CN1762208A - 九节茶药材种苗的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
九节茶药材种苗的组培快繁方法，涉及九节茶药材通过生物组培无性繁殖技术获得株性稳定的组培快繁育苗方法。它是通过选取九节茶的带节茎段或顶芽作外植体，进行表面消毒处理；诱导丛生芽的初代培养；增殖培养；生根培养；炼苗和移栽五个步骤完成。本发明具有出苗快，稳定性高，苗壮，种苗品质好、抗性强、生长良好，实用性强等优点。解决了九节茶药材种植的种苗供应，为实现九节茶药材种植的GAP规范化管理提供了保障，也为以九节茶药材为原料的药品生产提供了质量保证。
Description
技术领域
本发明涉及通过组织培养技术的植株再生方法，具体说是涉及九节茶药材通过生物组培无性繁殖技术获得株性稳定的组培快繁育苗方法。
背景技术
九节茶(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)，别名：草珊瑚、接骨莲、竹节草、肿节风。为金粟兰科半灌木，多年生常绿草本或亚灌木，植株高50～120厘米。花期每年6～7月，果期每年8～9月。生于山沟、溪谷林阴湿地，分布于华南、华东、中南、西南。含有药用价值的化学成分，已有开发成功的“清热消炎宁胶囊”就是用九节茶植物为原料制备而成的，具有清热解毒，消炎止痛，舒筋活络的功效。用于流行性感冒，咽喉炎，肺炎，菌痢，急性胃肠炎，阑尾炎，烧伤，疮疡脓肿，蜂窝织炎。随着以九节茶为原料的新药品种的不断开发，对九节茶原料的需求量越来越大，无限制的采挖使野生资源遭到严重破坏。
九节茶的繁殖常可采用播种、扦插、压条等。由于药材采挖，使种子(果实)的收获极困难，且九节茶作为半阴生植物，果实成熟率和收获率低，且发芽率低；而采用分株、压条的繁殖方法，繁殖系数低，枝茎扦插的成活率低；而且，靠上述的繁殖法，一般需2～3年。为加强中药材野生变家种，实现中药材规范化种植和产业化生产，发展绿色药材，实现该中药材GAP规范化管理，保证药品生产的质量，因而研究对优质的九节茶药材的人工栽培及优质种苗的快速繁殖非常重要，是为满足种苗市场的需要提供一条有效的途径。
已有对九节茶组织培养的研究主要集中于植物细胞工程及次生代谢产物的研究，仅见获得愈伤组织，而未见有成功获得再生苗的报道。如文献1.涂艺声江洪如，植物离体培养产生草珊瑚有效成分，天然产物研究与开发，1995，7(1)：35-41
文献2.涂艺声 王碧琴，不同色光，温度，PH对草珊瑚愈伤组织的培养效应，江西科学，1994，12(2)：85-89
文献3.涂艺声 江洪如，草珊瑚细胞悬浮培养之研究，江西科学，1994，12(3)：162-166
涂艺声等报道了以九节茶外植体诱导愈伤组织的适宜培养基和各种植物激素在诱导及其生长培养中的调节作用。应用薄层层析(TLC)和紫外光鉴定，证明所获得的愈伤组织具有合成与原植物材料相同的黄酮类、异嗪皮啶类、延胡索酸等有机酸的能力。亦通过愈伤组织无性系筛选过程，得到一个增长率和代谢物产量比愈伤组织母系高4倍左右的优良愈伤组织系。
植物组织培养成苗的途径通常有两种：经过愈伤组织后再出芽生根，该方法对九节茶种苗的培育未见成功的报道；直接诱导出芽和生根，对九节茶种苗的培育也未见有公开文献的报道。愈伤组织途径的增殖系数相对较大，但容易发生突变，并且诱导出芽和生根较为困难。而直接诱导出芽和生根的组培苗不易发生变易和退化，组培苗间的种性较稳定和整齐一致。同时如组织培养只到愈伤组织阶段而不能出芽和生根，就不能用于对九节茶的快繁育苗。九节茶通过丛生芽途径的离体快繁育苗尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是采用植物组织培养技术建立九节茶种苗的快速繁殖的快繁育苗方法。是以通过丛生芽途径的离体快繁育苗方法加速其繁殖速度获得大量试管苗，为满足种苗市场的需要。
为达到本发明目的所采用的技术方案，九节茶药材的组培快繁方法是按如下步骤操作：第一步是外植体处理：选取九节茶的带节茎段或顶芽作外植体，进行表面消毒；第二步是诱导丛生芽：将表面消毒后的外植体，接种于初代培养基上，在18～30℃，每天光照10～16小时，光照强度为1500～2000Lux，培养35～42天，诱导丛生芽，所说的初代培养基是采用在MS中添加6-苄氨基嘌呤2.0～4.0毫克/升和蔗糖30克/升、琼脂7.0克/升组成初代培养基；第三步是增殖培养：将丛生芽切成单芽或小丛芽，转入增殖培养基中，在18～30℃，每天光照10～16小时，光照强度为1500～2000Lux，进行增殖培养