CN109749962A

CN109749962A - 一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌及应用

Info

Publication number: CN109749962A
Application number: CN201910136386.1A
Authority: CN
Inventors: 许女; 陈旭峰; 贾瑞娟; 王如福; 李晓梅
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Xinjing Chenopodium Planting and Promotion Co.,Ltd.
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2039-02-25
Also published as: CN109749962B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，提供了一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌及应用。经宏基因组高通量测序表明植物乳杆菌是山西老陈醋的优势乳酸菌，从山西老陈醋发酵过程中筛选出一株耐受性强、产酸高、产香性能好的植物乳杆菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 15731。用该植物乳杆菌直投式发酵剂强化山西老陈醋生产，得到的新淋醋中总酸含量为5.14g/100mL，不挥发性酸含量为2.32g/100mL，总酯含量为4.16g/100mL，分别比对照组提高了36.70%、144.21%、40.54%，丰富了有机酸和挥发性香气的谱图及含量，显著改善了陈醋的口感和风味。

Description

一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌及应用。

背景技术

山西老陈醋发酵过程需要霉菌、酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等众多微生物共同参与，不同微生物在不同发酵时期的代谢及相互作用为老陈醋风味的形成奠定了物质基础。在酒精发酵阶段，霉菌和酵母起主导作用，而醋酸发酵阶段中主要依靠醋酸菌和乳酸菌将酒精发酵产物转化为醋酸、柠檬酸及其他各种有机酸，形成酸味的基础。乳酸菌能够产生乳酸等不挥发性酸，能够减缓总酸含量过高带来的尖酸刺激口感，使其酸味更加柔和、醇厚。此外，乳酸菌产生的乳酸及其他不挥发性酸与醇类物质生成乳酸乙酯等各种酯类物质，丰富了山西老陈醋的风味和香气。另外，乳酸菌是公认的益生菌，在消除疲劳、提高肝脏的解毒功能与新陈代谢、软化血管、降血脂、降低胆固醇、抗氧化等方面均有一定作用。

于迪等对山西老陈醋发酵过程中酒化阶段分离出的10株乳酸菌和醋化阶段分离出的25株乳酸菌进行产酸定量试验，酒精耐受性、乙酸耐受性、温度耐受性试验，最终筛选出产酸量高、耐受性好的菌株JL6，CL21；形态学特征结合16SrDNA序列分析对筛选出的2株优势乳酸菌进行鉴定。结果表明：菌株JL6为发酵乳杆菌，CL21为干酪乳杆菌。公布号为CN106434264 A公布了一种利用混合菌剂强化传统食醋固态发酵的方法，将瑞士乳杆菌、乳酸片球菌和芽孢菌、酵母菌制备的混合菌剂应用于食醋发酵过程，丰富了食醋产品的风味，提高了食醋产品的抗氧化性。公布号为CN107259260A公布了一种添加乳酸菌发酵的降火消食的枸杞果醋及其制作方法，制成的枸杞果醋具有营养丰富、消食清火、口感好、风味优的特点。

本发明建立在采用宏基因组高通量和传统菌种分离手段研究山西老陈醋发酵过程微生物群落变化的数据基础上，确认植物乳杆菌是陈醋发酵过程中的优势乳酸菌，从中分离筛选出一株耐受性强、产酸高、风味佳的植物乳杆菌，并将其高密度培养，干燥制成直投式发酵剂，多阶段强化传统固态食醋生产。

发明内容

本发明提供了一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌及应用。

本发明由如下技术方案实现的：本发明建立在采用宏基因组高通量测序明确山西老陈醋发酵过程中优势乳酸菌种类基础研究数据上，分离筛选出一株耐受性强、产酸高，发酵风味佳的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），并将其制备成直投式发酵剂，多阶段强化应用传统固态食醋生产。

所述山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月7日，保藏编号：CGMCC 15731。

所述植物乳杆菌CGMCC 15731的筛选方法为：采集山西老陈醋酒精发酵阶段初、中、末的酒醪样品和醋酸发酵阶段初、中、末的醋醅样品，采用宏基因组高通量测序技术确定乳酸菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化，采用传统菌种分离手段，从山西老陈醋发酵过程中分离出的90株乳酸菌中，筛选出的一株耐受10%的酒精度、250g/L的初始糖度、pH=4的酸度、50℃的温度、产酸24.78g/L、产香佳的植物乳杆菌。

