CN106978355A - 一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物及在奶牛饲用天然酶中的应用 - Google Patents

一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物及在奶牛饲用天然酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物及在奶牛饲用天然酶中的应用，属于生物领域。该厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter ruminantium)的共培养物Yak 16的保藏号为CGMCC NO:13391。该共培养物以玉米秸秆为底物产生的发酵液应用于荷斯坦奶牛的玉米秸秆粗饲料提高了奶牛粗饲料的消化率，同时减少了甲烷的排放量。

Description

一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物及在奶牛饲用天然酶中的 应用
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物及在奶牛饲用天然酶中的应用。
背景技术
目前工业上所用的酶制剂微生物真菌菌种主要是里氏木霉、绿色木霉、瑞士木霉、米曲霉、黑曲霉、啤酒酵母菌株，其应用效果已得到公认，酶制剂符合“循环经济”、“低碳经济”、“绿色经济”等现代社会发展趋势，也被公认为目前唯一能够同时有效解决养殖领域中饲料安全、饲料原料缺乏和养殖污染等三大问题的饲料添加剂。随着酶制剂的应用效果不断显现，今后对酶制剂的需求将不断增加。扩大酶的来源，加强高效菌种选育研究仍然是纤维素酶研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物
本发明的另一个目的是提供上述菌在奶牛饲用天然酶中的应用。
本发明技术方案如下：一种厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter ruminantium)的共培养物Yak 16,CGMCC NO:13391。
上述厌氧真菌和甲烷菌的共培养物在奶牛饲用天然酶中的应用，方法为选择装有永久瘤胃瘘管成年荷斯坦奶牛，把厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter ruminantium)的共培养物，从20mL亨氏厌氧管进一步扩大培养到100mL厌氧瓶后，每1次接种5mL菌液到45mL液体培养基中，得菌体及其所产的发酵液。
优选的，液体培养基分别以小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物。
优选的，每次饲喂奶牛时，从奶牛瘤胃瘘管加入900mL包括高效厌氧真菌和甲烷菌共培养物的菌体及其所产的发酵液。
本发明厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacterruminantium)的共培养物Yak 16,CGMCC NO:13391，已经于2016年12月23日在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(北京)保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
研究表明甲烷菌利用厌氧真菌产生的甲酸、氢气和二氧化碳生成甲烷，使厌氧真菌和甲烷菌共培养物的最终代谢产物转变成甲烷、更多乙酸和ATP。同时厌氧真菌及甲烷菌共培养物普遍比厌氧真菌纯培养生长更稳定，厌氧真菌及甲烷菌共培养物比厌氧真菌纯培养普遍具有更高的木质纤维素降解酶活性和更强的降解木质纤维素的能力。
自然的厌氧真菌及甲烷菌的共培养物能够反映瘤胃内真实的厌氧真菌和甲烷菌的共存关系，瘤胃内自然共培养物由于经过长期的自然选择和进化，可能比人工混合培养的共培养具有更强大的降解木质纤维素的能力。长期放牧饲养的牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物可能分泌更高的多糖水解酶和酯酶降解野生牧草和冷季干枯牧草为牦牛提供生长的营养，因此从牦牛瘤胃分离厌氧真菌及甲烷菌共培养物应用于提高粗饲料利用率，以及利用厌氧真菌及甲烷菌共培养物降解廉价木质纤维素底物生产高活性木聚糖酶、酯酶、甲烷和乙酸在工业应用方面具有重大意义。
国内外在牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物的选育鉴定及其对秸秆消化代谢特性和降解功效研究方面仍然是空白，从牦牛瘤胃中筛选具有良好降解木质纤维素效果的厌氧真菌和甲烷菌共培养菌株的高效组合，以期得到降解秸秆木质纤维素的天然高效酶，应用于反刍动物的秸秆粗饲料，提高反刍动物的秸秆粗饲料消化率，提高动物生产性能，同时利用厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解廉价木质纤维素底物发酵生产高活性木聚糖酶、酯酶、甲烷和乙酸等具有广阔工业发展前景和重要的社会意义。
