CN101974457A - 一株短小芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株短小芽孢杆菌以及该菌株的应用，属于发酵工程技术领域。该菌株于2010年5月11日保藏于中国普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.3824。经发酵培养，该菌株可产生乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸，其有机酸总量达到6.25g/L，在酿醋过程中添加该菌株，可提高原料的利用率以及改善食醋的风味。

Description

一株短小芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株短小芽孢杆菌以及使用该菌株将酒精转化为有机酸的方法。
背景技术
有机酸是成品醋中的重要成分，其组成非常丰富，它不仅决定了食醋的酸味质量，还是决定成品醋缓冲性和pH的重要物质之一，同时它还影响产品的货架期和生物安全性。尽管食醋中酸含量很高，但并无刺激感，酸味很柔和，这其中有机酸的作用是非常重要的。
目前发现用于食醋酿造过程的微生物主要有：乳酸菌(Lactic acid bacteria)、乳杆菌(Lactobacillus)、醋酸菌(Acetic acid bacteria)、酵母菌(Saccharomycete)、曲霉菌(Aspergillus)。但未见报道采用本发明所述短小芽孢杆菌用于食醋的酿造。本发明从镇江香醋醋醅中分离出一株产酸的短小芽孢杆菌，液态发酵显示该株芽孢杆菌可以产生多种有机酸，并且对醋的风味具有一定作用。
发明内容
本发明提供了一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，该菌株筛选自镇江香醋醋醅中，于2010年5月11日保藏于中国普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 3824。
获取所述菌株16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16SrDNA全长序列为1495bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus pumilus(GenBank登录号EU373381)，相似性为99％；16S rDNA序列见SEQ ID NO：1。
所述菌株可利用乙醇发酵生产乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸。
所述发酵生产有机酸的工艺为：
种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，115℃下灭菌20min；
液态发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5-10g/L，氯化钠5-10g/L，pH7.0，115℃下灭菌20min；待培养基冷却至室温，加入6％(w/w)无水乙醇；
种子培养方法：250mL三角瓶装液量25mL，摇床转速120rpm，37℃培养；
发酵培养方法：以5-10％的接种量将种子接入发酵培养基，250mL三角瓶装液量25mL，摇床转速120rpm，37℃培养。
本发明还提供了一种所述菌株的应用，采用上述发酵生产有机酸的工艺，该菌株发酵生产的乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸可应用于食品领域。
本发明还提供了一种所述菌株的应用，在酿醋过程中加入所述短小芽孢杆菌，可提高原料的利用率以及改善醋的风味。
本发明从醋醅中筛选得到一株具有较好有机酸生产能力的菌株，经鉴定为短小芽孢杆菌。该菌株可产生乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸，其有机酸总量达到6.25g/L，在酿醋过程中添加该菌株，可提高原料的利用率以及改善食醋的风味。
具体实施方式
实施例1：产酸芽孢杆菌的筛选
从镇江香醋醋醅中取10g样品装入混有玻璃珠和90mL无菌水的500mL三角瓶中，在37℃摇床上以115r/m振荡30min，然后取菌悬液1mL用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以10-3和10-4梯度稀释样涂布GYC平板，37℃培养48～72h；根据其在GYC平板上有无透明圈来判断是否是产酸菌，然后挑取透明圈明显、菌落丰厚的菌落经分离纯化后接入斜面培养基，37℃培养48h，4℃保藏。
分离培养基(GYC)：酵母粉1％，葡萄糖1％，碳酸钙0.5％，琼脂2％，115℃灭菌20min后冷却至50℃加入无水乙醇6％(v/v)。
斜面培养基(肉汤)：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，NaCl 0.3％，琼脂2％，pH7.0-7.2，115℃灭菌20min。
根据分离培养基中透明圈大小挑取菌株，并且在添加乙醇的液体培养基上验证有机酸产量，并结合其在平板上的菌落形态，得到4株高产有机酸的细菌，于4℃置于斜面培养基中保藏以备进一步分析。
实施例2：产酸菌的分子鉴定
纯化筛选得到的细菌，取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0-P6扩增其16S rDNA全长序列，具体如下：
P0：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’
P6：5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’
①反应体系(50μl)
10×buffer(Mg2+)                        5.0ul
dNTPs(2.5mM)                            4.0ul
P0(12.5uM)                        2.0ul
P6(12.5uM)                        2.0ul
ExTaq DNA聚合酶(5U/ul)            1.0ul
Template DNA                      2.0uL
ddH2O                             34ul
②反应程序
预变性                    95℃                    4min
