CN101057559A - 芸香科花椒属植物单面针的人工快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及芸香科花椒属植物单面针的人工快速繁殖方法，该方法采用组培培养技术，将单面针离体胚消毒后经初代培养，继代培养、壮苗及生根培养获得了大量的组培苗，经炼苗后移栽可实现单面针快速繁殖，特别是本发明针对单面针组织培养设计了一系列培养基，大大提高了离体胚的发芽率以及组培苗的繁殖系数和生根率。由于中成药对单面针药材用量不断增长，而单面针的自然繁殖率低下，生长也较为缓慢，使野生单面针药材资源日益枯竭，供不应求。本发明方法简便易行，培养基成分配方独特，操作可行，推广应用该方法可实现单面针人工快速育苗，满足市场上对于单面针药材的需求。

Description

芸香科花椒属植物单面针的人工快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体的说，涉及芸香科花椒属植物单面针的人工快速繁殖方法。

背景技术

单面针(Zanthoxylum Dissitum Hemsl)又名蚬壳花椒、山枇杷、大叶花椒、蚌壳花椒等，属芸香科花椒属常绿攀援或蔓生木质藤本灌木。根、茎及叶均可入药，临床上有祛风活络、散瘀止痛、解毒消肿之功效，主治牙痛、腰痛、妇女月经过多，产后月经不调等症；民间用于治疗腰腿疼痛、关节疼痛、跌打损伤等症。主要分布于我国西南、广东、广西、湖南、湖北、陕西等地，在湖南省主要分布于湘西，近年来，由于中成药生产规模日趋扩大，而单面针的自然繁殖率低下，生长也较为缓慢，致使该天然资源日趋贫乏，供不应求，并逐渐威胁着相关药厂的正常生产。因此，寻求适宜的人工繁殖途径，迅速扩大单面针资源供给已势在必行。

发明内容

本发明的目的是提供一种芸香科花椒属植物单面针的人工快速繁殖方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种芸香科花椒属植物单面针的人工快速繁殖方法，包括如下步骤：将单面针离体胚经初代培养后，依次进行继代培养、壮苗及生根培养和炼苗及移栽。

所述初代培养优选以MS固体培养基培养40-60天，培养基中添加浓度为1～5mg/L的细胞分裂素和浓度为0.1～0.6mg/L的生长素，其中，所述细胞分裂素为6-BA或者KT，所述生长素为NAA或者IBA；所述细胞分裂素更优选为6-BA，浓度为1mg/L；所述生长素更优选为NAA，浓度为0.4mg/L。

所述继代培养优选以MS、WPM、B₅或White培养基，培养温度23～27℃，光强度30～40μmol·m^-2·s^-1，光照时间12h·d^-1，培养40-60天，培养基中添加浓度为0.1～5mg/L的细胞分裂素和浓度为0.01～1.0mg/L的生长素，其中，所述细胞分裂素为6-苄基腺嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、玉米素(ZT)、氯吡苯脲(CPPU)或者噻二唑苯基脲(TDZ)，所述生长素为萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)或者吲哚丁酸(IBA)，所述继代培养更优选以MS培养基培养。

所述壮苗及生根培养优选为以壮苗培养基：MS+ZT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L进行壮苗培养后，以1/2MS、1/2WPM、1/2B₅或1/2White培养基生根培养，培养温度23～27℃，光强度30～40μmol·m^-2·s^-1，光照时间12h·d^-1，培养30-40天，培养基中添加浓度为0.1～5mg/L的细胞分裂素和浓度为0.01～1.0mg/L的生长素，其中，所述细胞分裂素为6-BA、KT、ZT、CPPU或者TDZ，所述生长素为NAA、IAA或者IBA，更优选为以壮苗培养基：MS+ZT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L进行壮苗培养后，以1/4MS并添加IBA 0.3mg/L和NAA 0.05mg/L生根培养。

其中在离体胚培养实验中，对培养基在自动电热压力蒸汽灭菌锅中消毒25分钟，用HgCl₂对离体胚进行消毒。

该单面针的人工快速繁殖方法，简便易行，操作可行，能有效地使单面针较野生的更快生长繁殖，从而提高单面针药材的产量，扩大来源，可满足市场上对于单面针药材的需求。

附图说明

图1是离体胚初代培养20天后的生长情况，培养基中NAA水平为0.4mg/L；

图2是离体胚初代培养20天后的生长情况，培养基中NAA水平为0.2mg/L。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1初代培养(无菌体系的建立)