青藏高原牦牛终年以放牧方式生活在海拔3000米以上的极端生态环境，栖息在瘤胃中的大量微生物使牦牛瘤胃成为高效降解木质纤维素的天然发酵罐。其中，厌氧真菌是一种重要的木质纤维素降解微生物。有研究认为，与瘤胃真菌共生的一些甲烷菌能够提高厌氧真菌纤维素降解活性，并促进木质纤维素降解代谢转化生成乙酸和甲烷。
为开发利用瘤胃高效降解木质纤维素的优质真菌资源，本发明实验从青藏高原天祝放牧牦牛瘤胃食糜液中分离获得生长稳定的厌氧真菌及甲烷菌共培养物，并从中筛选出各属真菌及甲烷菌共培养物的高效木质纤维素降解共培养物，将厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter ruminantium)的共培养物Yak 16以玉米秸秆为底物产生的发酵液应用于荷斯坦奶牛的玉米秸秆粗饲料提高了奶牛粗饲料的消化率，同时减少了甲烷的排放量。
具体实施方式
下面对本发明做进一步详细的说明。
1.牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物的分离和鉴定
1.1材料
1.1.1采样地点概况与牦牛瘤胃液的采集
研究地点位于甘肃省天祝藏族自治县乌鞘岭牧场(102° 47′ 13″ E，37° 10′ 37″N)，年均温-1-1.3℃，最高气温26℃，最低气温-30℃，年降水量265-632mm，海拔3100-3400m，属寒冷高原气候类型，温度变化剧烈，日照强，雨量充沛，高寒草甸是主要草地类型。野生牧草包括羊茅、苔草、早熟禾、嵩草、藏嵩草、细叶嵩草、棘豆、金露梅、珠芽寥，珠芽蓼(Polygonum viviparum)和线叶嵩草(Kobresia capillifolia)是该地区的主要优势物种。
2012年春季3月以采食天然牧草，无补饲的全放牧天祝白牦牛中的20头健康公牦牛(阉牛，年龄4-5岁，体重250±50kg)为实验动物。用不锈钢胃管一头通过开口器插入瘤胃，另一头接抽空气设备抽吸出胃管内空气形成负压后瘤胃食糜液从不锈钢胃管中流出，迅速用无菌注射器分别吸取1mL瘤胃食糜液接种到9mL厌氧真菌液体培养基中，并置39℃恒温培养。
1.1.2厌氧真菌培养基
基本培养基：参考Bauchop(1979)培养基做改进。酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO37.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I 165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液II包括4g K2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
分离纯化培养基：在液体基本厌氧培养基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸秆。
琼脂滚管培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡糖糖和20g/L琼脂粉，
传代培养基：在液体基本培养基中添加1％(w/v)的小麦秸秆。
培养基分装到亨氏厌氧管或厌氧瓶中，厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO2的抽气装置进行培养基除氧。首先真空泵抽出管中气体达到负压时培养基颜色改变，然后充入高纯CO2。每管抽气充气3次，其中第一次约15min，其余二次每次5min，最后一次充气后用无菌株针再放气使得厌氧管内外压平衡，并于121℃高温高压湿热灭菌20min备用。
复合抗生素：医用青霉素钠0.48g(80万单位)与医用硫酸链霉素1g(100万单位)溶解于5mL液体培养基中，使得青霉素和硫酸链霉素的终浓度分别达到1600IU/mL和2000IU/mL。(复合抗生素用来消除相细菌污染)。
氯霉素溶液：60mg氯霉素溶解于3mL乙醇(以无菌水为溶质，浓度50％(v/v)的乙醇)，使其浓度达到20mg/mL。传代时每次添加25uL到10mL反应体系，使其在培养基中的终浓度为50μg/mL。(氯霉素用来消除甲烷菌得到厌氧真菌纯培养)。
1.2方法
1.2.1厌氧真菌及甲烷菌共培养物的选育
