CN1279159C

CN1279159C - 白耙齿菌cz－81菌株及其人工培养方法

Info

Publication number: CN1279159C
Application number: CN 200310115915
Authority: CN
Inventors: 宋启印
Original assignee: 杨静
Current assignee: Tonghua Jitong Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2023-12-12
Also published as: CN1626648A

Abstract

白耙齿菌CZ-81菌株及其人工培养方法，涉及一种真菌生物工程深层发酵培养的高性能菌种，即白耙齿菌“CZ-81”菌株的培养方法。CZ-81菌株CGMCC No.1016。其人工培养方法在于包括菌种培养，即斜面菌种培养；摇瓶菌种培养；种子罐菌种培养；和发酵生产培养及放罐后的提取加工。白耙齿菌CZ-81菌株，是经过多年选育而培育成的稳定性强，代谢能力高，安全性高的菌种。本菌株传代20代不易退化，且代谢指标高于原初筛菌株的1倍以上。整个发酵培养时间缩短了近20%的时间。既提高了有效活性成份的含量，又缩短了发酵培养时间，降低了生产成本。

Description

白耙齿菌CZ-81菌株及其人工培养方法

技术领域：

本发明涉及一种真菌生物工程深层发酵培养的高性能菌种，即白耙齿菌“CZ-81”菌株的培养方法。

背景技术：

白耙齿菌Irpex lacteus Fr.属齿菌科，耙齿菌属、白耙齿菌种的一种真菌，别名白囊孔。异名：Hirschioporus lacteus(Fr.)Teng；邓叔群，中国的真菌，484.1963。其子实体生于阔叶树的枯立木或枯倒木上。形态特征：担子果(子实体)平伏，扩展，白色，软革质；或平伏而反卷，反卷部分为8～15×10～20mm。有时倒生，呈复瓦状叠生，扇形，有狭小的基部，横径2～4cm，原2～3mm；盖面乳白色，有短绒毛，有绢丝状光泽，有环纹，边缘薄，下弯，波状至浅裂。菌肉白色，原1mm左右。刺呈耙齿状，短，不整齐，白色至黄白色，长1～2cm，孢子椭圆形，平滑，无色，4～5×2～3mm。囊状体棒形或纺锤形，50～150×5～10μm，有时披有结晶，主要分布于长白山林区和黑龙江、河北、山西、甘肃、江西、福建、云南和西藏等省区^[1]。

由白耙齿菌分离纯化成菌株的发酵提取物对治疗慢性肾小球肾炎有很好的临床效果，现有的菌株的稳定性差，代谢功能弱的不足，如何人工培养出高品质的白耙齿菌菌株，一直没有得到好的培养方法。

发明内容：

本发明需要解决的技术问题是提供一种性能稳定，抗老化能力强，生物代谢性能高的白耙齿菌菌株。

本发明同时公开了该菌株的培养方法。

本发明的技术方案如下：

本发明所提供的白耙齿菌Irpex lacteus Fr.其菌种为CZ-81菌株，是从中国长白山林区针阔混交林带的阔叶树枯立木或枯倒木上长有白耙齿菌的子实体，经分离、纯化、筛选和长期选育而得到的。

生物体的共同生长发育规律是由幼龄期到发育旺盛期，最终到衰老期，直至衰亡。真菌类生物也是如此，真菌类生物发酵工程原理，就是应用发酵法，促进菌丝的不断繁殖及代谢产物的积累，提取有效活性成分，为制药提供可靠的原料。由于长期生产扩繁菌种，势必造成菌种的退化。因此，提供一种稳定性好，活力强，生长发育速度快，代谢性能高，抗老化性能强的菌种，对发酵生产是重要的关键技术问题。

该菌种已于2003年9月25日，在中国科学院微生物菌种保藏委员会保藏，保藏号：CGMCC No.1016。

菌种应用标准：

1、菌种来源说明：CZ-81菌株系从长白山林区朽木上，长有白耙齿菌的子实体中经分离、纯化、筛选，并通过系统选育考核而得到的性能稳定的菌株。CZ-是指长春中医学院的缩写字头。