1.初代培养(无菌体系的建立)

1.1材料选择：用解剖刀切破种壳，从胚囊中取出胚，然后用70％酒精进行消毒，再用0.1％氯化汞进行表面消毒，用无菌水漂洗3～4次，再用无菌滤纸或纱布吸干备用。

1.2培养基的制备：根据培养的配方制备MS培养基，调pH值为5.8～6.0，用50mL三角瓶分装，置于LDZX-40II型自动电热压力蒸汽灭菌锅，于1.06kg/cm²的压力下121℃消毒25分钟。(常规制备)

1.3不同激素及浓度对离体胚培养的影响

实验采用单面针离体胚做外植物，用MS固体培养基进行培养，在培养基中添加不同种类与浓度的细胞分裂素和生长素，观察离体胚的发芽率，实验结果见表1～3。从表1和表2的对比中可以看出，当保持NAA(奈乙酸)浓度一致，以6-BA(6-苄氨基嘌呤)作为激素时平均发芽率为48％，最高发芽率为65％。用KT(细胞分裂素)作为胚培养激素时平均发芽率只有39.2％，最高发芽率是60％。并且各浓度的6-BA对芽的诱导率都要比相应浓度的KT的高，说明各浓度的6-BA对发芽率的影响要比KT的效果更为明显。当每组6-BA的浓度保持一致时，取相同浓度的生长素NAA、IBA(吲哚丁酸)作对比实验，从表1和表3的比较分析同样可以得出NAA对发芽率的诱导要比IBA的效果好，因此在单面针离体胚培养过程中选用6-BA和NAA作为单面针离体胚培养激素是比较合适的。

                  表1 6-BA与NAA的组合

培养基	6-BA(mg/L)	NAA(mg/L)	接种数	发芽率
					MSMSMSMS	0112	00.10.20.1	30303030	10％23％65％50％

MS

2

0.2

30

54％

                  表2 KT与NAA的组合

培养基	KT(mg/L)	NAA(mg/L)	接种数	发芽率
					MSMSMSMS	1122	0.10.20.10.2	30303030	20.0％60.0％40.0％36.7％

                    表3 6-BA与IBA的组合

培养基	6-BA(mg/L)	IBA(mg/L)	接种数	发芽率
					MSMSMSMS	1122	0.10.20.10.2	30303030	16.7％46.7％50.0％23.3％

1.4最佳初代培养方案的确定

实验选择6-BA、NAA、消毒时间(Time)因素3个，每个因素3水平，选用L₉(3³)正交表做正交实验，并对实验数据用SPSS统计软件进行方差分析，同时用LSD法对每因素各水平之间进行多重比较。采用MS琼脂培养基(含7.5g/L琼脂，20g/L蔗糖，pH5.8)于25±1℃，2000lx光照培养，15d后统计发芽率，实验结果见表4、5。

                            表4 正交实验结果和直观分析

实验序号	因素A	因素B	因素C	D	实验结果
								水平号6-BA(mg/L)	水平号NAA(mg/L)	水平号消毒时间	空白列水平号	接种数	发芽数	发芽率
	123456789	1     11     11     12     32     32     33     53     53     5	1     0.22     0.43     0.61     0.22     0.43     0.61     0.22     0.43     0.6	1     62     83     102     83     101     63     101     62     8	123312231	303030303030303030	2026161718713155								66.6％86.6％53.3％56.6％60.6％23.3％43.3％30.3％16.6％
K1K2K3								2.06671.40340.9	1.67011.76670.9333	1.21.60351.5666	1.43341.53331.4034	T＝4.3701
	K1K2K3	0.68890.46780.3	0.55670.58890.3111	0.40.53450.5222	0.47780.51110.4678
R									1.1667	0.8334	0.4035	0.1299

                        表5 L₉(3⁴)实验结果方差分析

变异来源	离差平方和(SS)	自由度(df)	均方差(MS)	均方比(F)	概值
						因素A因素B因素C误差	0.2280.1390.0330.003	2222	0.1140.06900170.002	73.90144.63610.736	0.0130.0220.085

