CN101988044A - 一种果酒生物降酸新菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种果酒生物降酸新菌株及其应用，命名为R35，该菌种已于2010年2月11日保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.3635。本发明还涉及该菌株在含苹果酸的果酒中进行生物降酸的应用。本发明的干酪乳杆菌R35具有苹果酸乳酸发酵(MLF)功能，能够很好的适应果酒体环境，能有效降低果酒中的苹果酸、增加挥发酯含量，从而使果酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁；为提高果酒品质奠定基础。

Description

一种果酒生物降酸新菌株及其应用 

技术领域

本发明涉及一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），特别涉及一种果酒生物降酸新菌株及其应用，命名为R35，该菌种已于2010年2月11日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.3635。 

背景技术

水果是一种营养丰富的食物、是人体膳食维生素、无机盐、纤维素、有机酸等的主要来源，蛋白质和脂类含量低。由水果酿制的果酒，往往有机酸含量较高，尤其是有机酸组分之一—苹果酸的酸感刺激，导致酒体酸涩、粗糙感较强，已成为果酒产业进一步拓宽市场和规模化发展的瓶颈制约。因此，通过果酒的无伤害生物降酸来改善果酒品质是生产高质量果酒的关键技术，也是果酒生产必须解决的重要难题。 

目前企业生产的果酒采用的降酸手法主要进行化学降酸，化学降酸虽有效果好、速度快的特点，但降酸的同时引入过多的Na⁺和Ca²⁺，使酒体风味及质地明显下降，且在贮放过程中产生不稳定的钙盐沉淀致使酒体稳定性下降。乳酸菌能利用苹果酸为底物进行苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF），在苹果酸乳酸酶的催化下，转变成酸感柔和的乳酸。因此，应用乳酸菌的MLF生物降酸技术，可将苹果酸分解成单羧基乳酸，从而使果酒口感柔和圆润，酸涩感降低，在果酒的酿造学中具有重要科学意义。此外，乳酸菌的代谢活动改变了果酒中醛类、酯类、氨基酸、其它有机酸和维生素等微量成分的浓度及呈香物质的含量，有利于酒体风味复杂性的形成，除达到生物降酸外，还可增加酒体生物稳定性，并起到风味修饰作用，是提高果酒柔和度的重要工序，已在葡萄酒及苹果酒等酿造中广泛应用。 

果酒MLF的降酸效果与乳酸菌性能、发酵条件、发酵基质中底物含量等因素有关。降酸幅度取决于酒体中苹果酸的含量、菌株等环境条件。用于葡萄酒MLF的乳酸菌主要有：酒球菌属（Oenococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳杆菌属（Lactobacillus）和片球菌属（Pediococcus）等。其中，葡萄酒明串株菌(Leuconostoc oenos)能耐低pH值和高酒精度，在葡萄酒的MLF中最为常见。但未见报道耐受二氧化硫的能力高于60mg/L的乳酸菌株，更未见能在高酒精度（酒精度12±2%）、高酸度（pH值3.0±0.2或总酸（以苹果酸计）1.0±0.2%）、高含硫（120±10mg/L）、低生长温度（培养温度20±2℃）等不利因素同时存在的环境下正常生长。现有乳酸菌比较适应在低含硫量（≤60mg/L）、低酒精度（≤10%）及较低酸度（pH值≥3.5或总酸（以苹果酸计）≤0.8%）的条件下生长，在如此温和条件下进行果酒的MLF降酸，往往引发酒体挥发酸含量增加、果酒色泽氧化褐变和杂菌繁殖等问题，因此，二氧化硫等耐受能力较高的乳酸菌株是生产优质果酒的关键之一。 

发明内容

针对上述果酒降酸中存在的问题和缺陷，本发明的目的是选育出一种能改善果酒降酸效果、改善果酒口感柔和性的果酒生物降酸新菌株及其应用。 

本发明的果酒生物降酸新菌株，是从自然发酵的枇杷酒中分离，并经一系列耐受性选育得到的具有很强的耐受性能和较高的苹果酸乳酸发酵活力的一株乳酸菌株，可在含120mg/L SO₂和13%酒精度且pH3.5的酒体内正常生长，命名为Lactobacillus casei R35，简称R35，已于2010年2月11日送交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.3635。 

