CN108588143A - 一种高效生产发菜胞外多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效生产发菜胞外多糖的方法，步骤为⑴将发菜细胞种子液接种到BG‑11培养基中，培养至对数期，添加亚甲基蓝诱导3‑5天，收集上清液；⑵为发菜细胞补充含亚甲基蓝的新鲜培养基，诱导3‑5天，收集上清液；⑶重复步骤⑵1‑2次，将每次收集的上清液合并用于提取发菜胞外多糖。本发明通过在培养过程中添加亚甲基蓝，对发菜细胞造成了氧化胁迫，而多糖更多的积累是这一胁迫的应激响应。本发明涉及的外加亚甲基蓝的诱导方法显著提高了发菜多糖的产率，降低了成本，可用于工业规模的发酵。

Description

一种高效生产发菜胞外多糖的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及微生物多糖生产技术领域，具体涉及一种高效生产发菜胞外多糖的方法。
背景技术
多糖作为构成生命体的四大基本物质之一，由醛基和酮基形成糖苷键连接而成，广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物的细胞壁以及细胞分泌物中。越来越多的研究证明多糖具有多方面的生物活性和复杂功能,因此多糖类药物和保健品已成为近些年来研究与开发的热点之一。蓝细菌因可利用光能生产水溶性释放多糖成为一种引人注目的新型产多糖资源，从野生发菜中提取的胞外多糖为一种酸性多糖，具有抗病毒、抑制癌细胞和增强机体免疫功能的能力。同时实验证明其水抽提物具有抗肿瘤活性和改善花粉敏感症状的能力。
天然条件下野生发菜生长速度缓慢，远不能满足市场的需求，无节制的乱采滥挖导致了严重的土壤沙漠化。自2000年起，我国政府出于保护发菜资源和生态环境的目的，全面禁止发菜的采收和销售。为了解决市场需求不足和保护生态环境这一两难问题，人们对人工培养发菜进行了深入的研究，主要包括固态培养法和液体培养法。天津科技大学林永贤通过对液态培养发菜多糖和天然发菜多糖进行提取、分离和纯化，采用热重分析、红外光谱、原子力显微镜和扫描电镜等分析方法对两者的理化性质进行对比分析研究。证明两者具有高度相似性，为液态培养发菜多糖工业化提取和分离提供了理论依据。
根据检索，发现有以下几篇专利文献与本发明相关，分别是：
1、专利(CN101864470A)“提高发菜细胞深层发酵生产胞外多糖产量的方法”提供了一种提高发菜细胞深层发酵生产胞外多糖产量的方法。通过分阶段控制光照强度和培养基发酵工艺提高发菜细胞多糖产量，工艺简单，生产效率高，适于放大工业化生产，生产获得的发菜细胞多糖，经分离纯化后可以用作天然抗病毒药物或食品原辅料。但由于该培养方法在培养开始时就在培养基中添加了葡萄糖，极易染菌，使培养过程中对无菌生产条件要求非常严格，从而大大提高了生产成本和生产的风险性，不利于发菜细胞及其胞外多糖的工业化生产。
2、专利(CN101845395A)“一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法”提供了一种高效两阶段生产发菜细胞及其胞外多糖的方法，采用自养和混合营养相结合的模式，向对数生长期的发菜细胞培养基中添加有机碳源，在有效缩短了发菜细胞的培养周期同时提高了胞外多糖的产量，与单一混养培养方法相比可提高葡萄糖的利用率，有效降低染菌率，降低生产成本。但由于其采醇沉法获取发菜多糖，成本较高、存在安全隐患且易造成环境污染，不利于工业化大规模生产的实现。