通过对表4数据的直观分析得出各因素内各水平之间的极差(R)的大小，极差的大小反映了该因素的影响程度，极差大的因素对实验结果的影响大，从R的大小可知对发芽率影响因素的主次依次是：6-BA＞NAA＞消毒时间(T，分钟)，从表4还可得出各因素的最优水平组合为A₁B₂C₂，即6-BA取1mg/L，NAA取0.4mg/L，消毒时间8分钟。最优水平组合A₁B₂C₂与正交实验中实验序号2的结果是一致的，该组合对离体胚培养的发芽率可达86.6％。

方差分析的结果表5说明：因素A(6-BA)和因素(NAA)对胚的发芽率影响显著(P≤0.05)，因素C各水平之间无显著差异。由此可知在单面针的离体胚培养过程中，要得到较高的发芽率，应当选用1mg/L的6-BA，生长素NAA浓度选用0.2或0.4mg/L对实验影响不大，消毒时间6、8、10分钟对实验结果影响不明显。

从正交实验的方差分析可知，生长素NAA浓度在0.2～0.4mg/L范围都是较适合胚的生长的，但从苗的生长速度来看，NAA为0.44mg/L时生长较好(见图1、2)，因而激素NAA选用0.4mg/L较为适合。

综合对正交实验的直观分析和方差分析结果，为了得到单面针胚培养较高的发芽率，6-BA、NAA、消毒时间三因素的最佳水平组合为：A₁B₂C₂，即：MS+6-BA 1mg/L，NAA取0.4mg/L，消毒时间8分钟。

实施例2继代培养(组培苗的增殖培养)

1.1培养基的制备(常规制备)

基本培养基MS、WPM、B₅、White四种，附加成分BA、ZT、KT、CPPU、NAA、IAA、IBA添加物等，pH值为5.8～6.2，琼脂7.5g/L，蔗糖浓度30g/L，附加成分按细胞分裂素与生长素不同的配比加入基本培养基中。培养基用300mL的广口瓶分装，每瓶30mL封口膜包扎，在121℃于1.1kg/cm²的条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌21分钟。

1.2实验材料

将单面针离体培培养出的无菌苗作为外植体，将带顶芽不带腋芽的单芽无菌苗切成长度为1～1.5cm，接种到培养基中进行继代培养，增殖培养为30d。

1.3不同基本培养基对组培苗增殖的影响

设计MS、WPM、B₅、White四种培养基，分别添加6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L。单因素试验设计，4次重复，每个重复中各处理接种5瓶，继代培养时每瓶接种5各条件基本一致的外植体，培养30d，观察其生产情况，苗木的叶色及生长是否正常，并统计组培苗增殖系数。(增殖系数＝总芽数/接种芽数)

试验结果见表6，经方差分析，不同基本培养基因素F＝370.237，P(sig.＝0.000)＜0.01，说明不同的培养基对组培苗增殖的影响极显著。用WPM处理的不定芽，增殖系数最高，达到2.5，但是生长不正常，长势差，苗细长，叶微黄。用MS培养基的不定芽，增殖系数较高达到2.3，瓶苗生产健壮，茎节间长，粗壮，叶色较绿。White与B₅培养基的增殖系数很低，不宜作为基本培养基。因此，MS培养基为增殖的最适基本培养基。

            表6 不同基本培养基对组培苗增殖影响

基本培养基	长势	叶色	愈伤组织	增殖系数
					MSWPMB5White	较好不好不好不好	绿微黄黄黄	少少多多	2.3a2.4b1.3c1.1d

1.4不同细胞分裂素对组培苗增殖的影响

以MS为基本培养基，分别添加6-BA、ZT、KT、CPPU、TDZ浓度为1.0mg/L。单因素试验设计，4次重复，每个重复中各处理接种5瓶，继代培养时每瓶接种5个条件基本一致的外植体培养30d，观察长势、叶色，并统计出增殖系数等。

不同细胞分裂素对组培苗增殖的影响试验结果见表7，这5种细胞分裂素对单面针组培苗的长势、叶色、高度等差异不大，所以仅对增殖系数数据进行分析。经方差分析，不同的细胞分裂素对增殖的影响差异显著F＝139.724，P(sig.＝0.000)＜0.01，见表8。6-BA与ZT没有显著差异，但是与KT、CPPU、TDZ存在显著差异。6-BA与ZT处理的不定芽增殖系数高，从提高增殖系数与降低生产成本两方面综合考虑，选择6-BA作为单面针组培苗增殖的细胞分类素。

