CN1375557A - 生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法,确定了第二阶段静止培养过程中的两个关键因子,即起始的氧的传质系数和单位体积发酵液的表面积,并根据这两个关键因子设计了一种静止培养生物反应器,可以高效率生产灵芝酸,灵芝酸含量可达5毫克/100毫克,产量高达1066毫克/升。本发明所述的方法为一种更加具有工业化前景的生产方法,从而为工业化经济生产灵芝酸奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程与技术领域。涉及一种灵芝酸的生产工艺，尤其涉及一种生物反应器中两阶段培养生产灵芝酸的工艺。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌。灵芝一直被用作包治百病的“灵丹妙药”而受到人们的信赖。现代医学研究发现灵芝中所含有效成分主要为灵芝多糖和灵芝酸。据最近的文献报道，如：[1]El-Mekkaway S，R.Meselhy M，Nakamura N，Tezuka Y，Hattori M，Kakiuchi N，Shimotohno K，Kawahata T，Otake T.Anti-HIV-1 and anti-HIV-proteasesubstances from Ganoderma lucidum.Phytochemistry 1998；49：1651-1657.[2]Min BS，Gao JJ，Nakamura N，Hattori M.Triterpenes from the spores ofGanoderma lucidum and their cytotoxicity against Meth-A and LLC tumor cells.Chem Pharm Bull 2000；48：1026-1033.[3]Wu TS，Shi LS，Kuo SC.Cytotoxicity of Ganoderma lucidum triterpenes.J NatProd 2001；64：1121-1122.
灵芝酸具有抗癌和抗艾滋病病毒等疗效。在灵芝酸的药用价值被广泛揭示的同时，灵芝酸的产量成为抑制灵芝应用的瓶颈，因为在自然界中野生的灵芝十分稀少，且其中灵芝酸含量仅为1毫克/100毫克干重，远不能满足人们的需要。通过灵芝细胞的深层发酵，所获得的灵芝酸产量仍然较低，如：
日本专利：公开特许公报特开平4-304890，5pp公开了灵芝酸的发酵生产工艺，但所得的产物中灵芝酸的含量仅为0.46-1.0毫克/100毫克干重；
专利(公开号：CN1264743A)中发明人提供了一种“液体法同时生产灵芝多糖和灵芝酸工艺”，其中涉及到一种“液体好氧发酵——液体静止培养法”，但该方法只考察了第二阶段培养过程中振荡与静止对灵芝酸生产的影响，没有确定影响灵芝酸生产的关键性因素，无法在反应器的放大过程中得到满意的结果。实践证明，该方法尚有改进的余地，且该方法仅适用于在摇瓶中灵芝的两阶段培养。
对于工业化生产而言，从摇瓶到反应器的放大十分关键，只有确定第二阶段培养过程中的关键因子，才能在反应器中成功地进行放大，才能使其体现应用价值。
综上所述，至今尚无成熟的两阶段培养生产灵芝酸的工艺。因此，尽快开发研究一种两阶段培养生产灵芝酸的技术，并成功地在生物反应器中进行放大，是人们所十分期望的。
发明内容
本发明的目的在于通过大量的实验确定灵芝细胞第二阶段培养过程中的关键因子，并根据关键因子设计一种能很好满足灵芝酸生产最适条件的生物反应器，解决了从摇瓶到反应器的放大问题，使摇瓶中的实验结果在反应器中得以重现，从而为大规模、低成本生产灵芝酸奠定基础。
实现本发明目的技术方案包括如下步骤：
1.关键因子的确定
本发明人经大量实验研究发现：在第二阶段培养过程中，起始的氧的传质系数严重地影响灵芝细胞的生长和灵芝酸的合成。
由于氧传递的原因，当起始的氧的传质系数取不同的数值时，在同一操作条件下，反应产物将获得不同的结果，具体结果见下表：
起始的氧的传质系数 细胞产量 灵芝酸含量 灵芝酸产量
(/小时) (克/升) (毫克/100毫克干重) (毫克/升)
16.4 15.6 1.3 208.4
9.4 18.5 1.3 238.1
3.2 17.4 1.5 266.9
2.1 15.6 3.3 516.2
0.9 12.6 3.1 395.2。
实验结果表明，当第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时，灵芝酸的含量和产量均达到最高值。这说明灵芝酸生产的最适条件是一种微氧环境。
当第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时，细胞的形态发生了很大的变化，整个摇瓶中的细胞分为两层，上层为白色的菌丝体，而下层为黄色的菌球，而且上层白色的菌丝体中灵芝酸含量较高、对其生产相当重要。故本发明人认为，也应该考察单位体积发酵液的表面积对灵芝细胞的生长和灵芝酸的生产的影响。