3、专利(CN101063085A)“一种通过诱导提高活性多糖含量的发菜培养方法”，该方法是发菜细胞通过自身对外界环境的应激反应得到的天然代谢物质，保证了天然物质原有的生物活性；所利用的UV-C处理方法操作简便，易于控制，适于大规模培养；其培养获得的发菜细胞液中胞外多糖含量丰富，可以作为多种保健品中的功能性食品添加剂。但在该条件下发菜生长状态较差，细胞密度较低，总多糖产量也比较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效生产发菜胞外多糖的方法。该方法采用化学调节剂亚甲基蓝多次诱导发菜细胞的培养模式，有效提高了胞外多糖的产量，同时采用膜分离技术纯化多糖，减少了有机溶剂的使用，降低了成本、提高了安全系数。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种高效生产发菜胞外多糖的方法，在发菜培养过程中，向培养基内添加亚甲基蓝。
而且，所述亚甲基蓝浓度为0.5-5mg/L。
一种高效生产发菜胞外多糖的方法，方法包括以下步骤：
⑴取发菜细胞种子液以体积比3～10％的接种量接种到新鲜无菌的含外源碳源、氮源的BG-11培养基中，于20-30℃恒温，1000-2500lux光照强度条件下进行培养；
⑵向步骤⑴培养至对数期的发菜培养液，添加0.5-5mg/L的亚甲基蓝,继续培养3-5天，收集上清液；
⑶为发菜细胞补充含0.5-5mg/L亚甲基蓝的新鲜培养基，继续培养3-5天，收集上清液；
⑷重复步骤⑶1-2次，将每次收集的上清液合并用于提取发菜胞外多糖。
而且，步骤⑴中所述BG11培养基初始pH值范围为8.0-8.5。
而且，步骤⑴中所述外源碳源、氮源分别为1-1.5g/L NaHCO3、1-2g/L的NaNO3。
而且，步骤⑵-⑷中所述上清液和细胞的分离方法采用筛网过滤或自然沉降法。
而且，步骤⑷所述的发菜多糖的提取方法如下：
采用膜分离技术纯化多糖，在室温，pH为8-9，临界压力为0.15-0.18MPa 的条件下，超滤获得发菜多糖。
而且，所述亚甲基蓝浓度为3-5mg/L。
本发明与现有技术相比的优点和积极效果如下：
本发明利用亚甲基蓝诱导提高人工液体培养发菜活性多糖产量，为获得更多发菜多糖提供一种有效的途径。
本发明提供的一种高效生产发菜胞外多糖的方法，操作简便，易于控制，适于大规模培养；本发明培养获得的发菜细胞胞外多糖含量丰富，可以作为多种保健品中的功能性食品添加剂。
本发明通过膜分离技术进行过滤和提取多糖，减少了有机溶剂的使用，降低了成本、提高了安全系数同时减少了对环境的污染，利于工业化大规模生产的实现。
附图说明
图1为亚甲基蓝添加量与胞外多糖产量的曲线图。
具体实施方式：
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下面结合具体实施方式对本发明做进一步的阐述。
实施例1
一种高效生产发菜胞外多糖方法，包括以下步骤：
⑴取发菜细胞种子液以5-10％(v/v)的接种量接种到新鲜无菌的含外源C、N 的BG-11培养基中，于25℃恒温，1000lux光照强度条件下进行培养，定期摇瓶 2次/d；
⑵向步骤⑴培养至对数期的发菜培养液，分别添加终浓度1mg/L、1.5mg/L、 3mg/L的亚甲基蓝(用注射器式滤器过滤除菌)，继续培养4天，250目纱布过滤收集上清液；
⑶为发菜细胞补充含上述相同浓度亚甲基蓝的新鲜培养基，继续培养4天， 250目纱布过滤收集上清液；
⑷重复步骤⑶2次，将每次收集的上清液合并用于提取发菜胞外多糖。
本发明使用的发菜细胞为现有市场中销售的发菜细胞即可，没有特殊要求，也可以采用保藏于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心的发菜细胞 (TCCC11757)。
所述发菜细胞培养基为由BG-110培养基与NaNO3和NaHCO3共同优化配制的BG-11培养基，在此培养基中，发菜细胞具有较高生长速率。
所述培养基由以下方法制备：
1.BG110培养基成分及含量为：