            表7 不同细胞分裂素对组培苗增殖影响

细胞分裂素	6-BA	KT	ZT	CPPU	TDZ
						增殖系数	2.6a	1.4b	2.7a	1.2b	1.3b

        表8 不同细胞分裂素对组培苗增殖影响的方差分析

变异来源	平方和	自由度	方差	F值	P值
						细胞分裂素误差总和	41.247.0148.250	49599	10.13	20.87	0.00

采用Duncan新复极差法进行平均数比较，同一栏内不同小写字母表示在P＜0.05水平不同处理之间存在显著差异，以下相同。

1.5 6-BA浓度对组培苗增殖的影响

以MS为基本培养基，分别设置6-BA 0.0、0.5、1.0、2.0、5.0mg/L五种浓度，附加NAA 0.1mg/L，蔗糖浓度30g/L，探讨6-BA对组培苗增殖的影响。单因素试验设计，4次重复，每个重复中各处理接种5瓶，继代培养时每瓶接种5个条件基本一致的外植体，培养30d。观察生产情况，统计增殖系数。

不同6-BA浓度对组培苗增殖的影响试验结果见表9。方差分析结果表明，不同浓度的6-BA对组培苗增殖有显著影响，并对试验数据进行曲线估计和回归分析，得曲线估计中拟合度最高得为二次函数，决定系数R²＝0.43，增殖系数得回归方程为：y＝5.05+5.7x-0.94x²，相关系数r＝0.63(F检验得概率P＝0.00，P＜0.01)，随着6-BA浓度的升高，二者的变化曲线呈抛物线状。但是从表9可以看出，随着6-BA浓度的升高，单面针组苗生长高度在下降，由于6-BA浓度的升高，有利于增殖不利于苗长高。综合苗高与增殖系数两个因素考虑，6-BA适合浓度为0.5～1.0mg/L。

        表9 6-BA浓度对不定芽增殖的影响的试验结果

6-BAmg/L	0.0	0.5	1.0	2.0	5.0
						增殖系数生长高度(cm)	1.460.6	2.542.3	2.562.0	2.691.2	2.511.0

1.6不同生长素对组培苗增殖的影响

在以上筛选出的基本培养基MS、细胞分裂素6-BA 0.5mg/L基础上，分别添加生长素IBA、IAA、NAA附加浓度为1.0mg/L、蔗糖浓度为30g/L，单因素试验设计，4次重复，每个重复中各处理接种5瓶，继代培养时每瓶接种5个条件基本一致的外植体，培养30d。观察生长情况，统计增殖系数。

不同种类的生长素对组培苗增殖的影响试验结果见表10。经方差分析F＝122.81，P(sig.＝0.000)＜0.01，不同细胞生长素对增殖的影响显著。生长素NAA诱导不定芽产生的愈伤组织少。增殖系数高，叶色正常，长势好。IBA与IAA诱导的不定芽产生愈伤组织、增殖系数低，并且叶色发黄。所以，选择NAA为单面针组培苗增殖的细胞生长素。

            表10 生长素种类对不定芽增殖的影响

生长素种类	长势	叶色	愈伤组织	增殖系数
					NAAIBAIAA	较好不好不好	绿微黄黄	少少多	2.3a1.7b1.3c

1.7生长素浓度对不定芽增殖的影响

MS+6-BA 0.5mg/L，分别添加不同浓度的NAA，浓度设为0.0(对照CK)、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0mg/L。蔗糖浓度为30g/L。单因素试验设计，，4次重复，每个重复中各处理接种5瓶，继代培养时每瓶接种5个条件基本一致的外植体，培养30d。观察生长情况，统计增殖系数。

