CN101326954B

CN101326954B - 灵芝转化麦秸生产含灵芝酸饲料的方法及其用途

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Publication number: CN101326954B
Application number: CN2008100208875A
Authority: CN
Inventors: 张志才; 黄达明; 崔凤杰; 何林富
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2028-07-30
Also published as: CN101326954A

Abstract

本发明涉及生物饲料工业领域，具体的说本发明涉及药用真菌灵芝转化麦秸生产的含灵芝酸饲料的方法，以及用该方法生产的功能性饲料的功效。本发明以灵芝为出发菌株，以麦秸为原料进行液体摇瓶培养、种子罐扩大培养和固态发酵培养，得到富含灵芝酸的功能性饲料。本发明饲料为淡黄色粉末，具有香味，饲料中粗灵芝酸含量高达0.06～0.3％，蛋白质12～14％。可用作动物饲料的添加剂或用于制备具有调节血糖血脂，预防心脑血管疾病或支气管炎的药物或保健食品。本发明不仅为深度开发利用灵芝打开了一条崭新的途径，而且为开发功能性饲料提供理想的生物添加剂。

Description

灵芝转化麦秸生产含灵芝酸饲料的方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物发酵及饲料领域，具体的说本发明涉及通过药用真菌灵芝转化麦秸生产含有灵芝酸饲料的方法，所述的含灵芝酸饲料，或以这种饲料作为原料生产的灵芝酸可以用饲料添加剂具有多种生物学功能，可用于提高动物肌体免疫力、增强饲养动物抗病毒的能力。以这种饲料作为原料生产的灵芝酸也可作为生产具有调节血糖血脂，预防心脑血管疾病或支气管炎的药物或保健食品。

背景技术

随着人们生活质量的提高，越来越多的人们开始重视畜禽产品的安全，发展健康养殖、保证动物健康是一项复杂的系统工程，涉及许多方面问题。过去为了增强动物疾病抵抗力，都是依靠添加合成的化学物质，但是人工合成的化学物质不易被动物降解，残留于动物体内，最终影响人类。如何解决这一问题呢？从营养供给方面着手是解决动物健康问题唯一有效的办法。

灵芝，是一种稀有野生名贵食用菌和药用菌。现代营养成分分析结果表明灵芝营养成分丰富且营养价值高，含有灵芝酸、氨基酸、脂肪酸、常量及微量元素、维生素C、E、胡萝卜素及生物活性多糖。

近年来国内外对灵芝的研究主要集中于它的驯化栽培、营养成分分析、液体培养以及菌丝体内多糖及药效等方面。清华大学段明星(清华大学学报.1999，38：56-58)。等人进行了灵芝纤维酶的性质和纯化研究，证明了灵芝真菌能降解秸秆的可能性；南京理工大学孙东平(南京理工大学.2006，30：356-360)。对灵芝液体发酵产纤维素酶的提取及性质分析进行了研究，证明了灵芝能够产纤维素酶，从而进一步证实了灵芝真菌能降解秸秆，但是他们没有对灵芝利用纤维素酶转化秸秆进行深入的研究。上海市中药研究所邓海林(时珍国医国药.20065(1)：141-143)。报道了灵芝能防止肿瘤的发生和抑制肿瘤的生长；灵芝实体、菌丝体、孢子粉、及灵芝水提液、多糖、蛋白均有免疫调节作用；灵芝有明显的抗衰老作用；灵芝有镇静催眠的作用芝对大鼠血管平滑肌细胞有抗脂质过氧化作用，其抗动脉粥样硬化的作用机制可能与其对抗活性氧引发的脂质过氧化反应，增强体内抗氧化酶的活性有关；灵芝提取物对流感病毒FM1株感染小鼠的保护作用(广州中医大学学报，1998，15(3)：205～207)。已经公布的550项灵芝专利主要涉及灵芝子实体提取，灵芝孢子深度加工，以及以葡萄糖为碳源，灵芝液体培养生产灵芝酸和多糖等技术，本发明与上述文献或相关专利区别在于本发明侧重于灵芝转化秸秆资源，灵芝真菌转化秸秆产生的灵芝酸的提取及其被用于生产饲料添加剂以及作为生产具有调节血糖血脂，预防心脑血管疾病或支气管炎的药物或保健食品。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种以麦秸为原料，采用灵芝进行固态发酵制备的含灵芝酸饲料的方法，得到的饲料中含有灵芝酸、多糖类等化合物。

本发明所使用的灵芝菌种可选用任意一种灵芝菌种，例如江苏、河南或常白山的野生灵芝经常规组织分离得到的菌种。本发明含有灵芝酸的功能性饲料的发酵工艺包括以灵芝为出发菌株，进行液体摇瓶培养、一级种子罐培养和固态发酵培养，得到含有灵芝酸的功能性饲料，以及以这种含灵芝酸饲料作为原料用作动物饲料的添加剂或用于制备具有调节血糖血脂，预防心脑血管疾病或支气管炎的药物或保健食品。

更具体地，本发明涉及灵芝以麦秸为原料进行培养的发酵工艺，该工艺包括以下步骤：

[1]在本发明所述的发酵工艺中，在进行固态发酵培养之前，首先将灵芝的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中进行活化培养，培养温度20～40℃，培养时间48～150小时，其中所述的斜面培养基是现有技术中常用的斜面培养基，例如常用的是PDA培养基，此类培养基的组成和所用可参见诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367；

[2]将步骤(1)的斜面菌种转接入装有液体培养基的三角瓶中，于20～40℃进行液体摇瓶培养，转速90～200转/分钟，培养时间24～150小时。其中所述培养基组成为(克/升)：麦秸5～30，玉米粉10～25，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄ 1～6，MgSO₄ 1～4，起始pH值为5.0～8.0；

[3]将步骤(2)得到的液体摇瓶培养的菌种按5～10％(v/v)的接种量转接入装有一级种子培养基的种子罐中进行培养，温度20～40℃，种子罐压力0.05Mpa，搅拌速率60～200转/分钟，通风量1∶0.3～1∶1.5v/v/m，培养时间24～150小时。其中所述的种子罐培养的培养基组成为(单位为克/升)：麦秸5～10，玉米粉10～25，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄ 1～6，MgSO₄ 1～4，消泡剂0.1～0.8，起始pH值为5.0～8.0；

[4]将上述种子罐中的菌种按5～20％(v/w)的接种量转接入装有发酵培养基的发酵床中进行培养，温度20～40℃，堆厚度为6～30cm，发酵罐培养时间90～180小时。其中所述发酵培养的培养基组成及其比例为：麦秸粉25～80，玉米粉5～20，麸皮5～20，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄ 1～4，MgSO₄ 1～4，CaCO₃ 0.5～1，料水比1∶2.5，起始pH值为5.0～7.0。所得到的固体培养物即为灵芝转化麦秸生产的含灵芝酸饲料。该饲料为淡黄色、有一定香味，其中含有菌丝体，该发酵产物中灵芝酸的含量可达0.3～1.5克/升。

本发明的另一目的是提供了一种以麦秸为原料通过灵芝菌种固态发酵生产得到的含灵芝酸饲料用于制备灵芝酸的用途。其特征是用10倍95％乙醇，85℃水浴回流4小时，重复4次，乙醇提取液冷却后合并过滤，真空浓缩至干，得到净膏。净膏用10倍体积氯仿溶解，氯仿提取物用水萃取4次，过滤，真空浓缩至原体积1/10，紧接着用饱和碳酸氢钠溶液萃取5次，碳酸氢钠层用6mol/L盐酸调pH至2～3之间，产生沉淀，所得沉淀用氯仿溶解，浓缩至干得粗灵芝酸。由此方法获得的灵芝酸可用于饲料添加剂，或生产具有调节血糖血脂，预防心脑血管疾病或支气管炎的药物或保健食品。

具体的，本发明制备灵芝酸的方法包括以下步骤：

(1)称取上述含灵芝酸的饲料烘干，用90～100％乙醇作为提取溶剂，料液比为1∶5～15、浸提温度50～90℃、浸提时间1～6h，浸提3次，冷却后过滤，合并滤液，真空浓缩至干得浸膏。

(2)浸膏用氯仿溶解，反复用水萃取3～8次，取氯仿层，过滤，浓缩至原体积的1/10左右，得到浓缩液。

(3)用饱和碳酸氢钠溶液萃取上述浓缩液2～8次，取碳酸氢钠层，用6mol/L盐酸调pH至2～3之间，产生沉淀。

(4)所得沉淀用氯仿溶解，浓缩至干得粗灵芝酸，该灵芝酸的提取方法，其中灵芝酸的总收率可达0.3～1.2毫克/克干饲料，所获得的灵芝酸纯度在30～65％。

本发明经试验研究发现应用本发明的发酵方法生产的含灵芝酸饲料及以此饲料为原料提取的灵芝酸，具有显著增加试验动物(小鼠)体重、机体免疫力和抗病毒能力。应用本发明的灵芝固体发酵的方法，可以大规模或工业化转化麦秸秆生产含灵芝酸饲料，以及用这种饲料作为原料提取灵芝酸，用作饲料添加剂或作为的药物组合物。由于该饲料或其提取物在生产过程中没有添加任何化工原料，所产生活性成分灵芝酸也是灵芝菌种代谢产物，因此没有任何毒副作用，不会在动物体内残留，并为该饲料的应用开创了广阔的前景。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了下述实施例。但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1 灵芝菌种的制备

取江苏野生的正在生长的灵芝子实体，用75％乙醇进行子实体表面消毒后，移入超净工作台，紫外灯照射20min。将解剖刀在酒精灯火焰上灼烧后放人无菌水中降温，确保解剖刀温度不会损伤子实体组织。切取菌盖边缘的生长组织，黄豆大小的小块，切割时不能切透子实体表面组织。用无菌镊子接人试管斜面培养基(即为PDA培养基)，每种组织各接10支，25～28℃暗培养，每天定时观测菌丝生长污染情况，当长至4～10天时，用PDA培养基试管斜面转接。

实施例2 含灵芝酸饲料的制备

1、在新配制的土豆培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入实施例1得到的灵芝菌种，培养温度27℃，待菌丝体长满斜面后，用接种铲将斜面菌种切成5×5mm大小，接8块到装有60mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中，于27℃、150转/分钟摇床培养72小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：麦秸30，玉米粉10，黄豆饼粉10，KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 1，起始pH值为7.0。

2、将上述培养的菌种1L接入装有15L一级种子培养基的25L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为48.5L；维持罐温27℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转每分钟，通风量1∶0.6v/v/m，培养发酵时间85小时。其中种子罐中的一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：麦秸30，玉米粉10，黄豆饼粉3，KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 1，消泡剂0.1，起始pH值为7.0。

4、将15L一级种子菌种接入装有150Kg固体培养基的4m²发酵床中。维持温度27℃，通风量0.5∶1∶1v/v/m，发酵时间144小时。其中发酵培养基组成及其比例为：麦秸120，玉米粉5，麸皮17.5，黄豆饼粉5，KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 1，CaCO₃ 0.5，料水比1∶2.5，起始pH值为5.0。接种量10％(v/w)，培养温度30℃，培养时间90小时。

经上述步骤后得到灵芝发酵液，该含灵芝酸饲料桔黄色，具有香味，灵芝酸含量为0.4g/L，该发酵液菌丝体经水洗、烘干，得干菌丝体，重为18Kg。

实施例3 含灵芝酸饲料的制备

此实施例所用的菌种为实施例1得到的菌种。

1、在新配制的PDA培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入组织分离法得到的灵芝菌种，培养温度32℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中，30℃、100转每分钟摇床培养172小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：麦秸20，玉米粉15，黄豆饼粉3，KH₂PO₄ 6，MgSO₄ 4，起始pH值为8.0。

2、将摇瓶培养的菌种1500mL接入装有22.5L一级种子培养基的50L种子罐中，培养基组成为(单位为克/升)：麦秸20，玉米粉10，黄豆饼粉3，KH₂PO₄ 6，MgSO₄ 4，消泡剂0.8，起始pH值为7.0。维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间90小时。

4、将22.5L一级种子菌种接入装有400Kg固体培养基的13m²发酵床中。维持温度27℃，通风量0.5∶1∶1v/v/m，发酵时间144小时。其中发酵培养基组成及其比例为：：含大量纤维素物质粉末335Kg，玉米粉8Kg，麸皮25Kg，黄豆饼粉15Kg，KH₂PO₄ 7Kg，MgSO₄ 7Kg，CaCO₃ 10Kg，料水比1∶2.5，起始pH值为5.0。接种量10％(v/w)，培养温度30℃，培养时间90小时。

实施例4 含灵芝酸饲料制备

此实施例所用的菌种为实施例1得到的菌种。

1、在新配制的PDA培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入实施例1得到的灵芝菌种，培养温度325℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有750mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中，25℃、120转每分钟摇床培养136小时。其中液体培养基的配方为(单位为克/升)麦秸10，玉米粉15，黄豆饼粉8，KH₂PO₄ 5，MgSO₄ 4，起始pH值为5.0，

2、将上述摇瓶菌种接入装有15L培养基的种子罐中，接种量为每1L摇瓶种子，25℃、120转每分钟摇床培养130小时。培养基组成为(单位为克/升)：麦秸20，玉米粉15，黄豆饼粉3，KH₂PO₄ 2，MgSO₄ 1，消泡剂0.8，起始pH值为7.0。维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间130小时。

3、将15L上述种子菌种接入装有200Kg固体培养基中，置于4m²发酵床上；维持温度25℃，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间180小时得到含灵芝酸饲料，其发酵培养基组成及其比例为：麦秸50，玉米粉10，麸皮15，黄豆饼粉8，KH₂PO₄ 2，MgSO₄ 1，CaCO₃ 1，起始pH值为6.0。

将上述三个实施例中蛋白质和灵芝酸含量分析

称取上述实施例制备得到含灵芝酸的饲料烘干，用10倍95％乙醇，85℃水浴回流4小时，重复4次，乙醇提取液冷却后合并过滤，真空浓缩至干，得到净膏。净膏用10倍体积氯仿溶解，氯仿提取物用水萃取4次，过滤，真空浓缩至原体积1/10，紧接着用饱和碳酸氢钠溶液萃取5次，碳酸氢钠层用6mol/L盐酸调pH至2～3之间，产生沉淀，所得沉淀用氯仿溶解，浓缩至干得粗灵芝酸。蛋白质含量分析采用Folin-酚测定法(李建武陈丽蓉余瑞元等.生物化学实验原理和方法，北京大学出版社，1994)

三次实施例结果见表1，表中数据显示应用本发明工艺生产的含灵芝酸饲料蛋白质含量和灵芝酸含量达到本发明的要求。

表1：不同实施例产品中蛋白质和粗灵芝酸含量

灵芝酸对小鼠免疫调节作用试验。

实验动物：昆明小白鼠，雄性，体重为16-20g，由中科院上海实验动物中心提供，6～8周龄，共40只，连续饲喂30天。三个实施例制得的含灵芝酸饲料或灵芝酸粗品饲喂动物试验结果(下表)(P＜0.05或P＜0.01)。表2中结果显示饲喂本发明生产的含灵芝酸饲料，实验动物体重显著增加，机体免疫各项指标(巨噬细胞活性、NK细胞活性、T淋巴细胞转化OD差值以及INF-α和IL-2)均显著增加，说明本发明的发酵产物具有显著提高机体免疫功能。

表2：不同实施例产品饲喂动物试验结果

注：与对照组比*：p＜0.05

以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。

Claims

1.灵芝转化麦秸生产含灵芝酸饲料的方法，其特征在于以灵芝为出发菌株，以麦秸为原料进行液体摇瓶培养、种子罐扩大培养和固态发酵培养，得到富含灵芝酸的功能性饲料，其中所述的液体摇瓶培养工艺为将斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中，于温度20～40℃，转速90～200转/分钟摇床，培养24～150小时；其中所述的种子罐培养工艺为摇瓶菌种按5～10％v/v的接种量转接入装有液体种子罐扩大培养基的种子罐中进行扩大培养，温度20～40℃，搅拌转速60～200转/分钟，通风量1∶0.3～1∶1.5v/v/m，培养时间24～150小时；其中所述的固态发酵工艺为种子罐菌种按5～20％v/w的接种量转接入装有固体发酵培养基的发酵床上进行固态培养，培养温度20～40℃，培养基厚度为6～30cm，培养时间90～180小时；其中所述液体摇瓶培养基组成为，单位为克/升：麦秸5～30，玉米粉10～25，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄ 1～6，MgSO₄ 1～4，起始pH值为5.0～8.0；其中所述种子罐扩大培养的培养基组成为，单位为克/升：麦秸5～10，玉米粉10～25，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄ 1～6，MgSO₄ 1～4，消泡剂0.1～0.8，起始pH值为5.0～8.0；其中所述发酵培养的培养基组成及其比例为：麦秸粉25～80，玉米粉5～20，麸皮5～20，黄豆饼粉3～10，KH₂PO₄ 1～4，MgSO₄ 1～4，CaCO₃ 0.5～1，料水比1∶2.5，起始pH值为5.0～7.0，所得到的固体发酵物即为含灵芝酸饲料。

2.根据权利要求1所述的方法制备得到的含灵芝酸饲料用于制备灵芝酸的用途，其特征是：称取灵芝转化麦秸生产的含灵芝酸的饲料用10倍95％乙醇，85℃水浴回流4小时，重复4次，乙醇提取液冷却后合并过滤，真空浓缩至干，得到净膏；净膏用10倍体积氯仿溶解，氯仿提取物用水萃取4次，过滤，真空浓缩至原体积1/10，紧接着用饱和碳酸氢钠溶液萃取5次，碳酸氢钠层用6mol/L盐酸调pH至2～3之间，产生沉淀，所得沉淀用氯仿溶解，浓缩至干得粗灵芝酸。

3.根据权利要求2所述的灵芝酸的用途，其特征是用作动物饲料的添加剂或用于制备具有调节血糖血脂，预防心脑血管疾病或支气管炎的药物或保健食品。