2、菌种的形态标准

(1)外观形态

斜面菌种：菌落呈白色，菌丝为白色棉絮状，并沿试管壁向上延伸、茂密。菌丝生长发育速度快，5天就可长满全斜面。

摇瓶菌种：菌液澄明、黄褐色，菌丝呈放射性球状。味感有浓厚水果香味。

种子罐菌种：同摇瓶种子形态，但菌球中的菌丝致密，干重增加，味感同上。

(2)镜检形态

通过16×100倍生物显微镜的检查，菌丝着色深(美兰单染色法)，均匀，分枝多，呈网状，粗壮，锁状联合明显可见，无杂菌污染。

3、菌种应用的一般标准

菌种在生产使用时必须按以下标准执行：

(1)使用新扩繁的新鲜菌种(指新扩繁的菌种在2～4℃冰箱保存，其斜面菌种种龄勿超过30日)

(2)使用冰箱保存的备用菌种，要先行活化12小时以上，方可使用。

(3)放2～4℃冰箱长期保存的斜面菌种，必须在120天左右转管理一次。经转管扩繁达到菌种规定标准(指外观、镜检形态和活力)时再使用。

(4)要使用来源清楚，有详细记录，性能可靠的，符合标准规定要求的，CZ-81菌株的优良菌种。

(5)如出现斜面菌种的菌落稀薄，白色絮状菌丝纤细、变色，又很少有沿管壁向上延伸的菌丝，说明菌种已老化、活力已降低，不可再使用。

(6)CZ-81菌株性能稳定，但长期传代势必造成菌势降低，本菌株20代以内，不易退化。超过20代则明显逐渐老化，不可再使用，必须更换性能可靠的“CZ-81”新菌种，确保产品质量。

白耙齿菌CZ-81菌株培养方法包括斜面菌种培养、摇瓶菌种培养、种子罐菌种培养和发酵罐培养及放罐后的提取加工，其中，培养温度均为26±1℃，斜面菌种培养的培养基为：葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.2％，VB10.05％；摇瓶菌种培养的培养基为：葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，酵母浸膏0.5％，KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.15％；种子罐菌种培养和发酵罐培养的培养基均为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，豆饼粉浸汁5％，MgSO₄0.15％，KH₂PO₄0.2％。

4、菌种的分级技术管理标准

(1)一级斜面菌种：

培养基：综合PDA培养基：葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.2％，VB10.05％，PH6.5(消前)。

设专人、专箱(冰箱)，专项记录管理。对菌种性能和老化情况随时考查、记录。做好转管传代标记和记录，生产使用的菌种属第几代(传代数)必须清楚。发现异常和老化的菌种要及时淘汰，不可应用于生产。

斜面菌种培养温度26±1℃，110-130小时菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用。

(2)二级摇瓶菌种：

培养基：葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，酵母浸膏0.5％，KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.15％，PH6.5(消前)。灭菌备用。

取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌过的摇瓶培养基中(按1∶6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，26±1℃温控培养，摇瓶转数为160-260r/min(旋转式)，当菌球体积即湿重占30％以上(取100ml培养液放量筒中，静止15分钟，菌球沉降的百分率)；镜检达到菌种项下标准，味感有浓厚水果香味，无杂菌污染，培养时间为90-96小时，可转入种子罐发酵培养。

(3)三级种子罐菌种

培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，豆饼粉浸汁5％，MgSO₄0.15％，KH₂PO₄0.2％，PH6.5(消前)。

取新鲜(冰箱保存备用者，勿超过一周)摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌过的种子罐培养基中，26±1℃温控培养，通无菌过滤空气搅拌，其流量为1∶0.4vvm，罐压0.5kg/cm²。当菌球湿重占60％以上；镜检菌丝着色深，均匀，粗壮，分枝多，呈网状，锁状联合明显可见；发酵液呈黄褐色、澄明，有浓厚水果香味；PH降至5.5-6；氨基氮(N)降至3040％，还原糖(C)降至3-5％；培养时间为68-76小时；无杂菌污染时，可转入发酵罐接种培养。(发酵罐培养接种量按10％的比例接种)

5、生产工艺流程及代谢能力考核标准

应用本菌株采用以下工艺流程：

1)对放罐后的发酵液经检测“白耙齿菌多糖”(粗多糖)含量不应少于1.5～2mg/ml。

2)经后处理加工提取制成的干品“多糖”含量不得少于150～200mg/g(3.5-二硝基水杨酸法检测)

生产应用效果：

[发酵罐培养及检验要求：]

1、出发菌种：“CZ-81菌株”

2、培养基：同种子罐培养基

3、PH值6.5(消前)