不同生长素浓度对组培苗增殖的影响试验结果见表11，对试验数据进行曲线估计与回归分析，曲线估计分析中二次函数的决定系数R²＝0.144，增殖系数得回归方程为：y＝2.77x²+11.3x-7.5，相关系数r＝-0.57。这表明生长素浓度对单面针组织培养的增殖效果与不定芽生长的影响显著。当NAA浓度高于0.1mg/L，不定芽的平均长度小于2.0cm，说明低浓度(0.05～0.1mg/L)的NAA比较适合单面针组培苗的增殖与生长，瓶苗的生长势好，粗壮，挺拔，茎长，叶色翠绿；浓度过高，则诱导更多的愈伤组织形成，反而抑制了组培苗的生长和增殖。

                    表11 生长素浓度对不定芽增殖的影响

NAAmg/L	0.0	0.05	0.1	0.3	0.5	1.0
							增殖系数不定芽长度(cm)	1.801.86	2.682.79	2.732.07	1.921.80	1.871.84	1.931.55

1.8生物素浓度对不定芽增殖的影响

MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L培养基中附加生物素浓度分别为0.0(对照CK)、1.0、2.0、5.0mg/L，蔗糖浓度为30g/L。观察生长情况，统计增殖系数。

生物素浓度对组培苗增殖的影响试验结果见表12。经方差分析表明生物素浓度对组培苗的增殖率和不定芽的生长的影响极显著，说明在单面针增殖培养基中，适当的加入添加物有利于组培苗的增殖和生长。多重比较结果表明，在培养基中加入生物素比对照的增殖系数和生长量都极显著增加，但生物素不同浓度的处理之间没有明显差异。从节约成本考虑，选择1.0mg/L浓度的生长素比较适合单面针增殖的培养。

              表12 添加物浓度对组培增殖的影响

生物素浓度mg/L	0.0	1.0	2.0	5.0
					增殖系数不定芽长度(cm)	2.5a2.00b	3.5a2.68a	3.61a2.5a	3.7a2.6a

1.9适宜继代培养基的筛选

在以上选出的基本培养基、生长素及其浓度范围的基础上，进行分裂素、生长素及生物素浓度配比试验。设计正交实验L₉(3³)，因素A为6-BA(0.5、1.0、1.5mg/L)，因素B为NAA(0.05、0.1、0.3mg/L)，因素C为生物素(1.0、2.0、5.0mg/L)。各因子均分为3个水平，共九个处理，每个处理接种25个从芽，试验重复3次。30d后统计增殖系数，并进行方差分析。

正交试验结果见表13。因素A(6-BA)，F＝936.42，P(sig.＝0.000)＜0.01，认为激素6-BA对单面针组培苗诱导增殖有显著差异，增殖系数大小为：浓度0.5mg/L＞1mg/L＞1.5mg/L。因素B为NAA浓度，F＝184.79，P(sig.＝0.000)＜0.01，认为NAA浓度对单面针组培苗诱导增殖有显著差异，增殖系数大小为：浓度0.05mg/L＞0.1mg/L＞0.15mg/L。因素C为生物素的浓度，F＝21.06，P(sig.＝0.000)＜0.01，认为生物素浓度对单面针组培苗诱导增殖有显著差异，增殖系数大小为：浓度1mg/L＞2mg/L＞3mg/L。其影响顺序为：η²(6-BA)(0.995)＞η²(NAA浓度)(0.976)＞η²(生物素)(0.824)，方差分析最优组合的结果为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.04mg/L+生物素1.0mg/L。

            表13 适宜继代培养基的正交试验筛选结果

实验号	因素A	因素B	因素C	实验结果
					6-BA(mg/L)	NAA(mg/L)	添加物	增殖系数
	123456789	0.50.50.51111.51.51.5	0.050.10.150.050.10.150.050.10.15	1.02.05.05.01.02.02.05.01.0					3.93.63.12.92.82.62.82.72.5

1.10培养条件

全部培养过程在控温培养室中进行。培养温度25±2℃，光强度30～40μmol·m^-2·s^-1，光照时间12h·d^-1。

实施例3壮苗及生根培养

生根培养前须进行壮苗培养。壮苗培养基：MS+ZT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L。

1.1基本培养基对组培苗生根的影响

基本培养基为1/2MS、1/2WPM、1/2B5、1/2White，分别添加IBA1.0mg/L，选择生长健壮的组培苗接种于四种培养基中，共5个处理，每个处理接种25个丛芽，试验重复3次。30d后统计生根率，取平均值，进行单因子分析。