Figure BSA00000289868100031
终延伸                    72℃                    8min
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11V/cm，电泳时间20分钟。
PCR扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明进行，测序由上海生工生物技术公司完成。
获得其中一株细菌16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16S rDNA全长序列为1495bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus pumilus(GenBank登录号EU373381)，相似性为99％；16S rDNA序列见SEQ ID NO：1。
该菌株于2010年5月11日保藏于中国普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC3824。
实施例3：HPLC测定有机酸组成
将CGMCC 3824接种于发酵培养基中，37℃液态发酵144h，通过HPLC测定其发酵液中的有机酸组成。
种子及液态发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，115℃下灭菌20min；待培养基冷却至室温，加入6％(w/w)无水乙醇。
采用高效液相色谱法测定镇江香醋中有机酸的含量。具体方法如下：
①有机酸提取
准确吸取5ml发酵液，12000rpm离心10min，取上清，分别加入亚铁氰化钾(106g/L)和30％硫酸锌溶液去蛋白，滤纸过滤。滤液用0.22μm膜过滤，再用Sep-Pak C18过滤处理后进HPLC。与此同时，以草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸为标准品，其浓度如表1所示。
表1
②HPLC测定条件如表2所示
表2
Figure BSA00000289868100042
CGMCC 3824发酵液中的有机酸组成情况如表2所示，发酵液中有机酸总量达到6.25g/L，在有机酸的组成上，我们发现其可产生4种有机酸，分别为乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸，其含量分别为为4.63、0.67、0.85和0.10g/L。
表3
Figure BSA00000289868100043
实施例4：添加CGMCC 3824提高酿醋过程中原料利用率
镇江香醋发酵所用原料包括糯米、麸皮、稻壳等，其中蛋白质、碳水化合物、纤维素等为主要成分。
正常对照组：按照传统酿醋工艺，对原料进行发酵生产食醋。
添加短小芽孢杆菌组：将短小芽孢杆菌培养至对数期，菌浓达到约5×109cfu/mL。然后按照1％的接种量添加到已接完种的镇江香醋醋醅中，然后继续依照传统工艺条件酿醋。
取发酵前后的醋醅，105℃烘干，采用凯氏定氮法测定醋醅中蛋白质含量。
测定结果表明，食醋原料中蛋白质含量为5.35％，正常对照组食醋发酵完成后，剩余醋醅中蛋白质含量为0.79％，添加短小芽孢杆菌组发酵后醋醅中蛋白质含量为0.43％。结果表明，添加短小芽孢杆菌能够促进食醋发酵过程中原料的利用率。
实施例5：添加CGMCC 3824改善食醋风味
将CGMCC 3824培养至对数期，菌浓达到约5×109cfu/mL。然后按照1％的接种量添加到已接完种的镇江香醋醋醅中，然后继续依照传统工艺酿醋。
采用高效液相色谱法测定镇江香醋中有机酸的含量。具体方法与实施例3相同。分析结果如表4，与正常对照组相比，添加CGMCC 3824组的香醋中乙酸、乳酸、琥珀酸和苹果酸的含量都有所提高，分别从2.72，0.93，0.18和0.09g/100mL提高至3.15，1.13，0.37和0.19g/100mL。食醋中其它有机酸含量变化不明显。
表4
Figure BSA00000289868100051
食醋中游离氨基酸含量采用氨基酸自动分析仪测定，具体方法如下：
①样品预处理
准确取食醋2mL，加入等体积5％TCA，混匀，双层滤纸过滤，然后以0.45μm纤维素膜减压过滤，氨基酸自动分析仪分析。
②氨基酸自动分析色谱条件
氨基酸自动分析仪：安捷伦1100型，荧光检测器，4.0m×125mm C18柱，柱温：40℃，流速：1.0mL/min，波长：Ex 340nm；Em 450nm，流动相：A：20mmol醋酸钠溶液；B：20mmol醋酸钠∶甲醇∶乙腈＝1∶2∶2(v/v)。
结果见表5，CGMCC 3824组的食醋中谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等多种氨基酸的含量较对照组有所提高。
表5
Figure BSA00000289868100061
Figure ISA00000289868300011

Claims (10)

1.一株短小芽孢杆菌，利用乙醇发酵生成有机酸。
2.如权利要求1所述短小芽孢杆菌，其特征在于，所述有机酸为乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的混合酸。
3.如权利要求2所述短小芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC3824。
4.如权利要求3所述短小芽孢杆菌，其特征在于，其16S rDNA序列具有SEQ ID NO：1所示的序列。
5.如权利要求4所述短小芽孢杆菌，其特征在于，该菌株培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0。
6.如权利要求4所述短小芽孢杆菌，其特征在于，所述生成有机酸的方法为：培养基灭菌后，加入乙醇，接入所述菌株，通气条件下，37℃培养。
7.如权利要求6所述短小芽孢杆菌，其特征在于，所述方法中乙醇浓度为6％(w/w)。
8.如权利要求6所述短小芽孢杆菌，其特征在于，所述方法中菌株接种量为5％-10％(w/w)。
9.一种权利要求1所述短小芽孢杆菌的应用，其特征在于，发酵生产乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸。
10.一种权利要求1所述短小芽孢杆菌的应用，其特征在于，在酿醋过程中加入所述短小芽孢杆菌，提高原料的利用率以及改善食醋的风味。
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