32～38天，所说的增殖培养基是采用在MS中添加6-苄氨基嘌呤1.0～4.0毫克/升、萘乙酸0～0.2毫克/升和蔗糖30克/升、琼脂7.0克/升组成增殖培养基；第四步是生根培养：切取单芽转入生根培养基中，在18～30℃，每天光照10～16小时，光照强度为1500～2000Lux，进行生根培养20～25天，形成具有根、茎、叶和芽的完整九节茶组培苗，所说的生根培养基是采用在1/2MS或者MS中添加萘乙酸0～0.5毫克/升、蔗糖30克/升和琼脂7.0克/升组成生根培养基；第五步是炼苗和移栽：具有根、茎、叶和芽的完整九节茶组培苗，在自然光照下炼苗4～5天后，组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和河沙1∶1混合成的基质土并定植于大田中，移栽后一个月统计成活率。
MS为Murashige和Skoog培养基的缩写，以下同。MS培养基是植物组织培养中常用的培养基，为植物组织生长提供必需的大量元素、微量元素及维生素、氨基酸等营养成分。(具体参考文献李浚明.2002.北京：植物组织培养教程.中国农业大学出版社.)
6-苄氨基嘌呤，缩写为6-BA，培养基中的浓度单位是毫克/升(mg/L)，以下同。
萘乙酸，缩写为NAA，培养基中的浓度单位是毫克/升(mg/L)，以下同。
外植体表面消毒方法很多，常用的消毒剂有70～75％酒精、次氯酸钠溶液、二氯化汞溶液等，本发明优选的方法是取九节茶的带节茎段或顶芽作外植体，先用75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗，再用0.1％二氯化汞添加添加0.5～1.0毫升/升的吐温80溶液，消毒15～20分钟，无菌水冲洗的方法。
本发明成功地利用植物组织细胞的全能性和植物组织培养进行植物种苗的规模化生产，建立九节茶的组织培养和快速繁殖方法，优点是：具有出苗快，稳定性高，苗壮，种苗品质好、抗性强、生长良好等优点。实施该专利只需有简单的植物组织培养设备即可进行，实用性强，可解决九节茶药材种植的种苗供应，为实现九节茶药材种植的GAP规范化管理提供了保障，也为以九节茶药材为原料的药品生产提供了质量保证。
下面通过实施例进一步阐述本发明的技术方案
具体实施方式
实施例1
1.取材：取九节茶(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)的带节茎段为外植体。
2.外植体的消毒：选取生长健壮的植株枝条，在自来水下冲洗干净后剪去叶片，用75％酒精棉球擦拭外表。剪取2cm左右的带节茎段，在超净工作台上，用75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗，再用0.1％二氯化汞溶液(每升加0.5ml吐温80)浸泡20分钟，无菌水冲洗即可。
3.将消毒好的外植体插入已配好的初代培养基：MS加6-BA 2.0毫克/升和蔗糖30克/升和琼脂7.0克/升。每天光照12小时，光照强度为2000Lux，温度为25℃，培养35天，诱导出丛生芽，每个外植体可诱导出芽4～6个。
4.增殖培养：将诱导出的丛芽分割成单个芽或者小丛芽，接种到增殖培养基：MS加6-BA4.0加NAA0.2，附加蔗糖30克/升，琼脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小时，光照强度为2000Lux，进行增殖培养35天，1个继代增殖周期由1个芽可增殖形成4～5个芽，丛生芽致密，粗壮。
5.生根培养：切取高2cm左右的单芽，转入生根培养基：用1/2M附加蔗糖30克/升，琼脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小时，光照强度为2000Lux条件下培养。13～14天时开始长根，根刚长出时较白，过一个星期左右根逐渐变成深绿色。23天时统计，生根率可达100％，每棵苗可长根2～4条，根较细，植株生长良好。
6.试管苗炼苗和移栽：将具有根、茎、叶和芽的完整九节茶组培苗，在自然光照下炼苗4天后，用镊子从培养瓶中取出组培苗，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和河沙1∶1混合成的基质土并定植于大田中，移栽初期注意浇水。移栽后一个月统计成活率，成活率可达95％。
实施例2
1.取材：取九节茶的顶芽为外植体。