单个丛芽接种到附件IBA 1.0mg/L的4种不同基本培养基上15～20d后，在各培养基上均可见丛芽切口处产生保色的愈伤组织，但尚未分化不定根。随着诱导时间的延长，逐渐有不定根形成。试验结果经方差分析表明(表14)：不同基本培养基对组培苗生根有显著影响，接种在1/2MS培养基上的组培苗生根率达64％，并且叶色正常，长势好。其次为1/2WPM生根率30％，但是生产基本正常，但1/2B5与1/2White培养基生根率低于20％，叶色发黄。因此，最佳基本培养基为1/2MS。

           表14 不同基本培养基蚬壳花椒组培苗生根影响的试验结果

培养基	接种丛芽数(个)	生根丛芽数(个)	生根率(％)
				1/2MS+IBA 1.0mg/L1/2WPM+IBA 1.0mg/L1/2B5+IBA 1.0mg/L1/2White+IBA 1.0mg/L	75757575	4823811	64a30b10c14c

1.2生长素种类对组培苗生根的影响试验

以优化的生根基本培养基为基础，分别添加2.0mg/L的IBA、NAA、IAA，共3个处理，每个处理接种25个丛芽，试验重复3次。30d后统计生根率、平均根数，取平均值，进行单因子分析。

将组培苗接种到2.0mg/L的IBA、NAA、IAA的1/2MS培养基上，培养30d后，经方差分析结果表明(表15)，不同生长素对单面针组培苗生根的影响极显著，从表2可以看出，2.0mg/L的IBA处理生根率最高可达70％，而经过NAA处理的组培苗，茎基部形成较多的愈伤组织，叶色发黄，掉叶，而IBA处理的组培苗叶色浓绿，IAA处理的组培苗生根率低、苗长势弱。因此，诱导单面针组培苗生根的最适宜的生产素为IBA，其次为NAA，IAA不适用于单面针组培苗生根。

            表15 不同生长素对蚬壳花椒细培苗生根的影响

培养基	接种丛芽数(个)	生根丛芽数(个)	平均根数(个)	生根率(％)
					1/2MS+IBA 2.0mg/L1/2MS+NAA 2.0mg/L1/2MS+IAA 2.0mg/L	757575	555025	544	73.6％67.6％33.2％

1.3IBA浓度对组培苗生根的影响

以优化的生根基本培养基为基础，分别添加0.1、0.5、1.0、1.5mg/LIBA，共4个处理，每个处理接种25个丛芽，试验重复3次。30d后统计生根率、平均根数，取平均值，进行单因子分析。

方差分析结果表明(表16)，不同浓度的IBA对组培苗生根有显著影响，并对试验数据进行曲线估计与回归分析，曲线估计分析中二次函数的决定系数R²＝9556，生根率的回归方程为：y＝26.67+22.3x-22.80x²，相关系数r＝-0.78^*(F检验的概率P.＝0.02，P＜0.05)，随着IBA浓度的升高，二者的变化曲线呈抛物线状。对回归方程求一阶导数并令其等于零，求解极值点，可得出生根率取得极大值时的IBA浓度为0.5mg/L。

                    表16 IBA浓度对组培苗生根的影响结果

培养基	接种丛芽数(个)	生根丛芽数(个)	平均根数(个)	生根率(％)
					1/2MS+IBA 0.1mg/L1/2MS+IBA 0.5mg/L1/2MS+IBA 1.0mg/L1/2MS+IBA 1.5mg/L L	75757575	21363839	2234	28.0％48.0％51.6％53.0％

1.4NAA浓度对组培苗生根的影响

                    表17 NAA浓度对组培苗生根的影响

培养基	接种从芽数(个)	生根从芽数(个)	平均根数(个)	生根率(％)
					1/2MS+NAA 0.1mg/L1/2MS+NAA 0.5mg/L1/2MS+NAA 1.0mg/L1/2MS+NAA 1.5mg/LL	75757575	41444751	33.53.94	55.0d59.0c62.0b68.0a

试验结果见表17，并对试验数据进行曲线估计与回归分析，回归方程为：y＝54.07+8.94x，相关系数r＝0.95^*(F检验的概率P.＝0.006，P＜0.01)，NAA浓度对组培苗生根的影响极显著，曲线估计为直线。试验结果表明，当NAA浓度过高时会产生愈伤组织，而后在愈伤组织上诱导出不定根，当浓度高于0.1mg/L时会出现愈伤组织，浓度越高愈伤组织越多，虽然生根率随NAA浓度的升高而增加，但是出现了黄叶、掉叶的现象，有的甚至死亡。因此，NAA的浓度不应高于0.1mg/L。