采用亨盖特滚管技术选育真菌真菌及甲烷菌共培养物。用无菌注射器吸取1mL牦牛瘤胃食糜样品，接种到39℃预热的20mL体积的亨氏厌氧管中的9mL液体基本培养基中，即制成10-1稀释液，再取稀释液依次梯度稀释至10-2、10-3，1mL稀释液被接种到亨盖特厌氧管，厌氧管内有9mL液体基本培养基、葡萄糖(1g/L)和融化的琼脂(20g/L)。接种的同时，每管液体培养基中用七号注射针头无菌注射器加入复合抗生素溶液2滴。被接种的厌氧管立即在冰上滚管后放置39℃培养4天。真菌单菌在接种后2-3天长出，在厌氧条件下，用接种环挑取单菌接种到无秸秆的，添加葡萄糖(1g/L)的液体基本培养基中，接种的同时，每管液体培养基中用7号注射针头无菌注射器加入复合抗生素溶液2滴。这个过程在亨盖特琼脂滚管和葡萄糖液体培养基之间重复4-5次，直到亨盖特琼脂滚管上的真菌菌落镜检后形态一致，即获得了真菌单菌。将获得的单菌接种于小麦秸秆培养基中，39℃培养，每4天传代一次。每次传代时加入复合抗生素溶液。测定每1株分离的单菌在亨氏厌氧管中的秸秆培养基生长时是否产生甲烷，同时用荧光显微镜(Eclipse 80i，尼康，日本)在420nm下观察共培养的发酵液是否有蓝色或蓝绿色荧光，确保分离出的共培养中甲烷菌的存在，从而筛选出厌氧真菌及甲烷菌共培养物。
甲烷的测定法：使用气相色谱仪(GC522，伍丰仪器，中国)，配置有GPS101柱(2m×3mm)，热导检测器，汽化室250℃，柱温100℃，检测器温度150℃，载气为氮气。
厌氧真菌及甲烷菌共培养物传代：传代时用无菌注射器吸取1mL共培养物到厌氧管中的9mL小麦秸秆培养基，4天传代1次。
1.2.2厌氧真菌-甲烷菌共培养物中厌氧真菌形态学鉴定
用普通光学显微镜观察固体琼脂管培养基中培养2-3天的厌氧真菌菌体形态、假根、菌丝、孢子囊和孢子梗，用相差显微镜(BX41-PHD-P11，上海，中国)观察真菌在无秸秆，添加葡萄糖为底物的液体培养基中培养2-3天的厌氧真菌菌体形态、孢子囊、孢子梗、假根、菌丝体和游动孢子鞭毛及运动状态，根据厌氧真菌的形态学特征对其做出种属鉴定。
1.2.3厌氧真菌-甲烷菌共培养物中厌氧真菌分子生物学鉴定
1.2.3.1厌氧真菌总DNA的提取
采用液氮研磨菌体后使用天根植物基因组试剂盒(天根生化科技，北京)提取厌氧真菌总DNA。
(1)10mL厌氧真菌及甲烷菌共培养物菌液接种到90mL，无秸秆，添加0.1％(w/v)葡萄糖的液体培养基中培养4-5天后将菌液移到离心管后12000×g离心5min，弃上清，收集菌体沉淀转入研钵，加入液氮将菌体快速充分研磨成粉末。
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％(w/v)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。
(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000×g离心5min。
(4)将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000×g离心30s，弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。
(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否已加入无水乙醇)，10000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤(7)。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000×g离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入干净的离心管，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000×g离心2min，将溶液收集到离心管中。(11)将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000×g离心2min。
(12)DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
1.2.3.2厌氧真菌ITS1序列的PCR扩增
利用厌氧真菌ITS1专用引物Neo18S For(5’-AAT CCT TCG GAT TGG CT-3’)和Neo5.8S Rev(5’-CGA GAA CCA AGA GAT CCA-3’)扩增厌氧真菌的ITS1全序列(Edwards等，2008)。使用MyCycler PCR仪(Bio-rad，美国)进行扩增，PCR反应缓冲液(总体积10μL)包括40mM Tricine-KOH(pH 8.0),16mM KCI，3.5mM MgC12，100μg/mL牛血清白蛋白，800μMdNTP，500nM上下游引物，0.2μL 50×TITANIUM Taq酶和模板DNA大约50ng。PCR反应条件是：95℃5min，然后10个循环95℃30s，68℃30s(每个循环降1℃)和72℃30s，然后25个循环95℃30s，58℃30s和72℃30s，最后72℃延伸6min。没有模板的PCR反应体系作为空白对照。
