一途径，虽有一些圆球茎培养和愈伤组织培养的研究，但大规模生产没有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在于针对上述问题，利用植物组织培养技术，通过铁皮石斛激素自养型茎尖的制备、筛选和培养，从而大规模生产这一名贵药材的药用部位——茎尖。
本发明的主要内容如下：
一种铁皮石斛茎尖培养系，其特征在于：
1.以野生铁皮石斛(Dendrobium officinale)顶芽为材料，用70％的医用乙醇浸泡1min，随后转移至10％次氯酸钠水溶液中进行表面消毒，播种于高温灭菌过的MS+NAA 1.5mg/L+KT 0.2mg/L固体培养基上，在温度为25±1℃下光照培养，pH值为5.8，60天后得铁皮石斛茎尖。
2.将所得到的茎尖在相同培养基上培养稳定后，逐渐减少激素加入量，继续培养，每4～5个月继代一次，直至激素减少到零，经过约3年的诱导筛选，得到稳定的铁皮石斛茎尖培养体系，外形介于圆球茎和小苗之间。
3.比较不同的碳源、氮源和磷源对茎尖生长和多糖、总生物碱含量影响的结果，同时为了降低成本，我们筛选并设计了改良的N6培养基为基本培养基，其组成见表1。
4.在这一培养基上，我们研究设计了最佳的培养条件，光照1500-2500lux，温度20～28℃。
表1为本发明所用的培养基配方
                        生长培养其(mg/L)
(NH4)2SO4                    450
KNO3                            2800
CaCl22H2O.                    150
MgSO47H2O                     200
KH2PO4                        420
KI                               0.8
H3BO3                         1.5
MnSO4.4H2O                    5
ZnSO4.7H2O                    1.5
FeSO4.7H2O                    27.8
Na2.EDTA.2H2O                 37.3
烟酸                             0.5
盐酸吡哆醇                       0.5
盐酸硫胺素                       1.0
蔗糖                             2％(w/v)
pH5.6～5.8
本发明的应用铁皮石斛激素自养型茎尖培养药材的方法，该方法包括下列步骤：
(1)按配方配制培养基
                         生长培养基mg/L
(NH4)2SO4                    450
KNO3                            2800
CaCl22H2O.                    150
MgSO47H2O                     200
KH2PO4                        420
KI                               0.8
H3BO3                         1.5
MnSO4.4H2O                    5
ZnSO4.7H2O                    1.5
FeSO4.7H2O                 27.8
Na2.EDTA.2H2O              37.3
烟酸                          0.5
盐酸吡哆醇                    0.5
盐酸硫胺素                    1.0
蔗糖                          2％w/v
pH5.6～5.8
(2)按本发明的培养基配方组成，见表1，配制培养基，用pH计测定pH值，并用1N的HCl及1N的NaOH调节培养基pH值在5.6-5.8范围内，培养基须加入0.8％的琼脂，然后分装于培养瓶中，每瓶50～60ml，进行高压灭菌，压力为1.0-1.2Kg/cm2，时间为15-25分钟；
(3)选择生长良好、色泽深绿、大小适中的茎尖为种源，在超净工作台中接种于以上准备好的固体培养基中进行培养，接种量，以鲜茎尖重计，为每瓶3g，接种后的培养瓶放入培养室中培养，培养条件为：光照1500-2500lux，温度20～28℃，每2月继代一次；
(4)继代培养时，进行选优，去除颜色发黄，生长不良的的茎尖，选择优良茎尖继续培养，一旦发现整体生长延缓，有效成分含量降低，则从野生铁皮石斛重新选育；
(5)大规模培养时，选择生长良好的种子茎尖，按每瓶4g，以鲜茎尖重计接种，接种后移入培养温室中进行培养，应用自然光照，光线太强时，用遮阳网遮阴，温度不足20℃时采用光照加温，措施，待培养液用完时，根据长势终止培养或补液继续培养。
具体实施方式
实施例1：用于大规模培养种子茎尖的培养
(1)按本发明的培养基配方组成(见表1)，配制培养基。用pH计测定pH值，并用1N的HCl及1N的NaOH调节培养基pH值在5.6-5.8范围内，种子培养基须加入0.8％的琼脂。然后分装于培养瓶中，每瓶50～60ml，进行高压灭菌，压力为1.0-1.2Kg/cm2，时间为15-25分钟。
(2)选择生长良好、色泽深绿、大小适中的茎尖为种源，在超净工作台中接种于以上准备好的固体培养基中进行培养，接种量(以鲜重计)为每瓶3g。接种后的培养瓶放入培养室中的培养，培养条件为：光照1500-2500lux，温度20～28℃，每2月继代一次。
(3)继代培养时，进行选优，祛除颜色发黄，生长不良的的茎尖，选择优良茎尖继续培养，一旦发现整体生长延缓，有效成分含量降低，则从野生铁皮石斛重新选育。
铁皮石斛茎尖的主要有效成分与野生铁皮石斛的比较：
(1)经测定，铁皮石斛培养茎尖的总生物碱含量达261.3μg/gD.W.，远高于野生铁皮石斛160.0μg/gD.W.。
(2)总多糖含量与野生铁皮石斛相当，分别为119.9mg/gD.W.和122.4mg/gD.W.。