1.5最佳生根培养基的筛选试验

在以上选出的基本培养基、生长素及其浓度范围的基础上，进行基本培养基种的大量元素与微量元素，生长素种类与浓度配比试验。设计正交实验L₉(3³)，因素A为MS(1/2MS、1/3MS、1/4MS)，因素B为IBA(0.3、0.5、0.7mg/L)，因素C为NAA(0、0.05、0.07)。各因子均分为3个水平，共九个处理，每个处理接种25个从芽，试验重复3次。30d后统计生根率、平均根数，取平均值，并进行方差分析。

正交试验结果与分析见表18、19。因素A(基本培养基)，F＝571.89，P(sig.＝0.000)＜0.01，认为基本培养基对单面针组培苗生根有显著差异，增殖系数大小为：1/4MS＞1/3MS＞1/2MS。因素B为IBA浓度，F＝3.63，P(sig.＝0.070)＞0.05，认为IBA浓度对单面针组培苗生根没有差异。因素C为NAA浓度，F＝25.72，P(sig.＝0.000)＜0.01，认为NAA浓度对单面针组培苗生根有显著差异，增殖系数大小为：浓度0.05＞0.01＞0。其影响顺序为：η²(基本培养基)(0.992)＞η²(NAA浓度)(0.851)＞η²(IBA浓度)(0.447)，即基本培养基与NAA浓度为主效，IBA浓度对整个正交试验的影响不大，方差分析最优组合的结果为：1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L。

            表18 筛选适宜培养基的正交试验结果

实验号	因素A	因素B	因素C	实验结果
					MS	IBA	NAA	生根率(％)
	123456789	1/2MS1/2MS1/2MS1/3MS1/3MS1/3MS1/4MS1/4MS1/4MS	0.30.50.70.30.50.70.30.50.7	00.010.050.010.0500.0500.01					231734637850535363

                        表19 实验结果方差分析

变异来源	平方和	自由度	均方差	F值	P值	部分η2
							因素A因素B因素C互作误差	0.710.050.0320.0520.06	22229	0.360.0020.160.260.001	571.893.6325.7241.63	0.0000.0700.0000.000	0.9920.4470.8510.902

^*显著水平P＝0.05

1.6培养条件

全部培养过程在控温培养室中进行。培养温度25±2℃，光强度30～40μmol·m^-2·s^-1，光照时间12h·d^-1。

1.7正交试验结果的验证

经过正交试验放分析得出最适培养基1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L与试验中增殖系数最高的培养基1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L进行比较，有3个重复，每个重复接种5瓶。比较结果如表20，分析表明，1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L的生根率(0.70)低于1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L的生根率(0.75)，可能是由于三个正交试验因素存在交互作用，正交试验分析出来的最优组合1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L并不比1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L的生根率高。

                    表20 两种培养基的生根率比较试验结果

培养基	生根时间(天)	苗长高(cm)	根数(个)	生根率(％)
					1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L	1416	0.50.7	43	7570

1.8活性炭对单面针组培苗生根的影响

将单面针组培苗接种到培养基为：1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L，附加活性炭200mg/L，30d后统计结果表明，培养基中添加活性炭对单面针组培苗不定根的诱导并无促进作用，在不添加活性炭的情况下，组培苗生根率能达到78％，而在添加活性炭的条件下，组培苗生根率不足5％。可能是由于活性炭不仅能吸附有害物质，而且也能吸附培养基中的生长素，从而不能发挥诱导生根的作用。

研究结果表明，培养基、生长素的种类及浓度对单面针组培苗生根有较大影响，基本培养基中大量元素含量降低能促进不定根的产生，以1/3为最佳，培养基中单独添加NAA、IBA即可诱导单面针组培苗生根，但试验结果亦表明，生长素NAA与IBA配合使用对蚬壳花椒组培苗的不定根诱导比单独使用效果更佳。

即最佳生根培养基为1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L。一般15～20就会有诱导出根，培养周期40天，组培苗根长约2cm左右即可移栽。

