CN1594541A - 一种虫草真菌及其分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虫草真菌及其分离方法。本发明从野生大团囊虫草子实体上分离并筛选出单一囊菌。本发明分离该虫草真菌的方法分为选择大团囊虫草子实体、消毒灭菌、接种和培养等步骤。

Description

一种虫草真菌及其分离方法

技术领域

本发明涉及一种药用真菌，特别地，涉及一种大团囊虫草(Cordycepsophioglossoides)纯菌株及其分离的方法。

背景技术

由于野生资源的匮乏和生长环境的恶化，许多名贵药用真菌濒临灭绝，如何挽救这些宝贵的药用资源、满足药物开发需要显得尤为重要，利用微生物技术分离筛选出活性菌株，采用现代发酵技术进行大规模的药材生产很有必要。

大团囊虫草是一种名贵中草药，我国南方地区民间使用较为普遍，具有悠久的历史。其子实体内含丰富的生物碱，总称麦角碱，在治疗妇科疾病方面药用价值极高，主要用于治疗月经不调、痛经、闭经等病，对产后出血、促进产后子宫复原也具有显著效果。

发明内容

本发明的目的在于从一种名贵药用虫草真菌的野生子实体上分离得到单一菌株，并根据其形态特征及基于18S rDNA序列的系统进化分析对其进行鉴定，从而使得采用现代发酵技术进行大规模的药材生产成为可能。

为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：本发明分离出的虫草真菌，其特征在于，它是从大团囊虫草(Cordyceps ophioglossoides)子实体上分离纯化得到的该真菌的纯菌株，其18S rDNA具有SEQ ID No.1的序列。保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC No.1146。

本发明还提供了一种分离权利要求1所述的药用虫草真菌的方法，其特征在于，分为以下步骤：(1)选择大团囊虫草子实体：选子囊果大、柄短、八九分成熟的大团囊虫草子实体，切去盖两基部；(2)消毒灭菌：在无菌箱内以浓度为0.1％的升汞水浸泡，再用浓度为75％酒精棉球擦拭菌盖与菌柄，进行表面消毒；3)接种：接种时，将子实体切开，在其萌盖和菌柄交界处，挑取一小块组织；移接到马铃薯蔗糖基础培养基PSA上；4)培养：在20℃～30℃温度下培养7～10天，待组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到大团囊虫草菌种。

本发明具有以下技术效果：大团囊虫草是我国传统的具有药用价值的大型真菌，目前只有对野生资源的利用，以致药源锐减。本发明利用从野生植株上分离纯化得到纯的大团囊虫草菌株，并通过传统的形态学方法、发酵方法以及现代基因手段进行鉴定，为利用此菌进行大规模发酵生产该药材、缓解野生资源的匮乏提供了基础和可能。

本发明的大团囊虫草菌已在中国专利局指定的保藏单位“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏日期为2004年5月14日，保藏编号为：CGMCC No.1146。

具体实施方式

下面详细说明本发明。本发明的虫草真菌的分离方法如下

本发明的大团囊虫草野生植株寄生在地下生长的大团囊菌(Elaphomycesgranulatus Fr)的子实体上，子囊果球形，直径为1～4.5厘米，褐色，坚硬；子座根状生于基物外，直立，头状，有长柄多分枝，高矮不等，一般2～15厘米，棍棒状，褐色。子囊柄不易水解，子囊孢子线形。分离得到的菌株在固体平板上的形态特征，菌落丛生、白色丝状菌丝体。液体培养时菌液变混，产生球状菌丝体，初菌丝体为白色，后渐变为褐色。

本发明采用组织分离培养法，选子囊果大、柄短、八九分成熟的野生品种，切去盖两基部，在无菌箱内以体积百分比浓度为0.1％的升汞水浸10～20分钟，再用体积百分比浓度为75％酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次，进行表面消毒。接种时，将种子实体切开，在萌盖和菌柄交界处，挑取一小块组织；移接到马铃薯蔗糖基础培养基(PSA)上。在20℃～30℃温度下培养7～10天，待组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到大团囊虫草菌种。

下面进行虫草真菌菌种的鉴定

(1)虫草真菌的形态及理化特征

群体形态：固体培养基上，菌落丛生、产生白色丝状菌丝体、菌丝发达，液体振荡培养时产生球状菌丝体，初菌丝体为白色，后渐变为褐色。

个体形态：菌丝体具有规则的分隔，隔膜有简单隔孔，有伏鲁宁体，细胞壁双层，内层厚而透明，外层薄而密集，子囊孢子线形。

理化特征：对双糖的利用效果比单糖要好，可以利用淀粉作为碳源。不能固定氮素，对无机氮源的利用效果较差。生长过程中产生一种抗生素—抗真菌素(ophiocordin)。

该菌株的培养特征及形态特征见表1。

固体培养特征	菌落	丛生
			菌丝体	有
	菌丝体形状	丝状，放射状
			菌丝体颜色	白色
	产生色素	无
			液体培养特征	混浊	有
菌丝体	有
		菌丝体形状		集结成球状
产生色素	初为白色后变为褐色
		个体特征		孢子	有
孢子特征	线状
			菌丝体有无间隔	有隔膜，隔膜上有孔
细胞壁形态	双层，内层厚而透明，外层薄而密集
			伏鲁宁体	有