所述优良土著植物乳杆菌CGMCC 15731的筛选方法具体步骤如下：

（1）采用宏基因组高通量测序技术明确乳酸菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：采集山西老陈醋酒精发酵阶段初、中、末的酒醪样品和醋酸发酵阶段初、中、末的醋醅样品，进行宏基因组提取，细菌16S rDNA V4区DNA片段扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；并采用传统稀释平板菌落计数法，采用MRS培养基对山西老陈醋发酵过程中乳酸菌的数量变化进行了测定。结果显示植物乳杆菌为山西老陈醋发酵过程中的优势乳酸菌。

（2）耐受性强、产酸高的优良土著风味乳酸菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离出的90株乳酸菌进行酒精度、酸、初始糖度、温度的耐受性及产酸性能的测定；最终筛选出的乳酸菌7耐受10%的酒精度、250g/L的初始糖度、pH=4的酸度、50℃的温度；产酸高（24.78g/L）、产香性能佳的乳酸菌7；并采用HPLC和GC-MS法对乳酸菌7的产有机酸和挥发性香气成分的种类和含量进行了系统测定。

（3）优良乳酸菌7的鉴定：对乳酸菌7进行形态学和16S rDNA测序鉴定，采用的引物为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，经鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月25 .日，保藏编号：CGMCC 15731。

植物乳杆菌CGMCC 15731制备成直投式发酵剂的制备方法：将活化后的植物乳杆菌CGMCC 15731按照3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃静置培养24h后，菌体浓度达到10⁸cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩植物乳杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v）混合，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，真空包装即植物乳杆菌直投式发酵剂，其活菌数为10¹¹cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。

将植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中的具体方法为：

高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水进行润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂（1g直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，37℃活化30min后备用），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅），再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂，控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标，有机酸及挥发性香气成分。

采用植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，得到的新淋醋中总酸含量为5.14g/100mL，不挥发性酸含量为2.32g/100mL，总酯含量为4.16g/100mL，分别比对照组提高了36.70%、144.21%、40.54%，并且还丰富了有机酸和挥发性香气的谱图及含量。

所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。

附图说明

图1为采用宏基因组高通量测序技术测定山西老陈醋发酵过程中乳酸菌属水平上的动态变化；

图2为采用宏基因组高通量测序技术测定山西老陈醋发酵过程中乳酸菌属种平上的动态变化；

图3为山西老陈醋发酵过程中乳酸菌数量的变化；

图4为90株乳酸菌中产酸占前10位菌株的产酸量；

图5为高产酸乳酸菌的酒精耐受性的筛选；

图6为高产酸乳酸菌的初始糖度耐受性的筛选；

图7为高产酸乳酸菌的pH耐受性的筛选；

图8为高产酸乳酸菌的温度耐受性的筛选；

图9为植物乳杆菌CGMCC 15731的菌落形态和细胞形态图；图中：A为植物乳杆菌CGMCC15731的菌落形态图；B为植物乳杆菌CGMCC 15731在1000×下的细胞形态图；

图10为植物乳杆菌CGMCC 15731的16SrDNA系统发育树图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：采用宏基因组高通量测序技术测定乳酸菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：

分别采集山西老陈醋酒精发酵阶段初、中、末（J0、Jm、Je）的酒醪样品和醋酸发酵阶段初、中、末（C0、Cm、Ce）的醋醅样品，进行宏基因组提取，细菌16S rDNA V4区DNA片段PCR扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；并采用传统稀释平板菌落计数法，采用MRS培养基对山西老陈醋发酵过程中乳酸菌的数量变化进行了测定。

上述的宏基因组提取方法为：取3g样品置-20℃预冷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉状后移至2 mL离心管；加入2mL抽提缓冲液 (1g/100mL的CTAB、2g/100mL的PVPP、8.78g/100mL的NaCl、3.73g/100mL的EDTA-Na、1.21g/100mL的 Tris、0.1mol/L的磷酸缓冲液)，37℃，200r/min条件下充分混匀30min；加入200µL 10g/100mL的SDS，65℃水浴2h，12000r/min，低温离心15min，取上清，冷却至4℃；加入等体积的酚‒氯仿‒异戊醇(V/V/V=25:24:1)，12000r/min，低温离心20min，取上清，重复3‒4次，直至中间蛋白层消失；加入等体积的氯仿‒异戊醇混合液(V/V=24:1)，12000r/min，低温离心15min，取上清；加入0.7倍体积的异丙醇，-20℃沉淀4h，12000r/min，低温离心 15min，取沉淀；用预冷的70%乙醇充分漂洗沉淀，置于室温待乙醇挥发完全后，溶于80µLddH₂O中；加入5µL 1mg/mL RNase A，37℃水浴20min。提取的DNA用微量紫外可见光分光光度计NanoDrop 2000进行检测，OD _260/280nm值维持在1.8‒2.0范围内，表明DNA质量合格，送至深圳华大基因进行测序。

上述的细菌16S rDNA V4区DNA片段扩增所用的引物为：515F：5’-GTGCCAGCMGCC

GCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGG TWTCTAA-3’，扩增片段长度为200bp。

高通量测序结果见图1，结果显示山西老陈醋整个发酵过程中，乳杆菌属为主要的乳酸菌属，在酒精发酵和醋酸发酵中分别占总乳酸菌的39.13%和38.90%，并且乳杆菌属中最主要的是植物乳杆菌（58%）。另外，采用MRS培养基对山西老陈醋整个发酵过程中的乳酸菌进行计数，结果显示，乳酸菌总数在整个陈醋发酵过程中都保持在10⁷ cfu/g以上，证明其是陈醋发酵过程中的主要细菌（见图2）。

上述采用的MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，K₂HPO₄ 2g，乙酸钠2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO₄ 0.2g，MnSO₄ 0.05g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调pH6.2‒6.6，121℃灭菌20min备用。

实施例2：耐受性强、产酸高的优良土著风味乳酸菌的筛选、鉴定与保藏

（1）高产酸乳酸菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离得到的90株乳酸菌，采用氢氧化钠滴定法进行产酸性能的测定。最终筛选出10株产酸性能高的乳酸菌（图3），其中乳酸菌7产酸最高，为24.78g/L；其次是乳酸菌57（22.58g/L）和乳酸菌5（21.06g/L）。

菌株产酸性能的具体测定方法为：将活化菌株按照2%的接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养24h后，取发酵液3mL，加入27mL蒸馏水稀释10倍，用0.05 %的NaOH溶液滴定至pH为8.2，记录下消耗的NaOH溶液体积。

（2）耐受性强乳酸菌的筛选：对产酸性能排在前10位的菌株进行酒精、酸、糖和温度的耐受性测定，最终筛选出的乳酸菌7耐受10%的酒精度、250g/L的初始糖度、pH=4的酸度、50℃的温度（见图4、5、6、7）。

菌株耐受性能的具体测定方法为：将活化菌株按2%接种量分别接种到不同酒精浓度（2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%）、不同pH梯度（2、3、4、5、6、7）的醋酸菌液体培养基中，分别于（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）静置培养24h后，测OD_600nm菌体浓度，比较各菌株的耐受性。

（3）产香乳酸菌的筛选：对产酸性能排在前10位的菌株进行有机酸和挥发性香气的测定。将活化菌株按3%的接种量分别接入MRS液体培养基、高粱汁培养基、醋醅模拟固体培养基中，37℃静置培养6天，测定有机酸和挥发性香气的种类和含量。

上述高粱汁培养基的制备方法为：将高粱200g粉碎至四至六瓣，加4倍的水润料4h后在温度为85‒90℃下糊化1h，期间不断搅拌，加入0.5g高温淀粉酶（70000U）于100℃蒸煮60min至不粘手无生心停火，冷却至室温过滤得滤液于121℃灭菌20min备用。上述醋醅模拟固体培养基的制备方法为：取自山西老陈醋醋酸发酵第0天的醋醅。

上述HPLC和GC-MS的具体测定方法如下：

HPLC法测定有机酸含量：取上述培养6天的样品5g，用超纯水定容至50mL，12000r/min离心5min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，上样。色谱测定条件为：液相系统UItimate3000；色谱柱C18 4.6×150mm，5μm；流动相20mmol/L NaH₂PO₄，pH=2.7；进样量20μL；流动速度0.8mL/min；检测器UV210nm；柱温：室温。

GC-MS法测定挥发性香气成分：采用顶空固相微萃取对上述培养6天的样品进行萃取，并采用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量。色谱条件：色谱柱为VF-5MS（30×0.25mm×0.25mm），载气：氦气，纯度99.999%，流量1mL/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃的速度升至160℃，保持1min。再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70eV，扫描质量范围41‒500amu。

乳酸菌7的有机酸和挥发性香气的种类和含量显著优于其他菌株，乳酸菌7的有机酸测定结果如表1所示，其在MRS液体培养基、高粱汁培养基和醋醅模拟培养基的有机酸含量分别达到2.1563g/L、2.5559g/L和2.8836g/L，其中乳酸是主要的不挥发性有机酸，其在三种培养基的含量都达到0.5g/L以上。

表1：山西老陈醋优势土著乳酸菌7的有机酸测定结果

乳酸菌7的挥发性香气成分测定结果如表2所示，在醋醅模拟固态培养基中产生的挥发性香气的种类和含量最高，共检测出33种挥发性香气成分（酯类12种、醇类8种、酸类2种、酮类3种、醛类4种、其他8种），其中酯类总含量为0.6552g/100mL、醇类总含量为2.8013g/100mL、酸类总含量为0.6125g/100mL、醛类总含量为0.0636g/100mL。乳酸菌7在MRS液体培养基、高粱汁培养基和醋醅模拟培养基的酯类总含量达到0.3g/100mL以上，其中辛酸乙酯、乙酸乙酯含量最高。

表2：山西老陈醋优势土著乳酸菌7的挥发性香气成分测定结果

（4）耐受性强、产酸高的土著风味乳酸菌7的菌株鉴定

形态学鉴定：用接种环挑取乳酸菌7少许在MRS平板培养基上进行划线，分离出单菌落，将培养基上生长的菌落拍照，进行记录，然后通过革兰氏染色镜检，观察其细胞形态特征。乳酸菌7在MRS培养基上的菌落以及细胞形态见图8，呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径分别为1.0‒1.2mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色均呈G⁺，菌体呈小短杆状。

16Sr DNA测序：用试剂盒提取乳酸菌7的基因组，进行16Sr DNA测序及菌种鉴定，引物为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，采用BLAST软件经同源性比较，结果表明乳酸菌7与已报道的Lactobacillus plantarum ZJ316（JN126052.1）的同源性在99.9%以上，确定其为植物乳杆菌，并构建系统进化树，见图9。并将其保藏在普通工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为植物乳杆菌CGMCC 15731。

实施例3：植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂的制备

将活化后的植物乳杆菌CGMCC 15731按3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃静置培养24h后，此时菌体浓度达10⁸cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩植物乳杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v）混合，通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，真空包装即得植物乳杆菌直投式发酵剂。

上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。

上述的低温喷雾干燥工艺参数为：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间6min，水分含量为≤5%。制备的植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂，活菌数为10¹¹cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。

实施例4：利用植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂强化山西老陈醋

高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，拌入前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅），控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标（pH、总酸、还原糖、总酯、不挥发酸、氨基氮、波美度）（结果见表3），有机酸（结果见表4）及挥发性香气成分（结果见表5）。

实施例5：以实施例4为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量0.5%的植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10mL无菌水中，37℃活化30min），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐进行酒精发酵8‒10天。

实施例6：以实施例4为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量0.5%的植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10mL无菌水中，37℃活化30min），进行醋酸发酵10‒12天。

实施例7：以实施例4为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量0.5%的植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐进行酒精发酵8‒10天；在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量0.5%的植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂，进行醋酸发酵10‒12天。

采用植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，提高了新淋醋的总酸、不挥发酸等理化含量以及有机酸和挥发性香气含量，而实施例7显著优于实施例4（对照例）。实施例7得到的新淋醋中总酸含量为5.14g/100mL，不挥发性酸含量为2.32g/100mL，总酯含量为4.16g/100mL，分别比对照组提高了36.70%、144.21%、40.54%（表3）；有机酸总含量由29.8663 g/L提高为38.6919 g/L，其中乳酸含量为15.5632g/L，比对照组提高了84.11%（表4）；挥发性香气成分共检测出39种（酯类17种、醇类4种、酸类3种、酮类5种、醛类7种、酚类1种、其他2种），酯类总含量为4.39g/100mL、醇类总含量为1.19g/100mL、酸类总含量为3.22g/100mL、醛类总含量为18.77g/100mL；其中具有水果香味的乙酸乙酯（1.09g/100mL）、具有白兰地香气的辛酸乙酯（0.42g/100mL）、呈蜂蜜香的苯乙酸乙酯（0.29g/100mL），他们构成了山西老陈醋的独特风味，使得陈醋酸不涩口，酸绵幽香（表5）。

表3：采用植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋理化指标的测定结果

表4：采用植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中有机酸的测定结果

表5：采用植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中挥发性香气成分的测定结果

上述山西老陈醋的pH测定用pH计直接测定；山西老陈醋的总酸参照GBT 5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的还原糖、总酯参照GBT19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的不挥发酸参照GB 18187-2000《酿造食醋》中单沸式蒸馏法进行测定；山西老陈醋的氨基氮参照GBT5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的波美度测定用波美比重计直接测定。

Claims

1.一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌，其特征在于：所述山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月7日，保藏编号：CGMCC 15731。

2.根据权利要求1所述的一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌的筛选方法为：采集山西老陈醋酒精发酵阶段初、中、末的酒醪样品和醋酸发酵阶段初、中、末的醋醅样品，采用宏基因组高通量测序技术确定乳酸菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化，采用传统菌种分离手段，从山西老陈醋发酵过程中分离出的90株乳酸菌中，筛选出的一株耐受10%的酒精度、250g/L的初始糖度、pH=4的酸度、50℃的温度、产酸24.78g/L、产香佳的植物乳杆菌。

3.根据权利要求2所述的一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌的筛选方法具体步骤如下：

（1）采用宏基因组高通量测序技术明确乳酸菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：采集山西老陈醋酒精发酵阶段初、中、末的酒醪样品和醋酸发酵阶段初、中、末的醋醅样品，进行宏基因组提取，细菌16S rDNA V4区DNA片段扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；采用传统稀释平板菌落计数法，采用MRS培养基对山西老陈醋发酵过程中乳酸菌的数量变化进行测定；

（2）耐受性强、产酸高的优良土著风味植物乳杆菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离出的90株乳酸菌进行酒精度、酸、初始糖度、温度的耐受性及产酸性能的测定；并采用HPLC和GC-MS法对优良菌株的有机酸和挥发性香气成分的种类和含量进行系统测定；

（3）优良菌株的鉴定：对优良目标菌株进行形态学和16S rDNA测序鉴定，采用的引物为：上游：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，经鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

4.权利要求1所述的一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌的应用，其特征在于：所述植物乳杆菌CGMCC 15731制备成直投式发酵剂应用在山西老陈醋的生产中。

5.根据权利要求4所述的一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌的应用，其特征在于：所述直投式发酵剂的具体制备方法为：将活化后的植物乳杆菌CGMCC 15731按照3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃静置培养24h后，菌体浓度达到10⁸cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩植物乳杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v混合，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%即为植物乳杆菌直投式发酵剂，其活菌数为10¹¹cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。

6.根据权利要求4所述的一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌的应用，其特征在于：所述植物乳杆菌CGMCC 15731制备的直投式发酵剂在山西老陈醋强化生产中的具体应用方法为：

高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的植物乳杆菌CGMCC15731直投式发酵剂，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入120公斤麸皮和80公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的植物乳杆菌CGMCC 15731直投式发酵剂，控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋得新淋醋。

7.根据权利要求6所述的一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌的应用，其特征在于：所得到的新淋醋中总酸含量为5.14g/100mL，不挥发性酸含量为2.32g/100mL，总酯含量为4.16g/100mL，分别比对照组提高了36.70%、144.21%、40.54%，并且还丰富了有机酸和挥发性香气的谱图及含量。

8.根据权利要求6所述的一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌的应用，其特征在于：所述火醅为前一批发酵第2天的醋醅。

9.根据权利要求5所述的一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌的应用，其特征在于：所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。