当单位体积发酵液的表面积取不同的数值时，在同一操作条件下(第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时)，反应产物将获得不同的结果，具体结果见下表：
单位体积发酵液的表面积 细胞产量 灵芝酸含量 灵芝酸产量
(平方厘米/毫升发酵液) (克/升) (毫克/100毫克干重) (毫克/升)
0.24 13.4 3.3 440.0
0.77 22.1 3.0 666.9
1.53 21.0 3.0 619.6
实验结果表明，当第二阶段单位体积发酵液的表面积为0.24平方厘米/毫升发酵液时，灵芝细胞的生长受到严重地抑制，从而降低灵芝酸的产量。当第二阶段单位体积发酵液的液体表面积为0.77平方厘米/毫升发酵液时，灵芝酸的产量达到最高值。
上述实验结果表明：起始的氧的传质系数和单位体积发酵液的表面积是第二阶段培养过程高产灵芝酸的关键性因子。
2.生物反应器中灵芝细胞两阶段培养
本发明所使用的微生物：
用于生产所述的灵芝多糖和灵芝酸的微生物为灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌种，具体的菌株如下：
67军军直卫生所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.75的菌株；
上海吴淞中学发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.110的菌株；
日本京大发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCNo.5.533的菌株；
中国贵州发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCNo.5.616的菌株；
中科院微生物研究所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.644的菌株；
中国农业科学院发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.653的菌株。
上述菌种的有关性质可以参阅中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)菌种目录，本发明不再赘述。
培养方法：
将振荡培养或通气搅拌培养1～12天后的发酵液转入生物反应器中，开始第二阶段的静止培养，第二阶段培养是在起始氧体积传质系数为0.05～50/小时和每毫升发酵液的液体表面积为0.05～50.0平方厘米条件下进行的，在静止培养第6～60天结束培养，收获菌丝体和发酵液。在第二阶段细胞量增加，同时灵芝酸的产量也增加。
上述两阶段培养中的第二阶段培养是在多层生物反应器中进行，所述的多层生物反应器为一长方形容器(1)，在其一侧有接种口(4)，在容器(1)内有与容器(1)内壁固定连接的隔板(2)，隔板(2)近接种口(4)一端为与隔板(2)和容器(1)内壁固定连接的档板(3)。其中档板(3)的高度为0.1～5.0厘米，档板(3)与近接种口(4)一端容器(1)内壁之间有间距为0.1～5.0厘米。
附图说明
图1多层生物反应器结构示意图。
其中：
1-长方形容器；2-隔板；3-档板；4-接种口。隔板(2)将反应器分成多
层，附图中的虚线表示该生物反应器可以是单层或多层。
具体实施方法
第一阶段培养：在搅拌罐中，采用专利文献CN1316519A中的方法进行。
第二阶段培养：将生物反应器直立，即接种口(4)向上，将第一阶段的发酵液由接种口(4)加入容器(1)中后，将反应器在培养处按照档板(3)向上的方向迅速平放，使反应器的底层与隔板上层的培养液分布均匀，在25～30℃暗培养5～60天后结束培养，收获菌丝体和发酵液。
胞外多糖通过乙醇沉淀法获得。胞内多糖通过碱溶解菌丝体后，乙醇沉淀法获得。灵芝酸通过乙醇水溶液提取后经过初步纯化获得。以上所说的方法均为现有技术，在许多文献中已有阐述，本发明不再赘述。
本发明获得的灵芝酸含量和产量均为文献报道最高值。通过本方法可以在生物反应器中以较高产率生产灵芝酸。如在工业上实现灵芝酸这种有效成分在生物反应器中的高产，必将大幅度提高生产过程的经济效益，也会带来可观的社会效益。由此可见，本发明所述的方法，与现有技术相比，确为一种更加接近工业化生产规模，更加具有工业化前景的生产方法。以下将通过实施例对本发明的有关细节作进一步的说明。
实施例1
采用的菌种：CGMCC No.5.616；
摇瓶两阶段培养：