1.2.4厌氧真菌-甲烷菌共培养物中甲烷菌鉴定
1.2.4.1甲烷菌的多样性研究
厌氧真菌及甲烷菌共培养物5mL，10000×g离心10min，沉淀用1mL PBS漂洗，离心后沉淀置于-20℃保存。产甲烷菌DNA提取法同前面厌氧真菌DNA提取方法。PCR-DGGE技术检测厌氧真菌及甲烷菌共培养物中和每1株厌氧真菌共存的甲烷菌的多样性。所用引物为519f/915r GC，PCR反应混合液及反应程序参照Coolen等(2004)的方法。DGGE(DCode DGGE系统，Bio-rad，美国)采用6％聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺是37：1(w/w)，100％变性胶含有7mol/L尿素和40％(v/v)甲酰胺。变性胶浓度为30％-75％。电泳条件为：60℃水温，200电泳10min，然后85V电泳16h。DGGE凝胶经过固定，银染，显影，固定后，用SQ-GS 800型扫描仪(Bio-rad，美国)扫描。
1.2.4.2甲烷菌分子生物学鉴定
以甲烷菌16SrDNA通用引物Met86F(5’-GCT CAG TAA CAC GTG G-3’)和Met1340R(5’-CGG TGT GTG CAA GGA G-3’)用来扩增甲烷菌的16SrDNA序列(Wright&Pimm，2003)。PCR反应体系(总体积50μL)包括200nM上下游引物，大约0.3mg纯化的DNA，1×Taq反应缓冲液，每个dNTP 200uM，2mM MgCl2和4单位Taq DNA聚和酶。PCR扩增条件是：起始温度95℃5min，然后30个循环的变性温度94℃30s，退火温度58℃30s和延伸温度72℃1min，最后延伸72℃5min。没有模板的PCR反应体系作为空白对照。
扩增出的厌氧真菌ITS1和甲烷菌16SrDNA片段经琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察后纯化回收PCR产物，将PCR产物送华大基因公司测序。
1.2.5厌氧真菌和甲烷菌的进化关系分析
厌氧真菌ITS1序列和甲烷菌16SrDNA序列的测序结果提交NCBI获得GenBank登录号，在NCBI数据库中通过BLAST比对分析，采用ClustalX V1.83对序列做多序列的全部比对，获得进化树最终序列，然后使用MEGA6.0(Tamura等，2013)软件的neighbor-joining法(Saitou&Nei，1987)构建系统进化树。
1.3结果
1.3.1牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物的分离纯化
从天祝牦牛瘤胃液中分离纯化出30个厌氧真菌及甲烷菌共培养物。细菌特定引物968f/1401r扩增显示每1个共培养中都没有细菌污染。气相色谱分析甲烷证明所有的共培养都产生甲烷，每1个共培养的发酵液在荧光显微镜下观察都显现兰绿色光点，这些确保了每1个共培养中甲烷菌的存在。30个厌氧真菌及甲烷菌共培养物接种于亨氏厌氧管中小麦秸秆培养基，4天传代1次以保证其活性。
1.3.2牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物的鉴定
在光学显微镜、相差显微镜下观察30个厌氧真菌及甲烷菌共培养物的形态特征。30个共培养中的厌氧真菌包括Orpinomyces sp.、Neocallimastix sp.、Piromyces sp.和Caecomyces communis 4个属。由于Caecomyces communis及甲烷菌共培养物在以小麦秸秆为底物的传代培养基中普遍长势较弱，有些在传代培养中逐渐消失，所以保留了20个在传代培养过程中稳定生长的厌氧真菌及甲烷菌共培养物作为研究对象。
20个厌氧真菌及甲烷菌共培养物中20株真菌的ITS1序列的GenBank号是：KP123375-KP123394。基于厌氧真菌的ITS1序列分析和形态学鉴定，20株厌氧真菌中Yak1-Yak9共9株被鉴定为Orpinomyces joyonii(表1)，Yak10-Yak17共8株被鉴定为Neocallimastix frontalis(表1)，Yak18-Yak20共3株被鉴定为Piromyces sp.(表1)。
20个共培养物中甲烷菌的DGGE电泳和16SrRNA基因结果证实了在每一个共培养物中，一株厌氧真菌只和一株甲烷菌相联系，符合“一对一”模式。甲烷菌的16SrDNA基因序列分析证明20个共培养物中，所有甲烷菌YakM1-YakM20都属于Methanobrevibacter sp.(表2)。20株甲烷菌的16SrRNA基因序列的GenBank号是KP123396-KP123415。