(3)茎尖主要氨基酸含量(中国科学院上海有机化学研究所测定)均是野生铁皮石斛(中国科学院上海有机化学研究所测定)的2-5倍。
(4)主要元素含量(由上海交通大学分析测试中心测定)除大量元素茎尖较高外，微量元素无显著差异。
(5)另外我们做了matK基因的序列比较，发现培养茎尖与野生铁皮石斛该基因同源性为99％，继代培养5年的茎尖与新诱导的茎尖的同源性为100％。
实施例2：铁皮石斛茎尖的大规模培养
(1)按本发明的培养基配方组成(见表1)，配制培养基。用pH计测定pH值，并用1N的HCl及1N的NaOH调节培养基pH值在5.6-5.8范围内，装入自制的带有吸水绵的培养瓶中，每瓶50～60ml，进行高压灭菌，压力为1.0-1.2Kg/cm2，时间为15-25分钟。
(2)选择生长良好的种子茎尖，按每瓶4g(以鲜重计)接种，接种后移入培养温室中进行培养，应用自然光照，光照太强时，用遮阳网遮阴，温度不足20℃时采用光照加温措施。待培养液用完时，根据长势终止培养或补液继续培养。一般3月为一个周期，每瓶可产干铁皮石斛茎尖2g，500平方米的一个温室，可年产铁皮石斛茎尖干重400Kg以上。
培养茎尖与野生铁皮石斛免疫作用比较：
1.实验材料
1.1药品与试剂
野生铁皮石斛：
Dendrobium officinale，由上海中医药大学中药研究所提供(经上海市药检所包雪声教授鉴定)。
用前经两次水煎，浓缩至0.3g干品/ml浓度的水煎液，备用。用时用蒸馏水稀释至所需浓度。
铁皮石斛培养茎尖由上海中医药大学中药研究所培养。用前经水煎制成水煎液，方法同前。
(以下药品剂量均以干品重量为单位)
环磷酰胺：
上海华联制药有限公司产品，批号991002。临用前用蒸馏水稀释成5mg/ml的环磷酰胺药液。
植物血球凝集素(PHA)：
上海伊华医学科技有限公司产品，批号010101。临用前配成2mg/ml的药液。
瑞氏染色液：
瑞氏色素为上海试剂三厂产品，批号930325。临用前用甲醇配制。
1.2仪器
752紫外光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂制造，编号9005034。
显微镜：日本OLYMPUS产品，编号405259。
1.3动物
清洁级昆明种小鼠，雌雄皆用，由上海中医药大学实验动物中心提供，合格证号：医动字第02-24-3号。
2.实验方法
2.1对白细胞数和胸腺、脾重量的影响
取18-22g健康昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为6组，用药组小鼠每天按0.1ml/10g体重的容量分别灌胃给予不同剂量的石斛水煎液及石斛培养茎尖水煎液，正常组、模型组小鼠每天分别灌胃给予同容量的生理盐水，每天1次，连续9天。除正常组外，其它各组小鼠于给药的第3、7天分别腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，正常组小鼠同时注射等容量的生理盐水。末次给药1.5小时后，小鼠眼眶取血，测定白细胞数，并称量胸腺、脾脏重量，按文献[1]法计算脏器指数。结果显示，石斛培养茎尖可升高环磷酰胺模型小鼠的白细胞数，与等剂量的原药材石斛相比较，有显著性差异；可增加模型小鼠免疫器官：胸腺和脾的重量，与等剂量原药材石斛相比较，无明显差异，详见表2。
                  表2石斛培养茎尖对白细胞数和胸腺、脾重量的影响
                                                              免疫器官指数
组别         剂量   动物数      白细胞数
                                                        (X±SD，mg/10g体重)
            (g/kg)    (n)       (109个/L)
                                                       脾脏            胸腺
正常组                10      4155±670.18**       67.98±8.14**    40.41±7.99**
模型组                10      1385±502.25         31.03±5.27      17.72±4.35
石斛组      0.75      10      2215±662.09**       33.69±4.77      20.63±8.56
            1.5       10      2180±487.74**       34.06±9.28      22.64±8.15
石斛培养    0.75      10      2955±618.44**##    38.36±9.52*     20.60±6.92
茎尖组      1.5       10      3045±767.20**##    32.62±4.17      25.16±5.97**
注：与模型组比较*p＜0.05有显著性差异，**p＜0.01有极显著性差异与等剂量的石斛比较，#p＜0.05有显著性差异，##p＜0.01有极显著性差异。
2.2对小鼠碳粒廓清速度的影响
取18-22g健康昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为6组，用药组小鼠每天按0.1ml/10g体重的容量分别灌胃给予不同剂量的石斛水煎液及石斛培养茎尖水煎液，正常组、模型组小鼠每天分别灌胃给予同容量的生理盐水，每天1次，连续9天。除正常组外，其它各组小鼠于给药的第3、7天分别腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，正常组小鼠同时注射等容量的生理盐水。末次给药1.5小时后，各组小鼠尾静脉注射含20％印度墨汁的生理盐水0.1ml/10g体重，于注射后2分钟、20分钟时分别用吸管眼眶取血20ul，溶于2ml 0.1％碳酸钠溶液中，摇匀，于波长660nm处比色，测定光密度OD值，按文献[1]法计算廓清指数K。结果显示，石斛培养茎尖可明显对抗环磷酰胺使小鼠碳廓清率降低的作用，与等剂量的原药材石斛相比较，无明显差异，详见表3。
    表3石斛培养茎尖对小鼠碳粒廓清速度的影响
                   剂量   动物数       廓清指数K
组别
                  (g/kg)    (n)         (X±SD)
正常组                      10       0.025±0.006*
模型组                      10       0.018±0.009
石斛组             1.5      10       0.028±0.007*
                   3.0      10       0.027±0.014*
石斛培养茎尖       1.5      10       0.026±0.015
组                 3.0      10       0.030±0.013
注：与模型组比较*p＜0.05有显著性差异，**p＜0.01有极显著性差异
2.3对小鼠淋巴细胞转化反应的影响
取18-22g健康昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为6组，用药组小鼠每天按0.1ml/10g体重的容量分别灌胃给予不同剂量的石斛水煎液及石斛培养茎尖水煎液，正常组、模型组小鼠每天分别灌胃给予同容量的生理盐水，每天1次，连续10天。除正常组外，其它各组小鼠于给药的第3、7天分别腹腔注射环磷酰胺60mg/kg，正常组小鼠同时注射等容量的生理盐水。各组小鼠在第6、7、8天每天肌肉注射PHA 10mg/kg。未次给药1.5小时后，断尾取血，涂片，瑞氏染色，油镜下计数100个淋巴细胞、淋巴母细胞及过渡态淋巴细胞数，按文献[1]法计算淋巴细胞转化百分率。结果显示，石斛培养茎尖对环磷酰胺模型小鼠的淋巴细胞转化反应有明显的促进作用，与等剂量的原药材石斛相比较，1.5g/kg体重剂量组有显著性差异，3.0g/kg体重剂量组无明显差异，详见表4。
  表4  石斛培养茎尖对小鼠淋巴细胞转化反应的影响
                 剂量    动物数    淋巴细胞转化率
组别
                (g/kg)    (n)        (X±SD％)
正常组                    15        44.6±7.23**
模型组                    15        33.47±5.87
石斛组           1.5      15        41.6±5.41**
                 3.0      15        48.13±6.32**
石斛培养茎尖     1.5      15        48.8±8.69**##
组               3.0      15        50.0±7.90**
注：与模型组比较*p＜0.05有显著性差异，**p＜0.01有极显著性差异与等剂量的石斛比较，#p＜0.05有显著性差异，##p＜0.01有极显著性差异。
3.小结
本实验围绕免疫作用，对铁皮石斛培养茎尖与野生铁皮石斛进行初步比较，结果显示，铁皮石斛培养茎尖有升高环磷酰胺模型小鼠外周白细胞数，增加模型鼠胸腺或脾脏指数，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进体内淋巴细胞的转化。实验表明该药能提高机体非特异性免疫功能和细胞免疫功能。这一作用与野生铁皮石斛相同。

Claims (1)

1.一种应用铁皮石斛激素自养型茎尖培养药材的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)按配方配制培养基
                             生长培养基mg/L
(NH4)2SO4                 450
KNO3                         2800
CaCl22H2O.                 150
MgSO47H2O                  200
KH2PO4                     420
KI                            0.8
H3BO3                      1.5
MnSO4.4H2O                 5
ZnSO4.7H2O                 1.5
FeSO4.7H2O                 27.8
Na2.EDTA.2H2O              37.3
烟酸                          0.5
盐酸吡哆醇                    0.5
盐酸硫胺素                    1.0
蔗糖                          2％w/v
pH                            5.6～5.8
(2)用pH计测定配制的培养基pH值，并用1N的HCl及1N的NaOH调节培养基pH值在5.6-5.8范围内，培养基须加入0.8％的琼脂，然后分装于培养瓶中，每瓶50～60ml，进行高压灭菌，压力为1.0-1.2Kg/cm2，时间为15-25分钟；
(3)选择生长良好、色泽深绿、大小适中的茎尖为种源，在超净工作台中接种于以上准备好的固体培养基中进行培养，接种量，以鲜茎尖重计，为每瓶3g，接种后的培养瓶放入培养室中培养，培养条件为：光照1500-2500lux，温度20～28℃，每2月继代一次；
(4)继代培养时，进行选优，去除颜色发黄，生长不良的的茎尖，选择优良茎尖继续培养，一旦发现整体生长延缓，有效成分含量降低，则从野生铁皮石斛重新选育；
(5)大规模培养时，选择生长良好的种子茎尖，按每瓶4g，以鲜茎尖重计接种，接种后移入培养温室中进行培养，应用自然光照，光线太强时，用遮阳网遮阴，温度不足20℃时采用光照加温措施，待培养液用完时，根据长势终止培养或补液继续培养。
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