另外，本发明提供的新菌株来自于自然发酵的枇杷酒中，经人工分离、筛选、驯化而得。 

另外，本发明提供的新菌株可在含120mg/L SO₂和13%酒精度且pH值为3.0（或总酸（以苹果酸计）1.0±0.2%）的酒体内正常生长，无需通过降低SO₂（≤60mg/L ）或酒精含量（≤10%）及酸度（pH≥3.5）来改变酒体环境，既能保证果酒的发酵品质，又能达到生物降酸的效果。 

另外，本发明提供的新菌株可在含有苹果酸的果酒中通过苹果酸乳酸发酵，对酒体进行生物降酸，达到改善口感、减少酸感刺激性、提高酒体柔和度的目的。 

本发明的干酪乳杆菌R35（即果酒生物降酸新菌株）具有苹果酸乳酸发酵（MLF）功能，能够很好的适应果酒体环境，能有效降低果酒中的苹果酸、增加挥发酯含量，从而使果酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁；为提高果酒品质奠定基础。 

附图说明： 

本发明果酒生物降酸新菌株，命名为Lactobacillus casei R35，简称R35，已于2010年2月11日送交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.3635。

图1是16SrDNA序列系统发育进化树。 

图2是纸层析监控苹果酸乳酸发酵（MLF）。 

图3  液体培养显微。 

图4  平板菌落形态。 

图5  细胞形状图（扫描电镜）。 

图6 细胞纵切面结构图（透射电镜）。 

具体实施方式

以下将结合附图，介绍本发明果酒生物降酸新菌株R35的微生物学特征，诸如形态学、生理生化、16S rDNA序列测定与同源性分析。 

（1）  R35的形态学与生理学特征 

  

（2）R35的糖代谢能力

注：“—”为阴性反应；“+”为阳性反应，“W”表示阳性弱反应

（3）16S rDNA序列测定与同源性分析

采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取纯培养的目标菌株的基因组DNA。以引物F968（ 5’-AAC GCG AAG CTT AC-3’）和L1401（ 5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’）扩增其16SrDNA基因V6-V8可变区。

50??l PCR反应体系组成(??l)：ddH₂O 34.6，10×PCR反应缓冲溶液5.0，dNTP Mixture 4.0，引物(F968) 2，引物(L1401) 2，模板DNA 2，Taq ^TM DNA聚合酶0.4。PCR扩增程序：94℃预变性5min，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃充分延伸10min，4 ℃保存。PCR产物检测：取5??l的PCR产物，2??l的上样缓冲液，在加入荧光染料gelview的1.0%的琼脂糖中凝胶电泳分离,将含有目标片段的产物测序（测序的结果？）。 

将菌株R35的16S rDNA序列输入Genebank以Blast软件进行序列同源性比较，其16SrDNA序列系统发育进化树，如图1。结果显示，R35菌株的遗传进距离与乳杆菌属最近，它与干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）处于一个最小分支，与多株已知干酪乳杆菌的同源性达99％以上，说明该菌在分子系统发育分类学上属于干酪乳杆菌。经16SrDNA序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》，最终确定R35菌株为干酪乳杆菌，命名为Lactobacillus casei R35。 

实施例1：干酪乳杆菌R35的分离选育

1、生物降酸菌株的分离

以新鲜的枇杷果实为原料，经挑选、清洗、去核去皮、破碎等工艺，制成枇杷果浆，分别调节枇杷果浆SO₂浓度范围在40～100mg/L，在20-25℃于发酵罐中进行自然发酵。采用纸上层析法，定性检测枇杷酒醪发酵过程的苹果酸乳酸含量，选择已进行苹果酸乳酸发酵（MLF）且SO₂浓度高于80mg/L的样品作为生物降酸乳酸菌的分离源。

在无菌条件下，对已发生苹果酸乳酸发酵的枇杷酒样进行10倍梯度稀释，选取3个适宜的稀释度10^-1、10^-2和10^-3，使得平板菌落能够彼此分开，各吸取0.1mL，涂布于ATB分离培养基，每个稀释度做2个平行，置于28℃培养箱中恒温培养5～6d，挑取圆形稍扁平的单菌落，在MRS平板上进行4～5次划线传代，经显微镜镜检，获得纯菌株30株。首先对30株纯化菌进行糖发酵试验和吲哚试验，结果表明发酵管中培养液均变为黄色，且无气泡产生；吲哚试验试验均呈阴性，排除了这些菌株为大肠杆菌的可能性；后经革兰氏染色和接触酶试验，结果表明革兰氏染色均呈阳性，接触酶试验均呈阴性，因此可初步判定所纯化菌株为乳酸菌；最后通过纸层析法进行乳酸定性检测，有12株乳酸菌的乳酸层析点较大且清晰，其它18株乳酸菌的乳酸层析点较小且不清晰，即其苹果酸乳酸发酵能力较弱，可排除。最后得到12株苹果酸乳酸发酵能力较强的乳酸菌，对其进行编号并分别转移至改良TJA斜面培养基上，于4℃条件下保藏，备用。 

2、干酪乳杆菌R35的选育

将分离得到的乳酸菌分别以10⁷CFU/mL菌量接种于含总SO₂120mg/L、酒精度13%(v/v)、pH值3.0的MRS液体培养基中，于25～30℃恒温培养24小时测定菌量，同时进行耐受18℃培养温度的试验。将所得数据用DPS数据处理软件进行统计分析，考察各菌株对二氧化硫、酒精、pH值、低温的耐受性，筛选出耐高SO₂且综合发酵性能优良的乳酸菌，结果如表1，说明干酪乳杆菌R35具有耐受高酒精度、高硫和低温能力，是1株优良的果酒生物降酸乳酸菌。

  

表1  干酪乳杆菌R35对环境因子的耐受性

注：1）分离菌株对各环境因素的耐受能力以（A）^b（如（10.20±1.30）⁺⁺⁺）形式表示，其中：

A表示菌量增长倍数：A<1，表示菌量呈负增长；A≥1，表示菌量呈正增长

b表示菌量级别：“++++”表示平板计数菌量达10⁹CFU/mL水平；“+++”表示平板计数菌量达10⁸CFU/mL水平；“++”表示平板计数菌量达10⁷CFU/mL水平；“+”表示平板计数菌量达10⁶CFU/mL水平。

  

为了充分公开本发明的一种果酒生物降酸新菌株及其应用，现结合附图和发明人给出干酪乳杆菌R35在枇杷酒降酸中的应用，来进一步说明本发明的有益效果。

试验例2：干酪乳杆菌R35在“解放钟”枇杷酒中的应用

    将干酪乳杆菌R35在种子发酵培养基中活化后，以9.7×10⁸cfu/mL接种量接入pH为3.45、总硫浓度为120mg/L、酒精度为11.5%的“解放钟”枇杷酒中， 25±1℃恒温培养，以纸层析监控MLF的进行，培养3天后的纸层析中苹果酸消失，表示MLF结束，即可停止干酪乳杆菌R35培养。

     “解放钟”枇杷酒主要感官指标的变化见表2，使用R35进行了MLF反应的“解放钟”枇杷酒的总酸、pH值、挥发酯都发生了较大的变化。使用干酪乳杆菌R35的枇杷酒的苹果酸大量减少且总酸下降而pH值上升，降酸率达到31%，达到了生物降酸的效果；挥发酯是影响枇杷酒香气与风味的主要成分之一，适当含量的挥发酯会使酒香浓郁，有利于酒体醇厚风味和复杂性的形成，使用干酪乳杆菌R35经过MLF作用后的酒样挥发酯总量略有增加，表明干酪乳杆菌R35可以增加枇杷酒的香气与风味；柔和指数是葡萄酒酿造中评价协调的一个重要指标，试验引用葡萄酒中这一重要的评价指标来对干酪乳杆菌R35改善果酒风味的功效进行量化评定，结果表明干酪乳杆菌R35可以提高枇杷酒柔和指数，改良果酒品质从而使枇杷酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁。 

  

表2   . “解放钟”枇杷酒主要感官指标的变化

   

试验例3：干酪乳杆菌R35在“中华”猕猴桃酒中的应用

将干酪乳杆菌R35以9.7×10⁸cfu/mL接种量接入酒精度10﹪（v/v）、总酸14.9g·L^-1、总硫浓度为100mg·L^-1的猕猴桃酒醪中，22±1℃恒温培养，以纸层析监控MLF的进行，培养4天后的纸层析中苹果酸消失，表示MLF发酵结束，即可停止干酪乳杆菌R35培养。

“中华”猕猴桃酒主要感官指标的变化见表3，使用R35进行了MLF反应的猕猴桃酒的总酸、pH值、挥发酯和柔和指数都发生了较大的变化。使用干酪乳杆菌R35的猕猴桃酒的苹果酸大量减少且总酸下降，明显达到了生物降酸的目的；适当含量的挥发酯有利于猕猴桃酒醇厚风味和酒香复杂性的形成，使用干酪乳杆菌R35经过MLF作用后的酒样挥发酯总量略有增加，表明干酪乳杆菌R35可以增加猕猴桃酒的香气与风味；干酪乳杆菌R35还可以提高猕猴桃酒的柔和指数，改良果酒品质从而使猕猴桃酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁。 

表3   . “中华”猕猴桃酒主要感官指标的变化 

试验例4：干酪乳杆菌R35在“溪塔”刺葡萄酒中的应用

将干酪乳杆菌R35以9.7×10⁸cfu/mL接种量接入酒精度11.8﹪（v/v）、总酸8.9g·L^-1、总硫浓度为110mg·L^-1的“溪塔”刺葡萄酒醪中，20±1℃恒温培养，以纸层析监控MLF的进行，纸层析中苹果酸消失表示MLF发酵结束，即可停止干酪乳杆菌R35培养。

“溪塔”刺葡萄酒主要感官指标的变化见表3，使用R35进行了MLF反应的刺葡萄酒的总酸、pH值、挥发酯和柔和指数都发生了较大的变化。使用干酪乳杆菌R35的刺葡萄酒的苹果酸大量减少且总酸下降，明显达到了生物降酸的目的；适当含量的挥发酯有利于刺葡萄酒醇厚风味和酒香复杂性的形成，使用干酪乳杆菌R35经过MLF作用后的酒样挥发酯总量略有增加，表明干酪乳杆菌R35可以增加刺葡萄酒的香气与风味；干酪乳杆菌R35还可以提高刺葡萄酒的柔和指数，改良果酒品质从而使刺葡萄酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁。 

表3   .“溪塔”刺葡萄酒主要指标的变化 

以上试验所涉及到的试验方法如下：

1、总酸：指示计法(GB/T15038-2006)，以苹果酸计。

2、总硫、游离硫：直接碘量法（GB/T15038-2006）。 

3、酒精度：酒精计法（GB/T15038-2006）。 

4、挥发酯：GB/T17946-2008。 

5、柔和指数=酒精度－(总酸+单宁)，总酸以每升枇杷酒中相当于硫酸的克数来表示，单宁以g/L计。 

注：柔和指数＜5,表示酒体比较单薄、粗重；5≤柔和指数＜6，表示酒体较柔和；6≤柔和指数＜7表示酒体丰满、醇厚。 

Claims (5)

1.一种果酒生物降酸新菌株，该菌为乳杆菌属的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），命名为R35，该菌种已保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.3635 。

2.根据权利要求1所述的一种果酒降酸新菌株，其特征在于：在具有如下一个或多个条件的酒体内能正常生长：

SO₂含量                          120±10mg/L

酒精度（v/v）                    12±2%

pH值                             3.3±0.2

总酸（以苹果酸计）               1.0±0.2%

培养温度                         20±2℃ 。

3.根据权利要求1或2所述的一种果酒生物降酸新菌株，其特征在于：CGMCC No.3635，R35适宜的种子发酵培养基的组分为：番茄汁100mL，酵母膏7.4g，牛肉膏10g，葡萄糖30g，硫酸镁0.36g，苹果酸钠20g，吐温1g，胰蛋白胨15g，柠檬酸铵2g，加水补足1L，25～30℃培养。

4.根据权利要求1或2所述的一种果酒生物降酸新菌株，其特征在于：其制备方法包括：

A：CGMCC No.3635， R35的分离

（1）以新鲜的枇杷果实为原料，经挑选、清洗、去核去皮、破碎等工艺，制成枇杷果浆，分别调节枇杷果浆SO₂浓度范围在40～100mg/L,共分7个梯度，每个梯度SO₂浓度相差10mg/L，在20-25℃于发酵罐中进行自然发酵；采用纸上层析法，定性检测枇杷酒醪发酵过程的苹果酸乳酸含量，选择已进行苹果酸乳酸发酵（MLF）且SO₂浓度高于80mg/L的样品作为生物降酸乳酸菌的分离源；

（2）在无菌条件下，对已发生苹果酸乳酸发酵的枇杷酒样进行10倍梯度稀释，选取3个适宜的稀释度10^-1、10^-2和10^-3，使得平板菌落能够彼此分开，各吸取0.1mL，涂布于ATB分离培养基，每个稀释度做2个平行，置于28℃培养箱中恒温培养5～6d，挑取圆形稍扁平的单菌落，在MRS平板上进行4～5次划线传代，经显微镜镜检，获得纯菌株30株；通过糖发酵试验、吲哚试验、革兰氏染色和接触酶试验等常规检测技术，对这些菌株进行初步鉴定；首先对30株纯化菌进行糖发酵试验和吲哚试验，结果表明发酵管中培养液均变为黄色，且无气泡产生；吲哚试验试验均呈阴性，排除了这些菌株为大肠杆菌的可能性；后经革兰氏染色和接触酶试验，结果表明革兰氏染色均呈阳性，接触酶试验均呈阴性，因此可初步判定所纯化菌株为乳酸菌；最后通过纸层析法进行乳酸定性检测，有12株乳酸菌的乳酸层析点较大且清晰，其它18株乳酸菌的乳酸层析点较小且不清晰，即其苹果酸乳酸发酵能力较弱，可排除；最后得到12株苹果酸乳酸发酵能力较强的乳酸菌，对其进行编号并分别转移至改良TJA斜面培养基上，于4℃条件下保藏，备用；

B、CGMCC No.3635，R35的选育

将分离得到的乳酸菌R35分别以10⁷CFU/mL菌量接种于含总SO₂120mg/L、酒精度13%(v/v)、pH值3.0的MRS液体培养基中，于25～30℃恒温培养24小时测定菌量，同时进行耐受18℃培养温度的试验；将所得数据用DPS数据处理软件进行统计分析，考察各菌株对二氧化硫、酒精、pH值、低温的耐受性，筛选出能耐受如表1所示条件的CGMCC No.3635，R35，说明干酪乳杆菌R35具有耐受高酒精度、高硫和低温能力，是1株优良的果酒生物降酸乳酸菌；

表1  干酪乳杆菌R35对环境因子的耐受性

注：1）分离菌株对各环境因素的耐受能力以（A）^b（如（10.20±1.30）⁺⁺⁺）形式表示，其中：

A表示菌量增长倍数：A<1，表示菌量呈负增长；A≥1，表示菌量呈正增长

b表示菌量级别：“++++”表示平板计数菌量达10⁹CFU/mL水平；“+++”表示平板计数菌量达10⁸CFU/mL水平；“++”表示平板计数菌量达10⁷CFU/mL水平；“+”表示平板计数菌量达10⁶CFU/mL水平。

5.根据权利要求1所述的果酒生物降酸新菌株的应用，其特征在于：CGMCC No.3635，R35能够在含有苹果酸的果酒中进行生物降酸，所述的含有苹果酸的果酒是以含有苹果酸的水果为原料进行酒精发酵制成的。

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