                              表1

(2)18S rDNA序列的系统进化分析

测定大团囊虫草真菌(CGMCC No.1146)18S rDNA部分的序列

表2为本发明所述的依据虫草真菌序列从GeneBank中调出的部分相关菌株的18S rDNA序列的登录号。

	序列登录号	相似度(％)
			Cordyceps sphingum	AY245673.1	99
Cordyceps militaris	AY245671.1	99
			Paecilomyces canadensis	AY245666.1	99
Cordyceps sinensis	AY245670.1	99
			Cordyceps heteropoda	AY245656.1	99
Cordyceps brongniartii	AY245653.1	99
			Phytocordycepsninchukispora	AY245668.1	99
Cordyceps japonica	AY245669.1	99
			Cordyceps isarioides	AY245657.1	99
Cordyceps subsessilis	AY245665.1	99
			Cordyceps memorabilis	AY245658.1	99
Cordyceps agriota	AY245651.1	99

                         表2

结合上述形态特征及18S rDNA序列分析，可以确定该菌为子囊菌纲、球壳菌目、麦角菌科、虫草属真菌，从而确定分离得到的菌株确为大团囊虫草菌。大团囊虫草菌18S rDNA部分的序列SEQ ID No.1表：

<110>浙江大学

<120>一种虫草真菌及其分离方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1519

<212>DNA

<213>Cordyceps sp.

<400>1

aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa gcaattatac agcgaaactg cgaatggctc     60

attatataag ttatcgttta tttgatagta ccttactact tggataaccg tggtaattct    120

agagctaata catgctaaaa atcccgactt cggaagggat gtatttatta gattaaaaac    180

caatgccctc tgggctctct ggtgattcat gataacttct cgaatcgcat ggccttgcgc    240

cggcgatggt tcattcaaat ttcttcccta tcaactttcg atgtttgggt agtggccaaa    300

catggttgca acgggtaacg gagggttagg gctcgacccc ggagaaggag cctgagaaac    360

ggctactaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg    420

tagtgacaat aaatactgat acagggctct tttgggtctt gtaattggaa tgagtacaat    480

ttaaatccct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt    540

ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt gtggttaaaa agctcgtagt tgaaccttgg    600

gcctggctgg ccggtccgcc tcaccgcgtg tactggtccg gccgggcctt tccctctgtg    660

gaaccccatg cccttcactg ggtgtggcgg ggaaacagga cttttacttt gaaaaaatta    720

gagtgctcca ggcaggccta tgctcgaata cattagcatg gaataatgaa ataggacgtg    780

cggttctatt ttgttggttt ctaggaccgc cgtaatgatt aatagggaca gtcgggggca    840

tcagtattca attgtcagag gtgaaattct tggatttatt gaagactaac tactgcgaaa    900

gcatttgcca aggatgtttt cattaatcag gaacgaaagt taggggatcg aagacgatca    960

gataccgtcg tagtcttaac cataaactat gccgactagg gatcggacga tgttattttt   1020

tgactcgttc ggcaccttac gagaaatcaa agtgcttggg ctccaggggg agtatggtcg    1080

caaggctgaa acttaaagaa attgacggaa gggcaccacc aggggtggag cctgcggctt    1140

aatttgactc aacacgggga aactcaccag gtccagacac aatgaggatt gacagattga    1200

gagctctttc ttgattttgt gggtggtggt gcatggccgt tcttagttgg tggagtgatt    1260

tgtctgctta attgcgataa cgaacgagac cttaacctgc taaatagccc gtattgcttt    1320

ggcagtacgc tggcttctta gagggactat cggctcaagc cgatggaagt ttgaggcaat    1380

aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact gacggagcca    1440

gcgagtactc ccttggccgg aaggcccggg taatcttgtt aaactccgtc gtgctgggga    1500

agagcattgc aattattgc                                                 1519

Claims (4)

1、一种虫草真菌，其特征在于，它是从大团囊虫草(Cordycepsophioglossoides)子实体上分离纯化得到的该真菌的纯菌株，其18S rDNA具有SEQ ID No.1的序列。保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC No.1146。

2、根据权利要求1所述的药用虫草真菌，其特征在于，所述大团囊虫草子实体的形态为：大团囊虫草寄生在地下生长的大团囊菌(Elaphomycesgranulatus Fr)的子实体上，子囊果球形，直径为1～4.5厘米，褐色，坚硬；子座根状生于基物外，直立，头状，有长柄多分枝，高矮不等，一般2～15厘米，棍棒状，褐色；子囊柄不易水解，子囊孢子线形。

3、根据权利要求1所述的药用虫草真菌，其特征在于所述虫草真菌的形态和生理特征及培养条件为：

1)分离得到的菌株在固体平板上的形态特征为：菌落丛生、白色丝状菌丝体；液体培养时菌液变混，产生球状菌丝体，初菌丝体为白色，后渐变为褐色。

2)生理特征为：好氧菌，对双糖作为碳源的效果比单糖好，不能固定氮素，对无机氮源利用较差，次生代谢过程中产生抗菌素ophiocordin。

3)培养条件为：生长温度为0～40℃，最适生长温度20～30℃，在pH4～8的环境下都能生长，最适生长的pH为4.2～6.5。

4、一种分离权利要求1所述的药用虫草真菌的方法，其特征在于，分为以下步骤：

1)选择大团囊虫草子实体：选子囊果大、柄短、八九分成熟的大团囊虫草子实体，切去盖两基部。

2)消毒灭菌：在无菌箱内以浓度为0.1％的升汞水浸泡，再用浓度为75％酒精棉球擦拭菌盖与菌柄，进行表面消毒。

3)接种：接种时，将子实体切开，在其萌盖和菌柄交界处，挑取一小块组织；移接到马铃薯蔗糖基础培养基PSA上。

4)培养：在20℃～30℃温度下培养7～10天，待组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到大团囊虫草菌种。