实施例4移栽

1.1基质的调配

选用泥炭土、珍珠岩、糠壳灰、黄泥、细沙等，按比例搭配，泥炭土∶珍珠岩＝1∶3；或糠壳灰∶黄泥∶细沙＝2∶1.5∶1(以上均为体积比)。按以上比例称取基质，混匀，用800倍液百菌清喷湿(消毒)，放置3天后使用，使用前用1000倍液百菌清进行二次消毒，分装到一次性塑料杯中，装入基质体积约为一次性塑料杯体积的1/3。

1.2移栽方法

用镊子将组培苗从培养基中取出放入清水中，用清水轻轻洗净根部残留的培养基，同时将根剪至1cm左右，靠近根部的叶片剪掉。

将修剪好后的单面针在1000倍液的百菌清溶液中浸泡2min，然后取出晾10min方可进行移栽。

取一次性杯子，装入半杯配好的基质，移植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一个小孔，然后将小苗插入(注意幼苗较嫩，防止弄伤)，栽后把苗周围基质压实，栽好后再浇适量的百菌清溶液，浇透为止，保持湿度在80～90％，放入大棚中培养。

1.3培养条件

大棚温度20～30℃，温室内湿试验为80％，每20min喷水一次，生长30～45天后揭膜，光照不能太强，要有良好的通风措施。定期施肥，肥料选用生长中常用的复合肥，浓度为800倍液为宜，每周一次。用此方法成活率能达到95％左右(如发现有病虫害可喷施1000倍液百菌清或瑞毒霉)。

Claims (10)

1、芸香科花椒属植物单面针的人工快速繁殖方法，包括如下步骤：将单面针离体胚初代培养后，依次进行继代培养、壮苗及生根培养和炼苗及移栽。

2、如权利要求1所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述初代培养优选MS固体培养基，培养40-60天，培养基中添加浓度为1～5mg/L的细胞分裂素和浓度为0.1～0.6mg/L的生长素，其中，所述细胞分裂素为6-BA或者KT，所述生长素为NAA或者IBA。

3、如权利要求1或2所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，在初代培养前对离体胚用0.1％氯化汞消毒处理8分钟，并且其中所述的细胞分裂素为6-BA，浓度为1mg/L；所述生长素为NAA，浓度为0.4mg/L。

4、如权利要求1所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述继代培养以MS、WPM、B₅或White培养基，培养温度23～27℃，光强度30～40μmol·m^-2·s^-1，光照时间12h·d^-1，培养40-60天培养基中添加浓度为0.1～5mg/L的细胞分裂素和浓度为0.01～1.0mg/L的生长素，其中，所述细胞分裂素为6-BA、KT、ZT、CPPU或者TDZ，所述生长素为NAA、IAA或者IBA。

5、如权利要求4所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述继代培养使用下述培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.04mg/L+生物素1.0mg/L。

6、如权利要求1所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述壮苗及生根培养为以壮苗培养基：MS、ZT 2.0mg/L和NAA 0.2mg/L进行壮苗培养后，以1/2MS、1/2WPM、1/2B5或1/2White培养基生根培养，培养温度23～27℃，光强度30～40μmol·m^-2·s^-1，光照时间12h·d^-1，培养30-40天，培养基中添加浓度为0.1～5mg/L的细胞分裂素和浓度为0.01～1.0mg/L的生长素，其中，所述细胞分裂素为6-BA、KT、ZT、CPPU或者TDZ，所述生长素为NAA、IAA或者IBA。

7、如权利要求6所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述壮苗及生根培养为以壮苗培养基：MS、ZT 2.0mg/L和NAA 0.2mg/L进行壮苗培养后，以1/4MS并添加IBA 0.3mg/L和NAA 0.05mg/L生根培养。

8、如权利要求1所述的方法，其特征在于，移栽的方法是：取组培苗洗去根部培养基，将根短剪，并去掉靠近根部的叶，消毒，将培养基质上做上与根大小相适应的小孔，将根插入，压实基质，移入大棚培养。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，移入大棚后培养温度控制在20～30℃，湿度控制在80％。

10、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的基质为按体积比1∶3的泥炭土和珍珠岩混合物，或按体积比为2∶1.5∶1的糠壳灰、黄泥和细沙混合物。

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