2.外植体的消毒：剪取2cm左右生长健壮的植株顶芽，在自来水下冲洗干净后剪去叶片，用70％酒精棉球擦拭外表。在超净工作台上，用75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗，再用0.1％二氯化汞溶液(每升加1ml吐温80)消毒20分钟，无菌水冲洗，消毒成功率与实施例1无明显差异。
3.将消毒好的外植体插入已配好的初代培养基：MS加6-BA 4.0毫克/升加蔗糖30克/升加琼脂7.0克/升。每天光照12小时，光照强度为2000Lux，温度为25℃，培养35天，诱导出丛生芽，每个外植体可诱导出芽2～3个。
4.增殖培养：将诱导出的丛芽分割成单个芽或者小丛芽，接种到增殖培养基：MS加6-BA4.0加NAA0.2，附加蔗糖30克/升，琼脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小时，光照强度为2000Lux，进行增殖培养35天，1个继代增殖周期由1个芽可增殖形成4～5个芽，丛生芽致密，粗壮。
5.生根培养：切取高2cm左右的单芽，转入生根培养基：1/2MS中加蔗糖30克/升，琼脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小时，光照强度为2000Lux，进行生根培养23天，生根率可达100％，每棵苗可长根2～4条。
6.试管苗炼苗和移栽：将具有根、茎、叶和芽的完整九节茶组培苗，在自然光照下炼苗5天后，用镊子从培养瓶中取出组培苗，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和河沙1∶1混合成的基质土并定植于大田中，移栽后一个月统计成活率，成活率可达95％。
实施例3.
同实施例1操作，不同的是外植体表面消毒中的0.1％二氯化汞溶液(每升加0.7ml吐温80)处理15分钟，外植体消毒成功率略低于实施例1中的20分钟处理。丛生芽的诱导、增殖和生根培养所用的培养基和培养条件同实施例1，丛生芽的诱导与增殖率、生根数和植株生长状况均与实施例1无明显差异。
实施例4.
同实施例3操作，不同的是外植体表面消毒中的0.1％二氯化汞溶液(每升加0.7ml吐温80)处理25分钟，外植体消毒成功率高于实施例1中的20分钟处理，但是外植体死亡率略高。丛生芽的诱导、增殖和生根培养所用的培养基和培养条件同实施例1，丛生芽的诱导与增殖率、生根数和植株生长状况均与实施例1无明显差异。
实施例5
1取材和外植体表面消毒方法同实施例1
2丛生芽诱导培养基不同于实施例1之处是：丛生芽诱导的初代培养基中的6-BA浓度为4.0毫克/升，每个外植体可诱导出芽4～6个，与实施例1中使用6-BA浓度为2.0毫克/升时无显著差异。
3其他操作步骤同实施例1。
实施例6
同实施例5，不同之处在于丛生芽诱导的初代培养基中的6-BA浓度为3.0毫克/升，每个外植体可诱导出芽4～6个，与实施例1中使用6-BA浓度为2.0毫克/升时无显著差异。
从实施例1、5、6可以看出，初代培养基中的6-BA浓度在2.0～4.0毫克/升时，都可诱导九节茶丛生芽的生长，且对九节茶丛生芽的诱导差异不明显。
实施例7
1取材、外植体表面消毒方法和丛生芽诱导，操作同实施例1。
2增殖培养不同于实施例1之处是：将诱导出的丛芽分割成单个芽或者小丛芽，接种到增殖培养基：MS+6-BA1.0+NAA0.2，附加蔗糖30克/升，琼脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小时，光照强度为2000Lux，进行增殖培养35天，增殖率为2～3倍，丛生芽较高、粗壮。
3其他操作步骤同实施例1。
实施例8
同实施例7，不同之处是增殖培养基：MS中所加6-BA2.0毫克/升，NAA0.2毫克/升，仅6-BA浓度不同于实施例7，所得增殖率2～3倍，丛生芽较高、粗壮，与实施例7无明显差异。
实施例9
1取材、外植体表面消毒方法和丛生芽诱导，操作同实施例1。
2增殖培养不同于实施例1之处是：将诱导出的丛芽分割成单个芽或者小丛芽，接种到增殖培养基：MS+6-BA4.0，不添加NAA，附加蔗糖30克/升，琼脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小时，光照强度为2000Lux，进行增殖培养35天，增殖率4倍左右，但丛生芽较瘦弱，主芽均高于实施例1中添加了0.2毫克/升NAA时的高度。
3其他操作步骤同实施例1。
实施例10
操作与实施例1一致。但是生根培养所用培养基是MS，14天时开始长根，略迟于实施例1中使用1/2MS时，其他方面无明显差异。相同条件下，移栽成活率可达85％。
实施例11