20个共培养物中，19株真菌被鉴定为和甲烷菌Methanobrevibacter ruminantium相联系，只有1株真菌Orpinomyces joyonii和Methanobrevibacter millerae相联系(表2)。因此20个厌氧真菌及甲烷菌自然共培养物包括4种类型：Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium，Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacterruminantium，Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter millerae和Piromyces+Methanobrevibacter ruminantium。
表1和表2中Yak16+M.r为本发明保护的厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter ruminantium)的共培养物Yak 16,CGMCC NO:13391。
表1—天祝牦牛瘤胃20个厌氧真菌及甲烷菌共培养物中厌氧真菌的鉴定
表2天祝牦牛瘤胃20个厌氧真菌及甲烷菌共培养中甲烷菌的鉴定
2.牦牛瘤胃高效降解秸秆厌氧真菌及甲烷菌共培养物的筛选
2.1材料
基本培养基：成分参照1.1.2。
筛选培养基：液体基本培养基中不加葡萄糖，以粉碎的小麦秸秆(1％(w/v))为底物。
传代培养基：同筛选培养基。
2.2方法
2.2.1筛选方法
以选育出的20个厌氧真菌及甲烷菌共培养物为研究菌株。在以小麦秸秆为底物的液体培养基中39℃厌氧培养下每4天传1次代。最后一天的培养液用于接种。每1个共培养物分别接种1mL到20mL体积亨氏厌氧管中以粉碎的小麦秸秆为底物的9mL液体培养基中，培养7天，测定2-7天的产气量、酶活和第7天干物质降解率，对比3属真菌及甲烷菌共培养物的秸秆降解特性，主要以7天的总产气量和第7天干物质降解率为依据筛选出20个共培养物中的高效降解秸秆共培养物。
2.2.2实验设计和取样
接种每1个共培养物1mL到20mL亨氏厌氧管以100mg风干粉碎的小麦秸秆为底物的9mL液体基本培养基中，加入复合抗生素(1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素)，39℃厌氧培养7d。隔24h取出每1个共培养的3管测定气体产量，并收集管内发酵液上清测定木聚糖酶(Xylanase)、羧甲基纤维素酶(CMCase)、滤纸酶(FPase)、阿魏酸酯酶(FAE)、乙酰酯酶(AE)的活性。培养第7天的厌氧管内残留底物秸秆量用来测定干物质降解率(IVDMD)。
每个共培养3个平行。不接种共培养的作为空白对照。
2.2.3真菌及甲烷菌共培养物物降解秸秆酶活测定
将20个共培养物的发酵液1000×g离心10min，取上清液测定酶活性。采用分光光度计用DNS法测定木聚糖酶、CMCase和FPase活性(Lowe等，1987)。用酶标仪测定FAE和AE活性(Yue等，2009；Yang&Xie，2010)。
2.2.3.1木聚糖酶(Xylanase)活性的测定
稀释的粗酶液(稀释至OD值大约在0.2-0.8范围)、底物10g/L桦木木聚糖(SigmaX-0502)和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)置39℃预热15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸钠缓冲液和500μL底物，39℃反应15min后，加入3000μL DNS终止反应。沸水浴5min后冷却至室温，取2000μL于比色皿中，在540nm下检测吸光值。根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物羧甲基纤维素钠中释放1μmol葡萄糖所需的酶量。
2.2.3.2羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的测定
稀释的粗酶液、底物10g/L羧甲基纤维素钠和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)置39℃预热15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸钠缓冲液和500μL底物，39℃反应15min后，加入3000μLDNS终止反应。沸水浴5min后冷却至室温，取2000μL于比色皿中，在540nm下检测吸光值。根据葡萄糖的标准曲线计算CMCase酶活。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物羧甲基纤维素钠中释放1μmol葡萄糖所需的酶量。
2.2.3.3滤纸酶(FPase)活性的测定