K2HPO4 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2 0.0272g/L，Na2SiO3·9H2O0.058g/L，柠檬酸0.6mg/L，FeSO4·7H2O 4.8mg/L，H3BO4 2.86mg/L，MnCl2·4H2O 1.8mg/L，ZnSO4·7H2O 0.2mg/L，EDTA·2Na 1.0mg/L，NaMoO4·2H2O 0.4mg/L， CuSO4·5H2O 0.08mg/L，CoCl2 1.0ug/L。
2.BG-11培养基的制备
通过膜过滤向BG11培养基中添加1.5g/L的NaNO3和1.26g/L的NaHCO3。 NaNO3的作用主要是为了给发菜细胞生长提供充足的N源。NaHCO3的作用主要是为了给发菜细胞生长提供充足的C源。
实施例2
一种高效生产发菜胞外多糖的方法，包括以下步骤：
⑴取发菜细胞种子液以5-10％(v/v)的接种量接种到新鲜无菌的含外源C、N 的BG-11培养基中，于25℃恒温，1000lux光照强度条件下进行培养，定期摇瓶 2次/d；
⑵向步骤⑴培养至对数期的发菜培养液，分别添加终浓度4.5mg/L、5mg/L 的亚甲基蓝(用注射器式滤器过滤除菌),继续培养4天，250目纱布过滤收集上清液；
⑶为发菜细胞补充含上述相同浓度亚甲基蓝的新鲜培养基，继续培养4天， 250目纱布过滤收集上清液；
⑷重复步骤⑶2次，将每次收集的上清液合并用于提取发菜胞外多糖。
发菜细胞(TCCC11757)保藏于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心。
所述发菜细胞培养基为由BG-110培养基与NaNO3和NaHCO3共同优化配制的BG-11培养基，在此培养基中，发菜细胞具有较高生长速率。
产物收集方法：
上清液和细胞的分离采用筛网过滤法：200-250目纱布过滤
发菜多糖的提取方法：采用膜分离技术纯化多糖，在室温，pH为8-9,临界压力为0.15-0.18MPa条件下，经超滤膜超滤，截流液中得大分子多糖-发菜多糖。 80℃烘干后即得粗胞外多糖粉末。
实验结果如下图1所示，由图可知，外源添加亚甲基蓝浓度在1-5mg/L范围内时，发菜胞外多糖产量呈现先增长后下降的趋势。实验结果表明：发明的培养方法能促进发菜细胞分泌胞外多糖，提高发菜多糖产量。

Claims (8)

1.一种高效生产发菜胞外多糖的方法，其特征在于：在发菜培养过程中，向培养基内添加亚甲基蓝。
2.根据权利要求1所述的高效生产发菜胞外多糖的方法，其特征在于：所述亚甲基蓝浓度为0.5-5mg/L。
3.根据权利要求1所述的高效生产发菜胞外多糖的方法，方法包括以下步骤：
⑴取发菜细胞种子液以体积比3～10％的接种量接种到新鲜无菌的含外源碳源、氮源的BG-11培养基中，于20-30℃恒温，1000-2500lux光照强度条件下进行培养；
⑵向步骤⑴培养至对数期的发菜培养液，添加0.5-5mg/L的亚甲基蓝,继续培养3-5天，收集上清液；
⑶为发菜细胞补充含0.5-5mg/L亚甲基蓝的新鲜培养基，继续培养3-5天，收集上清液；
⑷重复步骤⑶1-2次，将每次收集的上清液合并用于提取发菜胞外多糖。
4.根据权利要求3所述的高效生产发菜胞外多糖的方法，其特征在于：步骤⑴中所述BG11培养基初始pH值范围为8.0-8.5。
5.根据权利要求3所述的高效生产发菜胞外多糖的方法，其特征在于：步骤⑴中所述外源碳源、氮源分别为1-1.5g/L NaHCO3、1-2g/L的NaNO3。
6.根据权利要求3所述的高效生产发菜胞外多糖的方法，其特征在于：步骤⑵-⑷中所述上清液和细胞的分离方法采用筛网过滤或自然沉降法。
7.根据权利要求3所述的高效生产发菜胞外多糖的方法：其特征在于：步骤⑷所述的发菜多糖的提取方法如下：
采用膜分离技术纯化多糖，在室温，pH为8-9，临界压力为0.15-0.18MPa的条件下，超滤获得发菜多糖。
8.根据权利要求3所述的高效生产发菜胞外多糖的方法：其特征在于：所述亚甲基蓝浓度为3-5mg/L。
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