4、接种量：10％

5、发酵罐培养条件：

温度：26±1℃

空气流量：1∶0.4vvm

罐压：0.5kg/cm²

6、放罐标准

(1)外观：菌液澄明、黄褐色、菌丝湿重(菌球)达70％以上。

(2)味感：有微水果香味。

(3)镜检：菌丝着色浅、较细、分枝减少，锁状联合少见(或无)，偶见空孢。

(4)生化指标：

PH值降至4.5～5左右

C源(还原糖)降至2～2.5％。

N源(氨基氮)降至20％。

(5)多糖含量：

发酸液检测(放罐时)——含量在1.5mg/ml以上。

提取加工后干品——含量在200mg/g以上。

(6)培养时间：36～40h。

本发明提供的白耙齿菌CZ-81菌株，是经过多年选育而培育成的稳定性强，代谢能力高，安全性高的菌种。该菌种在规范实施过程中不危及人类健康或动、植物病原或污染环境。经系统考核，本菌株传代20代不易退化，且代谢指标高于原初筛菌株的1倍以上。同时在深层发酵培养工艺及其各生产环节控制上更加科学、合理，整个发酵培养时间缩短了近20％的时间。即提高了有效活性成份的含量，又缩短了发酵培养时间，降低了生产成本。

并经安全性、药理学检测与原初筛菌种的发酵代谢产物相比，无异常所见。具有较高的应用价值，利用新选育的CZ-81菌株的发酵产物，提取的耙齿菌多糖，为制作治疗慢性肾炎药物，提供一个长远的、科学的、可靠的药源途径。

具体实施方式：

实施例

从中国长白山林区针阔混交林带的阔叶树枯立木或枯倒木上长有白耙齿菌的子实体中经分离、纯化、筛选，并通过系统选育考核而得到的性能稳定的菌株，培养管理方法为：

(1)一级斜面菌种：

斜面菌种培养温度26℃，120小时菌丝长满斜面，放冰箱(3℃)保存备用。

(2)二级摇瓶菌种：

取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌过的摇瓶培养基中(按1∶6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，26℃温控培养，摇瓶转数为160-260r/min(旋转式)，当菌球体积即湿重占30％以上(取100ml培养液放量筒中，静止15分钟，菌球沉降的百分率)；镜检达到菌种项下标准，味感有浓厚水果香味，无杂菌污染，培养时间为93小时，转入种子罐发酵培养。

(3)三级种子罐菌种

取新鲜(冰箱保存备用者，勿超过一周)摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌过的种子罐培养基中，26℃温控培养，通无菌过滤空气搅拌，其流量为1∶0.4vvm。当菌球湿重占60％以上；镜检菌丝着色深，均匀，粗壮，分枝多，呈网状，锁状联合明显可见；发酵液呈黄褐色、澄明，有浓厚水果香味；PH降至5.5；氨基氮(N)降至35％，还原糖(C)降至4％；培养时间为70小时；无杂菌污染时，可转入发酵罐接种培养。(发酵罐培养接种量按10％的比例接种)

对放罐后的发酵液经检测“白耙齿菌多糖”(粗多糖)含量为2mg/ml。

经后处理加工提取制成的干品“多糖”含量为200mg/g(3.5-二硝基水杨酸法检测)。

Claims

1、白耙齿菌CZ-81菌株(lrpes lacteus Fr.)CGMCC No.1016。

2、权利要求1所述的白耙齿菌CZ-81菌株人工培养方法，其人工培养方法在于包括斜面菌种培养、摇瓶菌种培养、种子罐菌种培养和发酵罐培养及放罐后的提取加工，其中，培养温度均为26±1℃，斜面菌种培养的培养基为：葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄ 0.2％，VB1 0.05％；摇瓶菌种培养的培养基为：葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，酵母浸膏0.5％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄0.15％；种子罐菌种培养和发酵罐培养的培养基均为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，豆饼粉浸汁5％，MgSO₄ 0.15％，KH₂PO₄0.2％。

3、根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述及的斜面菌种培养所用的是综合PDA培养基，其培养条件为消前PH6.5，培养温度为26±1℃，培养时间为110-130小时，其中综合PDA培养基：葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.2％，VB1 0.05％。

4、根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述及的摇瓶菌种培养所用的培养基为：葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，酵母浸膏0.5％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.15％；消前PH6.5，培养温度为26±1℃，摇瓶培养转数为160-260r/min，培养时间为90-96小时。

5、根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述及的种子罐菌种培养所用的培养基为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，豆饼粉浸汁5％，MgSO₄ 0.15％，KH₂PO₄ 0.2％；消前PH值为6.5，培养温度为26±1℃，无菌过滤空气搅拌培养，其空气流量为1∶0.4vvm，罐压0.5kg/cm²，培养时间为68-76小时。