稀释的粗酶液,底物1×6cm Whatmen No.1滤纸和50mM磷酸钠缓冲(pH 6.8)置39℃预热15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸钠缓冲液和500μL底物，39℃反应15min后，加入3000μLDNS终止反应。沸水浴5min后冷却至室温，取2000μL于比色皿中，在540nm下检测吸光值。根据葡萄糖的标准曲线计算FPase酶活(Lowe等，1987)。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物Whatmen No.1滤纸中释放1μmol葡萄糖所需的酶量。
DNS溶液：准确称取10.0g 3,5-二硝基水杨酸(分析纯)，转移至1000mL烧杯中，加入500mL蒸馏水，放到磁力搅拌器上，将加热温度调到45℃，边加热边搅拌。然后加入10.0g氢氧化钠，直至溶液清澈透明。然后逐步加入四水酒石酸钾钠208g，苯酚2.0g，无水亚硫酸钠0.5g。继续45℃加热，同时补加约300mL蒸馏水，直至加入的药品完全溶解。将溶液冷却，定容至1000mL，然后用烧结玻璃过滤器(测定粗纤维用过滤器)过滤后，将滤液转移至棕色瓶中，避光于冰箱保存一周后备用，有效期为6个月。
2.2.3.4阿魏酸酯酶(FAE)活性的测定
稀释粗酶液并置39℃预热15min，含100μM阿魏酸甲酯(Sigma Chemicals)的100mM3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)溶液(pH 6.8)作为底物置39℃预热15min。在100μL粗酶液中加入200μL底物，39℃反应30min，用酶标仪(680XR，Bio-rad，美国)在340nm下检测反应0min和30min时的吸光值，根据阿魏酸及阿魏酸甲酯标准曲线计算阿魏酸酯酶活性(Yue等，2009)。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物阿魏酸甲酯中释放1μmol阿魏酸所需的酶量。
100mM MOPS缓冲液(pH 6.8)：称取5.2323g MOPS，溶于150mL去离子水中，用NaOH调pH至6.8，用去离子水定容至250mL。
2.2.3.5乙酰酯酶(AE)活性的测定
稀释粗酶液并置39℃预热15min，2mM对-硝基苯乙酯作为底物和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)置于39℃预热15min。向50μL粗酶液中加入100μL磷酸钠缓冲液和50μL底物，39℃反应30min后，用酶标仪(680XR，Bio-rad，美国)在415nm下检测吸光值，根据对-硝基苯的标准曲线计算乙酰酯酶活性。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物对-硝基苯乙酯中释放1μmol对-硝基苯所需的酶量。
2.2.4真菌及甲烷菌共培养物降解秸秆干物质降解率测定
采用尼龙袋法。每个厌氧管的样本在尼龙袋内105℃烘干24h，在干燥器达到恒重后，减去尼龙袋本身重量即为尼龙袋内的干物质含量，未接种共培养的干物质作为起始干物质。IVDMD(％)＝[(起始干物质质量﹣剩余干物质质量)/起始干物质质量]×100。
2.2.5数据统计与分析
使用SAS(version 9.02，1999，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)一般线性模型的多重比较方法(Tukey/Kramer)进行单向方差分析。最小二乘均值和标准平均误差(SEM)用一般线性模型过程的最小二乘均值计算。P<0.05为显著性。
2.3结果
2.3.1高效共培养物的筛选
根据测定的20个共培养物以小麦秸秆为底物7天培养期内累积产气量、酶活、干物质降解率，选取每1个共培养在7天培养期内达到的最高值比较共培养9个O.joyonii+Methanobrevibacter，8个N.frontalis+M.ruminantium和3个Piromyces+M.ruminantium的平均值(表3)。结果表明：共培养N.frontalis+M.ruminantium和共培养Piromyces+M.ruminantium共培养的以上指标明显高于共培养O.joyonii+Methanobrevibacter。尤其是8个N.frontalis+M.ruminantium普遍表现出最高的产气量、木质纤维素降解酶活性和IVDMD。根据7天培养期的产气量，酶活和第7天干物质降解率从20个共培养物中筛选出3属厌氧真菌及甲烷菌共培养降解秸秆的高效共培养分别是：N.frontalis Yak16+M.ruminantium(总产气量318ml/g DM,CMCase 189mU,FPase457mU,Xylanase 8404mU,FAE20.3mU,AE 247mU,IVDMD 49.6％)，Piromyces Yak18+M.ruminantium(总产气量303ml/gDM，CMCase 164mU,FPase 410mU,Xylanase 6910mU,FAE20.4mU,AE 167mU,IVDMD 42.9％)和Orpinomyces joyonii Yak7+M.ruminantium(总产气量255ml/g DM，CMCase 165mU,FPase343mU,Xylanase 5182mU,FAE 18.8mU,AE 168mU,IVDMD 40.5％)。
由以上结果可知：共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium在20个共培养中木质纤维降解能力最强。
3.牦牛瘤胃高效厌氧真菌及甲烷菌共培养在奶牛粗饲料中的应用
3.1材料
选择中国农业科学院北京畜牧兽医研究所装有永久瘤胃瘘管成年荷斯坦奶牛20头，体重在500-600kg，胎次、体重、产奶量均相近，二或三胎的年产奶量都在7000kg左右，最大体重和最小体重相差不超过50kg的高产荷斯坦泌乳牛进行为期60d的实验。
荷斯坦奶牛每天饲喂3次，分别为6：00、12：30和17：30，每次饲喂6.5kg干物质，自由饮水。
奶牛日粮中包括：小麦秸秆(玉米秸秆或水稻秸秆)500g/kg、黄玉米325g/kg、小麦麸55g/kg、豆粕44g//kg、棉籽粕51g/kg、碳酸氢钙5g/kg、碳酸氢钠5g/kg、石粉5g/kg、碘盐5g/kg和添加剂预混料5g/kg。
秸秆的主要成分是中性洗涤纤维，包括纤维素、半纤维素和木质素。本实验所用三种秸秆的基本营养成分见下表4：
表4本实验所用三种秸秆的基本营养成分
注：同一行标注不同字母肩标表示差异显著(P<0.05)
3.2方法
把共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium从20mL亨氏厌氧管进一步扩大培养到100mL厌氧瓶后，每1次接种5mL菌液到45mL液体培养基中，液体培养基分别以小麦秸秆。玉米秸秆和水稻秸秆为底物。扩大厌氧培养为了获得大量高效酶液以用于荷斯坦奶牛的粗饲料实验。
收集高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium在厌氧发酵瓶中分别以小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆为底物培养第3天的菌体和发酵液，每1天总共饲喂3次奶牛饲粮，每1次饲喂奶牛时，从奶牛瘤胃瘘管加入900mL包括高效厌氧真菌和甲烷菌共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium的菌体及其所产的发酵液，通过从瘤胃瘘管定时采取食糜样本测定饲喂后6h瘤胃食糜中性洗涤纤维含量的变化，同时采用六氟化硫示踪技术测定奶牛的全天甲烷排放量变化，研究高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium分别以3种底物所产酶液对奶牛的3种秸秆粗饲料的中性洗涤纤维降解率和全天甲烷排放量的影响和作用。
3.2.1实验设计和取样
以20头装有永久瘤胃瘘管成年荷斯坦奶牛为研究对象。奶牛的粗饲料为3种(分别是加入小麦秸秆，玉米秸秆或水稻秸秆的3种粗饲料)。奶牛每天饲喂3次，分别为6：00、12：30和17：30，每次饲喂6.5kg干物质，自由饮水。
每次饲喂的日粮中分别包括小麦秸秆，玉米秸秆或水稻秸秆500g/kg。其中10头用作不加高效共培养发酵液(包括菌体和所产酶液)的空白对照。
高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium分别以麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆为底物。高效共培养以1种秸秆为底物第3天产生的发酵液(包括菌体和所产酶液)在饲喂奶牛时直接加入1种奶牛粗饲料秸秆做3个平行。
表5高效共培养所用底物和奶牛粗饲料秸秆种类
3.2.2牦牛瘤胃高效共培养对奶牛粗饲料消化率的影响
每次饲喂奶牛加入900mL高效发酵液，通过奶牛瘤胃瘘管采集食糜测定秸秆粗饲料的中性洗涤纤维降解率。测定中性洗涤纤维降解率方法同前。
3.2.3牦牛瘤胃高效共培养对奶牛甲烷排放的影响
3.2.3.1渗透管的制备
渗透管为一段封闭的不锈钢管，管内装满液体六氟化硫后，另一端用特氟隆垫封闭，并用螺栓固定。管中六氟化硫同时用液氮冷却。
3.2.3.2六氟化硫渗透速率的测定
将装满六氟化硫的管子放入39℃的水中使其平衡，反复测定渗透速率。采用重量分析法测定渗透速率。(合适的渗透速率是500ng/min)。
3.2.3.3渗透管置入法
第一次采集数据的前3天用灌药枪放渗透管到瘤胃内，使其达到稳定状态。
3.2.3.4采样器的使用
使用的是PVC牛扼式采样器，固定在颈部，使用前将采样器抽空，采完样后进行分析。采样器和进气口是毛细管采样管连接。
3.2.3.5样品分析及计算