第一阶段培养：发酵液体培养基中含有乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母膏5克/升，KH2PO4 1克/升，MgSO4 0.5克/升，VB1 0.05克/升。发酵温度为30℃，接种19毫克菌丝体于50毫升培养基/250毫升摇瓶中，120转/分钟回旋培养；
第二阶段培养：第一阶段培养4天后转入第二阶段，90转/分钟回旋培养，此时第二阶段起始的氧的传质系数为9.4/小时，每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米，继续培养，培养16天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，并进行以下分析测定：
在15000rpm下离心分离获得细胞干重18.51克/升；发酵液中加入4倍体积的95％的乙醇，混合过夜，在10000rpm下离心沉淀得胞外灵芝多糖。经1摩尔/升NaOH溶解，采用浓硫酸-苯酚法测定多糖产量为0.99克/升；
菌丝体100毫克，加入1摩尔/升NaOH溶解，浓硫酸-苯酚法测定胞内多糖为9.89毫克/100毫克干重，产量为1.83克/升。
菌丝体在45℃干燥，取100毫克，加入3毫升50％乙醇提取灵芝酸两次，在4000rpm下离心，上清液50℃干燥，用2毫升水溶解，并用2毫升氯仿萃取，取氯仿相，再用5％小苏打2毫升萃取，取水相，加入2摩尔/升盐酸至pH＝3，加入氯仿，取氯仿相，挥干后用乙醇溶解后紫外比色法测定灵芝酸，计算得含量为1.29毫克/100毫克干重，产量为238.1毫克/升。
实施例2
摇瓶两阶段培养：
第一阶段培养：同实例1中的第一阶段培养；
第二阶段培养：第一阶段培养4天后转入第二阶段培养，静止培养，此时第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时，每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米。培养24天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为15.60克/升，0.44克/升，1.18克/升(胞内含量7.56毫克/100毫克干重)，516.2毫克/升(胞内含量3.31毫克/100毫克干重)。
实施例3
摇瓶两阶段培养：
第一阶段培养：同实例1中的第一阶段培养；
第二阶段培养：第一阶段培养4天后转入第二阶段，将第一阶段培养的发酵液混合，将100毫升发酵液转入250毫升摇瓶中，30转/分钟回旋培养，此时第二阶段起始的氧的传质系数为0.9/小时，每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米。培养28天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为12.58克/升，0.55克/升，0.71克/升(胞内含量5.64毫克/100毫克干重)，354.8毫克/升(胞内含量2.28毫克/100毫克干重)。
实施例4
摇瓶两阶段培养：
第一阶段培养：同实例1中的第一阶段培养；
第二阶段培养：当第一阶段培养4天后转入第二阶段，将第一阶段培养的发酵液混合，将50毫升发酵液转入50毫升摇瓶中，80转/分钟回旋培养，此时第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时，每毫升发酵液的液体表面积为0.24平方厘米。培养20天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为11.63克/升，0.23克/升，0.73克/升(胞内含量6.28毫克/100毫克干重)，440.0毫克/升(胞内含量3.78毫克/100毫克干重)。
实施例5
摇瓶两阶段培养：
第一阶段培养：同实例1中的第一阶段培养；
第二阶段培养：当第一阶段培养4天后转入第二阶段，将第一阶段培养的发酵液混合，将50毫升发酵液转入500毫升摇瓶中，静止培养，此时第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时，每毫升发酵液的液体表面积为1.53平方厘米。培养8天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为21.02克/升，0.26克/升，1.80克/升(胞内含量8.75毫克/100毫克干重)，619.6毫克/升(胞内含量2.95毫克/100毫克干重)。
实施例6
单层静止培养反应器两阶段培养法：
第一阶段培养：在搅拌罐中，采用专利文献CN1316519A中的方法进行；