操作与实施例1一致。不同仅在于生根培养所用培养基是在原来1/2MS的基础上添加0.5毫克/升NAA，17～18天时开始长根，明显迟于实施例1中使用1/2MS时，但长根数较多，每棵苗长根7～9条，所长的根粗壮、肥厚，植株较矮小，相同条件下，移栽成活率仅为20％。
实施例12
操作与实施例1一致。不同仅在于生根培养所用培养基是在原来1/2MS的基础上添加0.1毫克/升NAA，13天时开始长根，每棵苗长根9～11条，所长的根略粗于实施例1中的根，植株较矮小，相同条件下，移栽成活率为75％左右。
实施例13
操作与实施例2基本相同。不同仅在于所采用的培养条件是每天光照10小时，光照强度为1500Lux，培养温度25℃，所得结果与实施例2无明显差异。
实施例14
操作与实施例2基本一致。不同仅在于所采用的培养条件是每天光照16小时，光照强度为2000Lux，培养温度25℃，所得结果与实施例2无显著差异。
实施例15
操作与实施例2基本相同。不同之处仅在于所采用的培养温度是18℃。丛生芽诱导和增殖时，出芽速度略慢于实施例2中采用25℃培养时的状况，芽的增殖倍率和芽高无明显不同。生根培养时，开始生根的时间延迟，需15天左右开始长根，其他方面与实施例1无明显差异。
实施例16
操作与实施例2基本一致。不同的地方仅在于所采用的培养温度是25℃。植株各方面的表现与实施例2不存在显著性差异。
Claims (2)
1.一种九节茶药材种苗的组培快繁方法，其特征在于按如下步骤操作：第一步是外植体处理：选取九节茶的带节茎段或顶芽作外植体，进行表面消毒；第二步是诱导丛生芽：将消毒后的外植体接种于初代培养基上，在18～30℃，每天光照10～16小时，光照强度为1500～2000Lux，培养35～42天，诱导丛生芽，所说的初代培养基是采用在MS中添加6-苄氨基嘌呤2.0～4.0毫克/升和蔗糖30克/升、琼脂7.0克/升组成初代培养基；第三步是增殖培养：将丛生芽切成单芽或者小丛芽，转入增殖培养基中，在18～30℃，每天光照10～16小时，光照强度为1500～2000Lux，进行增殖培养32～38天，所说的增殖培养基是采用在MS中添加6-苄氨基嘌呤1.0～4.0毫克/升、萘乙酸0～0.2毫克/升和蔗糖30克/升、琼脂7.0克/升组成增殖培养基；第四步是生根培养：切取单芽转入生根培养基中，在18～30℃，每天光照10～16小时，光照强度为1500～2000Lux，进行生根培养20～25天，形成具有根、茎、叶和芽的完整九节茶组培苗，所说的生根培养基是采用在1/2MS或MS中添加萘乙酸0～0.5毫克/升、蔗糖30克/升和琼脂7.0克/升组成生根培养基；第五步是炼苗和移栽：具有根、茎、叶和芽的完整九节茶组培苗，在自然光照下炼苗4～5天后，组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和河沙1∶1混合成的基质土并定植于大田中。
2.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于第一步骤所说的外植体表面消毒方法是取九节茶的带节茎段或顶芽，先用75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗，再用0.1％二氯化汞添加0.5～1.0毫升/升的吐温80溶液，消毒15～25分钟，无菌水冲洗。
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Address after: 510130 No. 179 Renmin South Road, Guangzhou, Guangdong, Liwan District Patentee after: Guangzhou Baiyunshan Jingxiutang Pharmaceutical Company Limited Patentee after: South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences Address before: 510130 No. 179 Renmin South Road, Guangdong, Guangzhou Patentee before: Jingxiutang (Pharmacy) Co., Ltd., Guangzhou Patentee before: South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences |