CN1309822C - 一种雷蘑菌丝体及其培养方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种雷蘑菌丝体及其培养方法和该雷蘑菌丝体在制备抑制肝癌癌细胞或抑制白血病癌细胞药物中的用途；所述雷蘑菌丝体由下述方法制备：将野生雷蘑子实体组织块接入常规的土豆琼脂斜面培养基中进行原代培养，转接继代培养1～4代，得到驯化后的菌丝体——菌种；将菌丝体接入液体培养基中培养，然后接入发酵罐中培养，得到雷蘑菌丝体；所培养的雷蘑菌丝体具有与野生雷蘑相同的抑制癌细胞功能，可作为有效成分在制备抑制肝癌癌细胞或白血病癌细胞的药物中进行应用；该方法对于野生资源不能满足需要已濒临灭绝的雷蘑，提供了一种工业化生产的途径，且成本低廉，使之更具有市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种雷蘑菌丝体及其培养方法以及该雷蘑菌丝体在制备抑制肝癌癌细胞或抑制白血病癌细胞药物中的用途。
技术背景
目前，恶性肿瘤已成为人类主要的死亡原因之一。我国每年新出现的病人约100万，死亡80万左右。特别是白血病，近年来呈上升趋势，而且大多是儿童和青少年，我国每年平均有两万左右十五岁以下的儿童患病。以白血病为代表的儿童恶性肿瘤目前已经成为我国5-15岁儿童的第二大死亡原因，而在北京城区已经成为第一大死因。科学家至今无法摸清造成白血病的原因。严重的危害人类的生命和健康。因此恶性肿瘤的防治成为现代医学亟待解决的重大课题。许多科学家和医学工作者进行了大量研究，得到很多能够杀死和抑制肿瘤细胞的药物，但同时这些药物也对正常细胞产生一定程度的危害性。
70年代初，人们开始研究是否可以通过诱导分化，使肿瘤细胞向正常细胞分化，从而可以治疗恶性肿瘤。肿瘤细胞的诱导分化疗法优于传统的化疗和放疗，该疗法不是杀伤肿瘤细胞，而是在分化诱导剂的作用下，诱导肿瘤细胞向成熟阶段分化，恢复细胞的正常或接近正常的表型和功能。当前，寻找肿瘤细胞分化诱导剂已成为新的研究领域。
现已发现十余种化合物可以作为肿瘤细胞分化诱导剂。其中研究最多的是维甲酸类化合物(RA)与杂极性化合物，如二甲亚砜(DMSO)、六亚甲基双乙酰胺(HMBA)、丁酸等。据文献报导二甲亚砜诱导率为80％，被公认最好的诱导剂。1986年我国首先应用全反式维甲酸(ATRA，为分别起见下文均简称为ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病，取得良好效果。上海第二医科大学瑞金医院上海血液学研究所与哈尔滨医科大学的研究发现可以使用As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病，其机制主要是促进急性早幼粒细胞凋亡。虽然ATRA及As2O3在治疗急性早幼粒细胞白血病上取得了成功，维甲酸、HMBA已进入临床阶段，但是这些药物都属纯化学药剂，副作用很大，而且在适应病情范围、剂量依赖的毒性等方面存在着局限性，还不能广泛应用于临床肿瘤治疗。
雷蘑提取物作为有效成分在制备抑制肝癌癌细胞和白血病癌细胞的药物中的用途，本申请人在另案中已申请。作为有效成分，雷蘑提取物在抑制肝癌癌细胞和白血病癌细胞中表现出令人满意的效果。雷蘑是一种天然伞菌目白蘑科口蘑属的口蘑，拉丁名为Leucopaxillus giganteus；其菌子实体夏秋季生长在草原上，子实体菌盖约5-30cm，常见于秋季的内蒙古锡林郭勒草原。目前天然雷蘑资源已濒临灭绝(已经有连续几年没能采集到雷蘑)，不能满足需要。因此，作为工业化生产以雷蘑提取物为有效成分的抑制肝癌癌细胞和白血病癌细胞的药物几乎是不可能的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雷蘑菌丝体；
本发明的目的在于一种工业化批量生产培养雷蘑菌丝体的方法，以解决作为在制备抑制肝癌癌细胞和白血病癌细胞的药物的天然雷蘑原料的缺乏；
本发明的另一目的在于本发明所培养的雷蘑菌丝体在制备抑制肝癌癌细胞和白血病癌细胞的药物中的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的雷蘑菌丝体，该雷蘑菌丝体由下述方法制备：
1)无菌条件下，将野生雷蘑子实体的组织块接种于常规的土豆琼脂斜面培养基，并放在28～30℃恒温培养箱进行原代培养10～20天，培养基表面生长出原代菌丝体；再将该原代菌丝体接入另一与上述组分相同的土豆琼脂斜面培养基上进行继代培养1～4代，得到驯化后的菌丝体，其菌种保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，其保藏登记入册编号为CGMCC No.0921；
2)将步骤1)中得到的菌丝体接入经灭菌的液体培养基中，在28～30℃振荡培养3～5天，然后接入发酵罐，接种量为10v％，在28～30℃恒温下，培养3～5天，并经过滤、干燥，得到雷蘑菌丝体。
步骤1)中所述土豆琼脂培养基的组成组分及重量份配比为：蔗糖20g、土豆200g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、琼脂10g、水1000ml，其pH为6.0-6.2。
步骤2)中所述液体培养基的组分及重量份配比为：蔗糖20g、黄豆粉10g、玉米粉10g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、酵母粉1g、CaCO3 1g、水1000ml。
所述步骤2)中的灭菌是将培养基置于1.5kg/cm2高压的条件下高压灭菌30分钟。
本发明提供的雷蘑菌丝体的培养方法，包括如下步骤：
1、无菌条件下，将野生雷蘑子实体的组织块接种子常规的土豆琼脂斜面培养基，并放在28～30℃恒温培养箱进行原代培养10～20天，培养基表面生长出原代菌丝体；再将该原代菌丝体接入另一与上述组分相同的土豆琼脂斜面培养基上进行继代培养1～4代，得到驯化后的菌丝体，其菌种保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，其保藏登记入册编号为CGMCC No.0921；
2、步骤1中得到的菌丝体接入经灭菌的液体培养基中，在28～30℃振荡培养3～5天，然后接入发酵罐，接种量为10v％，在28～30℃恒温下，培养3～5天，并经过滤、干燥，得到雷蘑菌丝体；
步骤1中所述土豆琼脂培养基的组成组分及重量份配比为：蔗糖20g、土豆200g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、琼脂10g、水1000ml，其pH为6.0-6.2。
步骤2中所述液体培养基的组分及重量份配比为：蔗糖20g、黄豆粉10g、玉米粉10g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、酵母粉1g、CaCO3 1g、水1000ml。
所述步骤2中的灭菌是将培养基置于1.5kg/cm2高压的条件下高压灭菌30分钟。
本发明的雷蘑菌丝体在制备抑制肝癌癌细胞药物中的用途。
本发明的雷蘑菌丝体在制备抑制白血病癌细胞药物中的用。
本发明提供的雷蘑菌丝体的培养方法的优点在于：
1、以本发明提供的方法培养的雷蘑菌丝体与野生雷蘑具有相同的作用，其含有诱导分化因子，在一定的浓度下能诱导癌细胞向正常细胞分化；
2、对于野生资源不能满足需要(已濒临灭绝的雷蘑)，而提供了一种工业化生产的途径，可以不受资源不足的限制使以雷蘑为有效成分的抗癌药物生产成为可能，且该人工培养雷蘑菌丝体的方法成本低廉，使之具有市场前景；
3、经中国医科院基础所和北京医科大学生物医药实验室多次体外细胞实验验证，该菌丝体不但能够杀死白血病细胞而且对人体正常细胞无任何杀伤作用，无毒副作用；
4、与目前国内外常见同类药物比较，其诱导分化率均高于其他诱导分化剂，例如我们在同等条件下做诱导分化试验比较，二甲亚砜DMSO诱导分化极微量，目前已上临床试验的维甲酸仅为30％左右，而本发明方法生产的菌丝体诱导分化率达到40％以上；
5、用本发明方法生产的菌丝体制成的制剂用量小，我们曾用培养物原液做体外细胞实验，仅仅1％左右浓度200微升，就能100％杀死1000-5000个癌细胞，0.1％左右的浓度的培养液就能诱导癌细胞调亡，诱导分化率约40％以上。
具体实施方式
实施例1、培养雷蘑菌丝体
将以蔗糖20g、土豆200g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、琼脂10g、水1000ml为配方制成的pH为6.0的培养基装入试管中，制成土豆琼脂斜面固体培养基；取野生雷蘑子实体，在无菌条件下，去净表面杂物，并用70％酒精消毒，用无菌解剖刀将蘑菇剖成两半，割取子实体中间部分约黄豆大小的组织块，置入试管培养基中；将试管放在28℃培养箱中，恒温培养10天，在培养基表面生长出浓密的雷蘑原代菌丝体；再将该雷蘑原代菌丝体接入另一与上述培养基同组分的培养基上进行传代培养4代，得到驯化的雷蘑菌丝体；
将上述转接4代得到的雷蘑菌丝体接入经灭菌(1.5kg/cm2高压的条件下灭菌30分钟)的液体培养基中，并在摇床上28℃恒温培养4天，摇床转速为120转/分，然后接种入发酵罐培养，其接种量为10v％，在28～30℃下，恒温培养3～5天，之后经过滤，得到雷蘑菌丝体；
所用的液体培养基组成组分及重量份配比为：蔗糖20g、黄豆粉10g、玉米粉10g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、酵母粉1g、CaCO3 1g、水1000ml的液体。
实施例2、制备雷蘑菌丝体水溶液提取物
将实施例1得到的雷蘑菌丝体10g，搅碎，加入100ml 0.7％浓度的NaCl水溶液，搅拌10～20分钟，离心，除去沉淀物，得到雷蘑菌丝体提取物水溶液。
实施例3、急性毒性检测实验
将实施例1制备的雷蘑菌丝体对小鼠进行喂养，或是使用实施例2的雷蘑菌丝体提取物水溶液，用0.7％NaCl或水稀释至10wt％，给小鼠进行灌胃。所用的小鼠为购自北京动物饲养中心的昆明鼠，体重为20克。
将30只小鼠分为三组：第一组10只为对照组，用北京动物饲养中心配制的普通鼠食喂养；第二组10只，用含有雷蘑菌丝体的鼠食，按5g/d.Kg喂养；第三组10只，用雷蘑菌丝体提取物水溶液按5g/d.Kg灌胃。
喂养、灌胃30天，称重，第一组小鼠平均体重为31.2g，第二组小鼠平均体重为32.8g，第三组小鼠平均体重为32.9g。
饲喂菌丝体的小鼠和用雷蘑菌丝体提取物水溶液灌胃的小鼠平均体重略高于对照组；且无任何不良反应，由此结果可知，本发明制备的雷蘑菌丝体及雷蘑菌丝体提取物水溶液没有毒性。
实施例4、抑制肝癌细胞
用中国科学院动物所提供的S180腹水癌细胞对小鼠进行接种实验。所用的小鼠为购自北京动物饲养中心的昆明公鼠，体重为20克。将30只小鼠分为六组，每组5只，第1～第3组喂养30天，第4～6组喂养60天。
用北京动物饲养中心配制的普通鼠食，或是同时使用实施例2的雷蘑菌丝体提取物水溶液，用0.7％NaCl或水稀释至10wt％，给小鼠进行灌胃。
第1组接种癌细胞，使用普通鼠食进行喂养，30天后死亡4只；
第2组接种癌细胞，并在接种癌细胞同时每只用0.2毫升/天的雷蘑菌丝体水溶液灌胃，30天后全部存活，无腹水出现；
第3组接种癌细胞，先用普通鼠食喂养被接种的小鼠，一周后小鼠产生腹水，腹部与对照相比明显涨大，用手触摸腹部有腹水感觉；此时开始每只用0.2毫升/天的雷蘑菌丝体提取液灌胃，30天后全部存活，腹部变小；
第4组接种癌细胞，使用普通鼠食进行喂养，60天后全部死亡；
第5组接种癌细胞，并在接种癌细胞同时每只用0.2毫升/天的雷蘑菌丝体提取液灌胃，60天后全部存活，无腹水出现；
第6组接种癌细胞，先用普通鼠食喂养被接种的小鼠，一周后小鼠产生腹水，腹部与对照相比明显涨大，用手触摸腹部有腹水感觉；此时开始每只用0.2毫升/天的雷蘑菌丝体提取液灌胃，60天后全部存活，腹部变小。
将喂药组解剖肝部观察，无异常，且癌细胞抑制率达95％，说明本发明制备的雷蘑菌丝体对正常细胞无副作用。
将实施例3中第2、3、5和6组存活的20只小鼠分为两组，与正常小鼠一起进行体能实验和耐缺氧实验。体能实验：将小鼠的尾部用铁丝捆绑5克重物，使负重的小鼠刚好可以下沉，又能不断上浮呼吸。耐缺氧实验：把做好记号的小鼠置入密闭容器中，然后逐渐抽取空气，使容器内只剩少量空气。体能实验和耐缺氧实验结果表明，存活的20只小鼠在体能和耐缺氧方面与正常小鼠并无差异，说明使用雷蘑菌丝提取物可以治愈癌症，使小鼠恢复正常。
将接种了癌细胞的小鼠使用菌丝体按5g/d.Kg喂养，进行同样的实验，结果与使用菌丝体提取液的效果相似。
实施例5、培养雷蘑菌丝体
将以蔗糖20g、土豆200g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、琼脂10g、水1000ml为配方制成的pH为6.2或6.1的培养基装入试管中，制成土豆琼脂斜面固体培养基；取新鲜雷蘑子实体，在无菌条件下，去净表面杂物，并用70％酒精消毒，用无菌解剖刀将蘑菇剖成两半，割取子实体中间部分约黄豆大小的组织块，置入试管培养基中；将试管放在30℃或29℃的培养箱中，恒温培养20天或10天，在培养基表面生长出浓密的雷蘑原代菌丝体；再将该雷蘑原代菌丝体接入另一组分相同的培养基上进行传代培养3代(当然也可为1代或2代)，得到驯化的雷蘑菌丝体种；
将上述转接3代得到的雷蘑菌丝体接入经灭菌(1.5kg/cm2高压的条件下高压灭菌30分钟)的液体培养基中，并在摇床上30℃或29℃恒温培养5天(也可培养3天)，其转速为120转/分，然后接入发酵罐经培养，其接种量为10v％，在30℃或29℃下，恒温培养5天或4天，并经过滤，得到雷蘑菌丝体(含有一定量的子实体)；
所用的液体培养基的组成组分及重量份配比为：蔗糖20g、黄豆粉10g、玉米粉10g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、酵母粉1g、CaCO3 1g、水1000ml的液体。
实施例6、制备雷蘑菌丝提取物体水溶液
将实施例5得到的雷蘑菌丝体10g，搅碎，加入100ml 0.7％NaCl水溶液，搅拌10～20分钟，离心，除去沉淀物，得到雷蘑菌丝粗提取物体水溶液。
实施例7、抑制白血病癌细胞
人红白血病细胞株(K562)是人造血系统的恶性肿瘤细胞，K562白血病细胞系源自美国ATCC。本实验使用的K562为协和医科大学细胞生物室储存，并用含10％小牛血清的1640培养基按常规培养条件进行培养。
将实施例6制得的雷蘑菌丝提取物水溶液，用盐水稀释成1％、0.5％、0.1％的溶液，对人红白血病K562细胞进行抑制生长验证。将3×104/ml K562细胞分别接种到96孔板，按8孔一组，分为12组，分别加入1％、0.5％、0.1％的菌丝体水溶液，培养1、3、5天后，分别记数细胞，并绘制生长曲线。实验结果表明，200微升的1％，0.5％的提取物，均能100％杀死1000～5000个癌细胞，0.1％的提取物的培养液能诱导分化癌细胞，诱导率约40％以上。
实施例8
使用实施例6培养雷蘑菌丝体时的液体培养液做体外细胞实验，即将该培养液稀释100倍，500倍，按实施例7中所述的方法做抑制白血病细胞实验，结果表明，该培养液同样能明显抑制肿瘤细胞的生长，抑制率为100％。
Claims (10)
1、一种雷蘑菌丝体，其特征在于，该雷蘑菌丝体由下述方法制备：
1)无菌条件下，将野生雷蘑子实体的组织块接种于土豆琼脂斜面培养基，并放在28～30℃恒温培养箱进行原代培养10～20天，培养基表面生长出原代菌丝体；再将该原代菌丝体接入另一与上述组分相同的土豆琼脂斜面培养基上进行继代培养1～4代，得到驯化后的菌丝体，其菌种保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，其保藏登记入册编号为CGMCC No.0921；
2)将步骤1)中得到的菌丝体种接入经灭菌的液体培养基中，在28～30℃振荡培养3～5天，然后接入发酵罐，接种量为10v％，在28～30℃恒温下，培养3～5天，并经过滤、干燥，得到雷蘑菌丝体。
2、按权利要求1所述的雷蘑菌丝体，其特征在于，步骤1)中所述土豆琼脂培养基的组成组分及重量为：蔗糖20g、土豆200g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、琼脂10g、水1000ml，其pH为6.0-6.2。
3、按权利要求1所述的雷蘑菌丝体，其特征在于：步骤2)中所述液体培养基的组成组分及重量为：蔗糖20g、黄豆粉10g、玉米粉10g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、酵母粉1g、CaCO3 1g、水1000ml。
4、按权利要求1所述的雷蘑菌丝体，其特征在于：所述步骤2)中的灭菌是将培养基置于1.5kg/cm2高压的条件下高压灭菌30分钟。
5、一种雷蘑菌丝体的培养方法，包括如下步骤：
1)无菌条件下，将野生雷蘑子实体的组织块接种于土豆琼脂斜面培养基，并放在28～30℃恒温培养箱进行原代培养10～20天，培养基表面生长出原代菌丝体；再将该原代菌丝体接入另一与上述组分相同的土豆琼脂斜面培养基上进行继代培养1～4代，得到驯化后的菌丝体，其菌种保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，其保藏登记入册编号为CGMCC No.0921；
2)将步骤1)中得到的菌丝体接入经灭菌的液体培养基中，在28～30℃振荡培养3～5天，然后接入发酵罐，接种量为10v％，在28～30℃恒温下，培养3～5天，并经过滤、干燥，得到雷蘑菌丝体。
6、按权利要求5所述的雷蘑菌丝体的培养方法，其特征在于：步骤1)中所述土豆琼脂培养基的组成组分及重量为：蔗糖20g、土豆200g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.5g、维生素B1 2mg、琼脂10g、水1000ml，其pH为6.0-6.2。
7、按权利要求5所述的雷蘑菌丝体的培养方法，其特征在于：步骤2)中所述液体培养基的组成组分及重量为：蔗糖20g、黄豆粉10g、玉米粉10g、KH2PO4 3g、MgSO40.5g、维生素B1 2mg、酵母粉1g、CaCO3 1g、水1000ml。
8、按权利要求5所述的雷蘑菌丝体的培养方法，其特征在于：所述步骤2)中的灭菌是将培养基置于1.5kg/cm2高压的条件下高压灭菌30分钟。
9、一种雷蘑菌丝体在制备抑制肝癌癌细胞药物中的用途。
10、一种雷蘑菌丝体在制备抑制白血病癌细胞药物中的用途。
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| 蘑中珍品——回蘑 韩杰，中国保健营养，第1期 2001 * |
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