甲烷分析条件：FID检测器；色谱柱：2m × 3.2mm PQ填充柱；进样量5mL。
六氟化硫分析:ECD检测器；2m×3.2mm 5A分子筛填充柱；进样量5mL。甲烷排放速率＝六氟化硫的释放速度×采样气体的甲烷浓度/采样气体的六氟化硫的浓度。
3.2.4数据统计分析
使用SAS(version 9.02，1999，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)一般线性模型的多重比较方法(Tukey/Kramer)进行单向方差分析。最小二乘均值和标准平均误差(SEM)用一般线性模型过程的最小二乘均值计算。P<0.05认定为有显著性，除非另有说明。
3.3结果
3.3.1牦牛瘤胃高效共培养对奶牛粗饲料消化率和甲烷排放量的影响
将所收集高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium在厌氧发酵瓶中分别以3种秸秆为底物培养第3天的发酵液(包括高效厌氧真菌和甲烷菌的菌体及其所产酶的发酵液)，每1次饲喂奶牛的同时从瘤胃瘘管加入900mL高效共培养物及其所产发酵液，通过瘤胃瘘管定时采样测定饲喂后6h瘤胃食糜的中性洗涤纤维含量可知高效共培养N.frontalisYak16+M.ruminantium在以玉米秸秆为底物扩大培养后第3天菌体及发酵液(木聚糖酶6562mU，滤纸酶活320.4，阿魏酸酯酶11.0mU，乙酰酯酶199.3mU，香豆酸酯酶5.0mU)加入奶牛的玉米秸秆为粗饲料的饲粮中提高了中性洗涤纤维消化率6.5％，同时甲烷排放从平均每天217升下降至210升，下降率达到3.2％。高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium在另外2种秸秆为底物培养第3天所产发酵液(包括高效厌氧真菌和甲烷菌的菌体及其所产酶的发酵液)分别加入奶牛的3种秸秆粗饲料后中性洗涤纤维的消化率低于6.5％，甲烷排放量的下降率也低于3.2％。即应用效果为：
表6高效共培养的发酵液对粗饲料的降解能力
+：表示高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium分别以3种秸秆为底物培养第3天所产发酵液分别加入奶牛的3种秸秆粗饲料对中性洗涤纤维的消化降解能力
由表可知：高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium在玉米秸秆为底物培养第3天所产菌体及其发酵液对于奶牛的玉米秸秆粗饲料更有实际应用意义。
高效厌氧真菌及甲烷菌共培养对奶牛粗饲料的应用效果测定：收集高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium在厌氧发酵瓶中分别以3种秸秆为底物培养第3天的发酵液(包括高效厌氧真菌和甲烷菌的菌体及其所产酶的发酵液)，每1次饲喂奶牛饲粮的同时从瘤胃瘘管加入900mL高效共培养物及其所产发酵液，通过瘤胃瘘管定时采样测定饲喂后6h瘤胃食糜的中性洗涤纤维含量，同时采用六氟化硫示踪技术测定奶牛的全天甲烷排放量，得出结论：高效共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium以玉米秸秆为底物第3天所产菌体及发酵液明显提高了奶牛以玉米秸秆作为粗饲料的消化率6.5％，同时，粗饲料的消化率和甲烷排放成负相关，奶牛全天甲烷排放量从平均每天217升下降至210升。
本研究证明：利用牦牛瘤胃中的厌氧真菌及甲烷菌共培养物菌体及其所产酶能够达到提高奶牛粗饲料消化率同时减少甲烷排放量的目的。本研究中高效厌氧真菌和甲烷菌共培养物以玉米秸秆为底物产生的发酵液可以作为反刍动物以玉米秸秆为粗饲料的天然饲用酶。

Claims (4)

1.一种厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacterruminantium)的共培养物Yak 16,CGMCC NO:13391。
2.权利要求1所述的厌氧真菌和甲烷菌的共培养物在奶牛饲用天然酶中的应用，其特征在于：选择装有永久瘤胃瘘管成年荷斯坦奶牛，把厌氧真菌和甲烷菌的共培养物，从20mL亨氏厌氧管进一步扩大培养到100mL厌氧瓶后，每1次接种5mL菌液到45mL液体培养基中，得菌体及其所产的发酵液。
3.根据权利要求2所述的厌氧真菌和甲烷菌的共培养物在奶牛饲用天然酶中的应用，其特征在于：液体培养基分别以小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物。
4.根据权利要求3所述的厌氧真菌和甲烷菌的共培养物在奶牛饲用天然酶中的应用，其特征在于：每次饲喂奶牛时，从奶牛瘤胃瘘管加入900mL包括高效厌氧真菌和甲烷菌共培养物的菌体及其所产的发酵液。
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