第二阶段培养：第一阶段培养4天后转入第二阶段，在单层生物反应器中转入第一阶段的发酵液，发酵液的量根据每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米而确定，静止培养，此时第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时，每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米。培养20天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为20.38克/升，0.40克/升，1.60克/升(胞内含量7.85毫克/100毫克干重)，934.7毫克/升(胞内含量4.59毫克/100毫克干重)。
实施例7
双层静止培养反应器两阶段培养法：
第一阶段培养：在搅拌罐中，采用专利文献CN1316519A中的方法进行；
第二阶段培养：第一阶段培养4天后转入第二阶段，在两层生物反应器的每层均转入第一阶段的发酵液，每层发酵液的量根据每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米而确定，静止培养，此时第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时，每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米。培养20天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为20.33克/升，0.41克/升，1.69克/升(胞内含量8.31毫克/100毫克干重)，989.3毫克/升(胞内含量4.87毫克/100毫克干重)。
实施例8
三层静止培养反应器两阶段培养法：
第一阶段培养：在搅拌罐中，采用专利文献CN1316519A中的方法进行；
第二阶段培养：第一阶段培养4天后转入第二阶段，在三层生物反应器的每层均转入第一阶段的发酵液，每层发酵液的量根据每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米而确定，静止培养，此时第二阶段起始的氧的传质系数为2.1/小时，每毫升发酵液的液体表面积为0.77平方厘米。培养20天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为21.27克/升，0.40克/升，1.75克/升(胞内含量8.23毫克/100毫克干重)，1066.2毫克/升(胞内含量5.01毫克/100毫克干重)。
实施例9～14
采用菌种分别为CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCCC No.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653中的一种；培养方法与实施例6相同，分析测试结果：细胞干重分别为：19.05克/升、17.73克/升、6.89克/升、21.27克/升、7.43克/升和6.4克/升；胞外多糖产量分别为：0.44克/升、0.16克/升、0.50克/升、0.40克/升、0.24克/升和0.70克/升；胞内多糖产量分别为：0.94克/升、1.3克/升、0.26克/升、1.75克/升、0.26克/升和0.23克/升；灵芝酸产量分别为：967.3毫克/升、953.2毫克/升、801.2毫克/升、1066.2毫克/升、834.3毫克/升和780.8毫克/升。
Claims (6)
1.一种生物反应器中两阶段培养生产灵芝酸的方法，采用的微生物为灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.菌种，其特征在于：
将振荡培养或通气搅拌培养1～12天后的发酵液转入静止培养生物反应器中，开始第二阶段的静止培养，培养温度为20～35℃，第二阶段培养的起始氧传质系数为0.05～50/小时、每毫升发酵液的表面积为0.05～50.0平方厘米，在培养第6～60天结束培养，收获菌丝体和发酵液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二阶段培养为暗培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的静止培养生物反应器为一长方形容器(1)，在其一侧有接种口(4)，在容器(1)内有与容器(1)内壁固定连接的隔板(2)，隔板(2)近接种口(4)一端为与隔板(2)和容器(1)内壁固定连接的档板(3)。
4.如权利要求3所述的静止培养生物反应器，其特征在于，档板数可以为0，即单层反应器，档板数也可以为n，成为多层、即(n+1)层反应器。
5.如权利要求3所述的静止培养生物反应器，其特征在于，档板(3)与近接种口(4)一端容器(1)内壁之间的间距为0.1～5.0厘米。
6.如权利要求3所述的静止培养生物反应器，其特征在于，档板(3)的高度为0.1～5.0厘米。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |