CN109906269A - 酵母菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆dbvpg36p，其在食品发酵生产中的应用和选择该菌株的方法 - Google Patents

酵母菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆dbvpg36p，其在食品发酵生产中的应用和选择该菌株的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109906269A
CN109906269A CN201880004158.2A CN201880004158A CN109906269A CN 109906269 A CN109906269 A CN 109906269A CN 201880004158 A CN201880004158 A CN 201880004158A CN 109906269 A CN109906269 A CN 109906269A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterial strain
grape
yeast
wine
serius
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880004158.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109906269B (zh
Inventor
M·保罗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioenologia 20 Srl
Original Assignee
Bioenologia 20 Srl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioenologia 20 Srl filed Critical Bioenologia 20 Srl
Publication of CN109906269A publication Critical patent/CN109906269A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109906269B publication Critical patent/CN109906269B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
    • C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/14—Yeasts or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G2200/00—Special features
    • C12G2200/05—Use of particular microorganisms in the preparation of wine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Alcoholic Beverages (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)

Abstract

本发明涉及一种鉴定为SERIUS并且以保藏号36P保藏在DBVPG的贝酵母亚种尤瓦鲁姆(Saccharomyces bayanus subsp.uvarum)菌株。本发明还涉及鉴定为SERIUS(DBVPG 36P)的贝酵母亚种尤瓦鲁姆菌株在通过酒精发酵获得的食品生产中作为食物接种物的应用，以及适用于酒精发酵，特别是葡萄的酒精发酵的酵母菌株的选择方法，包括从花分离这种酵母的分离步骤。

Description

酵母菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆DBVPG36P，其在食品发酵生产 中的应用和选择该菌株的方法
说明书
技术领域
本发明涉及一种属于贝酵母亚种尤瓦鲁姆(Saccharomyces bayanussubsp.Uvarum)的酵母菌株，以及从花中获得的用于酿酒的酵母的选择方法。此外，本发明涉及酵母菌株在食品发酵生产中的用途。
背景技术
在葡萄酒生产中使用发酵剂(starter)酵母培养物是实现控制和操纵发酵过程的基本实践。
术语选择的酵母或选择的发酵剂用于表示以生理学、生物化学和酿酒学特性为特征的酵母菌株，其在纯度方面针对发酵过程的技术需求进行优化(Pretorius，2000)。
选择的酵母的使用确保了发酵的迅速启动，因为加入葡萄汁(must)的酵母的质量和数量是经过精心挑选的；它允许操作者选择进行发酵而不将所述过程留给天然存在于不总是具有积极特征的葡萄中的酵母，从而更好地控制发酵过程；它减少了自发发酵过程中典型的停滞或减慢的问题；它可以实现良好的糖转化成醇，减少其他微生物在葡萄酒中形成而对其造成损害的可能性(例如醋酸菌)；它减少或消除了异常的感官特征，并且重要的是，它有助于标准化给定葡萄酒的生产，从而得到消费者年复一年的认可(Fleet和Heard，1993)。
主要地，酵母选择通过从葡萄汁或葡萄中分离酵母菌株而进行，所述酵母菌株经历发酵和酿酒表征测试。所述测试非常费力并且需要大量时间，因为他们设想研究酵母的许多生理和代谢特征。此外，葡萄汁和葡萄可以包含相同菌株的多个拷贝，由此存在分离所述多个拷贝并因此进行重复测试的风险。
重要的酿酒特征可以分为以下两组：具有技术重要性、影响酿酒过程进展的那些酿酒特征，以及影响葡萄酒质量、影响葡萄酒的化学和感官特征的那些酿酒特征(Zambonelli，2003)。术语技术特征被理解为意指与酵母的发酵活性相关的特征(无水酒精的产生能力，发酵力，发酵启动速率)，而质量特征包括有助于香气、并且更一般地涉及葡萄酒的感官品质的那些特征，例如产生甘油、挥发性物质和硫化物(Pretorius，2000；Fleet，2008)。
主要的技术特征包括发酵或酒精产生能力，根据Delfini的说法，这是由给定酵母通过含有过量糖的葡萄汁发酵产生的最大酒精含量(理解为乙醇百分比)(Delfini，1995)。由酵母在缺氧条件下的活性产生的主要乙醇是对所有微生物起抑制作用的化合物。因为，对于酿酒用途，酵母需要显著的性能特征，例如，对于具有高酒精含量的葡萄酒的生产，对乙醇的耐受性(醇耐受性)显然是至关重要的。
另一个重要的技术特征是发酵力(或发酵速率)，表达酵母引发发酵的速率，即使在法定允许剂量的抗菌剂的存在下和15℃至30℃之间的温度下。发酵过程的快速启动是酿酒酵母必须具备的特征之一，无论其使用类型如何(新鲜的或干燥的)，因此被认为是选择酵母进行酿造的基本要求。
另一个非常重要的特征是对二氧化硫SO2的耐受性，即在加入葡萄汁的选择剂量的SO2存在下保持未改变或足够高的发酵速率的能力，以避免氧化并获得合适的微生物稳定性。在生产添加SO2的葡萄酒的情况下，重要的是具有对抗菌剂耐受的菌株，以避免影响发酵过程的启动问题。
另一个重要方面涉及生长方法，即酵母细胞在出芽过程完成时的行为，因为所述特征可影响发酵过程的管理。酵母生长可以区分为粉状、絮凝状或聚集状生长。菌株的沉降速率是另一个积极的特征，因为它有助于葡萄酒澄清和过滤操作。
以搅动最甚和最持久的方式使葡萄酒混浊的菌株是产生泡沫的菌株。泡沫产生能力是菌株依赖性特征，与细胞壁的疏水性相关。在许多菌株(20-30％)中，细胞粘附于发酵过程中产生的CO2气泡，这些气泡在到达表面时，不是分解，而是融合在一起并增加体积，从而产生泡沫，由于细胞的存在呈灰褐色。在初级发酵和再发酵中，泡沫的缺乏或减少是一个积极的特征，因为它减少了占据的体积。
关于定性特征，随后将详细描述，主要考虑因素包括：
-硫化氢产量低或为零；
-苹果酸的产生或降解(作为葡萄汁和葡萄酒年份的函数)；
-高甘油产量；
-低乙酸产量；
-高芳香潜力。
从定性的角度来看，硫化物主要由硫化氢(H2S)和二氧化硫(SO2)组成；所述化合物总是由作为葡萄酒发酵剂商购的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株产生，即使根据菌株存在不同和可变的量。
使用不产生或产生低H2S的酵母的酿酒对于那些特别倾向于“还原”的品种特别有利。实际上，硫化氢是轻质硫醇的主要化合物，并且具有臭鸡蛋气味的缺点。显示嗅觉缺陷的葡萄酒可追溯到H2S的存在，后者的浓度在0.8到80μg/l(微克/升)之间变化(Suzzi和Tofalo，2014)。H2S还可以与葡萄酒中存在的其他化合物反应，改变芳香分布。这主要是在酒精发酵过程中由酵母作用产生的。
因此，使用不产生硫化氢或产生极少量硫化氢的酵母，不仅可以使发酵更清洁、葡萄酒更香，而且还可以延迟和/或避免在发酵完成时的倒灌(racking)，使葡萄酒在酒底(lee)保持更长时间，随后富含甘露糖蛋白和酵母裂解产生的其他物质。已知酿酒酵母中的H2S产量范围为0μg/升至300μg/升，产生的量是菌株依赖性特征。此外，文献资料显示，只有约1％的酿酒菌株不能产生H2S(Zambonelli等，1984)。
此外，酵母产生的SO2显示出广泛的可变性。产生大量SO2(100-120毫克/升)的某些菌株也有产生大量乙醛的趋势(以防御所述防腐剂)，结果是在发酵完成时高浓度的结合SO2，这会影响葡萄酒的质量。因此，在酿酒起始菌株选择操作期间，应优先选择产生低水平SO2(最大值为10-20mg/l)的菌株(Vincenzini等，2005)。
关于在酒精发酵过程中产生苹果酸，这在大多数涉及优质白葡萄的酿酒过程中具有优势，因为大量苹果酸的存在使得所得到的葡萄酒具有增强的新鲜感，特别是与酒石酸相比，酸性感觉被认为更强烈。
另一个优点是苹果酸的产生允许较低的pH，导致二氧化硫活性增加，并且通常除了增加总酸度外还增加微生物稳定性。酿酒酵母产生苹果酸已经在已知技术中描述用于某些低温耐受性酵母，其能够在发酵过程中产生高达1g/l的苹果酸(Castellari等，1994)。
酵母发酵的另一种次要产物是甘油。
在乙醇和二氧化碳之后，甘油是在酒精发酵过程中产生的最大量的化合物。这显著影响了葡萄酒的“主体”，有助于赋予葡萄酒“丰满”和“甜味”的特征，感知阈值相当于约5.2g/l。葡萄酒中存在的甘油浓度取决于葡萄酒中存在的糖浓度、发酵条件和酵母菌株。
特别地，在酿酒过程中，酵母可以产生2至10g/l，这取决于酵母种类和菌株。通常，酿酒酵母是产生最少量甘油的酵母，这是其高乙醇产量的主要原因。实际上，这种化合物不是二次发酵产物，因为它直接来自糖，各菌株不同，产生的量与糖的浓度成正比(Zambonelli等，2000)。
在次要产物中，即使是负面的，乙酸也起着非常重要的作用，在发酵过程中，乙酸是由于乙醛氧化导致的糖降解(Ribéreau-Gayon，2000)。除了酵母种类之外，产生更多或更少量乙酸的能力是随菌株而变化的特征。
所述产生乙酸的能力实际上由术语发酵纯度定义，并表示为所形成的挥发性酸度与产生的乙醇之间的比率。最佳菌株是具有最低发酵纯度值的菌株，并且通常，用于酿酒末端的酵母不应产生高于0.4g/l的乙酸量。
然而，葡萄酒的挥发性酸度可能是几种来源的结果，而不仅是酵母活性的结果。实际上，葡萄酒中乙酸的最终浓度也取决于葡萄的质量和酿酒条件。乙醛是发酵过程中形成的最重要的羰基化合物，占葡萄酒醛含量的90％以上。它是酒精发酵的常规产物，其在葡萄酒中的含量可以显著变化(10-300mg/l)，这取决于酵母菌株和酿造条件，以及乙醛结合的二氧化硫浓度。乙醛含量的评价用作葡萄酒氧化程度的指标。葡萄酒中低浓度的所述化合物使后者具有令人愉快的水果香气；然而，在浓度增加时，它会产生刺激性和氧化性气味以及类似草药的味道，从而导致当乙醛浓度超过500mg/l时使葡萄酒不再适销。
对于白葡萄酒，平均值通常为80mg/l。已知决定乙醛含量变化的主要因素之一是酵母菌株。同样也已知二氧化硫可以诱导酵母产生乙醛，因为酵母本身对二氧化硫的耐受性之间的相关性。
通常由正丙醇、异丁醇、戊醇和2-苯基乙醇在葡萄酒中代表的高级醇是酵母二次发酵产物，并且是能够显著影响葡萄酒香气的化合物。所述化合物主要来源于葡萄汁中存在的氨基酸的代谢，但也来自葡萄糖的代谢，而不涉及前体氨基酸。实际上，葡萄汁中存在的氨基酸的量与葡萄酒中存在的高级醇的量之间没有直接的相关性。所述化合物的产生主要是由于酵母菌株的作用，可以产生100-500mg/l，这取决于培养基的组成、氧的可用性、氮源和初始糖浓度。一般来说，当它们的总浓度低于300mg/l时，它们会对香气的复杂性产生积极影响，而当浓度高于400mg/l时，它们会给产品带来负面质量(Suzzi和Tofalo，2014)。唯一的例外是2-苯基乙醇，它释放玫瑰香味的香味，即使在高浓度下也能对葡萄酒的香气产生积极影响(Vincenzini，2005)。
在发酵过程中，酵母可以产生由乙酸和脂肪酸(主要是中链)与葡萄酒中存在的乙醇或其他醇缩合而产生的酯，并且它们自身也通过酵母代谢产生。酵母酯酶活性在酿酒过程中非常重要，因为它对葡萄酒的感官特性具有强大的影响，产生大部分和最重要的发酵香气。酯类对葡萄酒质量的影响可能是负面的和不受欢迎的，特别是在乙酸乙酯的情况下，它赋予典型的醋或甚至溶剂香味。另一方面，乙酸异戊酯或乙酸异丁酯的产生是积极的，因为它是水果特性的原因。
发明内容
本发明的范围是提供一种来自贝酵母亚种尤瓦鲁姆的酵母菌株，其具有技术和酿酒特征，允许葡萄汁的良好发酵，从而产生具有增加和均衡芳香复杂性的令人愉悦的葡萄酒。
另一个范围是提供一种大量产生苹果酸和甘油的菌株，同时在酒精发酵过程中不产生硫化氢。
本发明的另一个范围是鉴定适合用作亲本菌株的酵母菌株，以获得具有酿酒潜力的酵母杂种。
提供用作发酵活化剂的酵母自溶物也是本发明的范围。
本发明的范围还是优化选择用于酿酒用途的酵母菌株的完善和快速方法，特别是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和从花中分离的贝酵母(bayanus)。
上述范围是通过如权利要求1所述的酵母菌株实现的，并且精确地通过贝酵母亚种尤瓦鲁姆的菌株鉴定为SERIUS，保藏在DBVPG，保藏号为36P，以及通过用于酿酒的酵母菌株的选择方法实现的，该菌株的特征随后列出，准确来说是通过选择适用于酒精发酵，特别是葡萄的酒精发酵的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(Saccharomycesbayanus)和贝酵母亚种尤瓦鲁姆的酵母菌株的方法，所述菌株从花中分离出来。
根据本发明的酵母菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆具有最佳的技术和定性的酿酒特征，并且已经从威尼托(Veneto)地区的花中分离出来，具有高葡萄酒产生活性。该菌株鉴定为SERIUS，并根据布达佩斯条约，于2016年5月24日在位于佩鲁贾的“工业酵母保藏中心”DBVPG保藏，保藏号为DBVPG 36P。
选择该菌株还因为其基本上不产生硫化氢，这是酵母属酵母菌株中非常罕见的特征。实际上，在优选用于验证产生H2S的能力的Biggy琼脂培养基的平板上，菌落是白色的，因此证明菌株不能产生这种代谢物。
用这种酵母观察到的另一个积极方面涉及甘油的产生。实际上，在葡萄汁中，相对于用作对照的市售酿酒酵母菌株，该菌株产生更高浓度的甘油。
有利地，已经在白浆果葡萄汁和红浆果葡萄汁中分析了产生的甘油的量，并且对于这两种类型的葡萄，相对于用市售参考菌株获得的相应葡萄汁，天然产生的甘油的量更大。
有利地，使用根据本发明的菌株生产的葡萄酒的甘油浓度具有该菌株天然产生的甘油浓度，其高于约8.5g/l，优选高于约9.5g/l，更优选高于约10g/l。
通过术语“由菌株产生”(在本文中和在类似的背景下)，应理解该化合物已经由使用该菌株的发酵产生，并且未人工添加。
选择根据本发明的菌株还因为它具有产生苹果酸的出乎意料的能力。
有利地，本发明的菌株具有生产葡萄酒的能力，所述葡萄酒的苹果酸含量高于约0.5g/l，优选高于约1g/l，更优选高于约2g/l。该分子在酿酒过程中特别有利，特别是对于优质白葡萄过程，因为它赋予葡萄酒增强的新鲜感。
另一个有利的方面是这样的事实，即大量的苹果酸可以使葡萄酒具有较低的pH，这一特性允许更大的二氧化硫活性。
仍然有利的是，本发明的菌株具有出乎意料的高苹果酸产量，使得可以获得增加的葡萄酒的微生物稳定性，同时提高总酸度。
由于其技术特性，SERIUS菌株因此明显优于目前可获得的市售菌株。
有利地，该菌株具有良好的发酵能力，平均重量损失值类似于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的市售酵母中观察到的那些，并且发酵结束时间随使用的葡萄汁类型和发酵温度的变化而变化，在最佳发酵温度下的持续时间为10至15天。
仍然有利的是，本发明的菌株即使在低温下，特别是在12℃至15℃的温度下也具有良好的发酵能力，因此也允许其在低温下用于发酵葡萄酒，因此增加了激活适合改善葡萄酒质量的导致芳香性化合物的产生的特定的已知生化反应的可能性。
对于本发明的菌株，还评估了在天然白葡萄汁和红葡萄汁中产生乙酸的能力，并且所得结果表明菌株SERIUS的特征在于能够维持非常低的挥发性酸度值；特别地，与用市售酿酒酵母菌株进行的比较发酵得到的值相比，所获得的值通常较低。
还基于其所谓的杀伤活性，即产生导致其他酵母死亡的毒素的能力，选择了本发明的菌株；实际上，在使用菌株混合物的情况下，待使用的菌株必须彼此相容，即不能产生能够抑制混合物中存在的其他菌株的杀伤毒素。从进行的分析中，有利地显示菌株SERIUS不会抑制其他酵母，甚至更有利地，菌株不会被任何测试的酵母抑制。
根据Vaughan-Martini&Martini，通过对核糖体操纵子的ITS(内转录间隔物)区域测序，然后通过与系统发育更相关的酵母属菌种可获得的同源区域进行比较(Meyen exRees(1870))，对该菌株进行分类学分类；所述分子分析鉴定菌株SERIUS为贝酵母亚种尤瓦鲁姆。
如Zilio等所述，通过使用酶Hinf I分析线粒体DNA限制性酶切谱，还对该菌株进行基因型表征，详细描述参见实施例1，1.6节，并且根据方法进一步通过使用特定的分子标记物(称为微卫星)，也在实施例1，1.6节中详细描述。
如果在限制性营养条件下转移到合适的培养基中，则根据本发明的菌株能够产孢。在SP培养基(1％乙酸钾；0.1％酵母提取物；0.05％葡萄糖；1.8％琼脂)中在25℃温育7-10天获得诱导菌株SERIUS孢子形成的改善条件。
在合成和天然葡萄汁中生长期间已观察到该酵母的其他积极方面(实施例2)。
形成本专利主题的酵母具有下面报道的酿酒特征：2天后消耗的糖(发酵活力)约为4-5克/100毫升；7天后消耗的糖约为15-17克/100毫升；在最佳温度下发酵的持续时间是10-15天；低泡沫产生。
用该酵母观察到的特别有利的积极方面涉及基本上不存在的H2S的产生。
此外，该菌株对SO2浓度的耐受性至少为50，优选为100，甚至更优选为200，更优选为300ppm。
该菌株还具有高的铜耐受性，特别是它能够耐受300μmol/l(微摩尔/升)的铜浓度。有利地，所述铜浓度也显示出优于等于约50-100μmol/l的市售酵母菌株的铜耐受性。
优选地，菌株在适当的冷冻保护剂(40％w/w甘油)存在下以冷冻形式(-80℃)储存或通过冷冻干燥/干燥保存。使用本领域技术人员已知的方法实现冷冻或冻干/干燥。
根据使用者的要求，根据本发明的菌株可以有利地以乳膏形式、干燥形式，冻干形式或糊剂形式工业化。
根据本发明的菌株适于在通过酒精发酵获得的食品生产中用作食品接种物。可用这种酵母生产的食品包括例如面包，乳基产品，苹果酒，啤酒(bear)，起泡酒(spumante)和葡萄酒。然而，也可以想到从其他水果或谷物(例如小麦或大米)的酒精发酵获得的其他酒精饮料。该菌株还适合用作膳食补充剂或食品中的益生菌。初步表征测试表明该菌株对酸度和胆汁盐具有耐受性，因此具有胃转运的存活可能性。
有利地，本发明的贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS特别适用于产生酵母自溶物，用作葡萄酒和其他酒精饮料生产中的发酵活化剂。
根据本发明的一个优选的实施方式，该菌株在酿酒中用作接种物以获得葡萄酒，例如红葡萄酒、玫瑰葡萄酒或白葡萄酒。此外，它还可以用于初级发酵和再发酵。
有利地，在酿酒过程中使用本发明的菌株允许产生具有令人愉悦和均衡的香气，具有基本上不存在的H2S浓度，高甘油浓度和高苹果酸浓度的葡萄酒。
有利地，葡萄酒是由选自白浆果葡萄和红浆果葡萄的葡萄酿制的葡萄酒。此外，所述葡萄可以源自本地葡萄品种和国际葡萄品种。
特别是，对选自卡尔卡耐卡(garganega)，肯纳(kerner)，特雷比奥罗(trebbiano)，墨尔乐(merlot)，马斯卡斯奈莱洛(nerello mascalese)，黑珍珠(nero d'avola)和琼瑶浆(traminer)的葡萄进行的葡萄酒酿造测试使得获得具有令人愉悦的香气和均衡风味的葡萄酒成为可能。
根据本发明的优选实施方案，菌株SERIUS用于生产含有由该菌株天然产生的以下浓度的甘油和苹果酸的葡萄酒：甘油高于约8.5g/l，优选高于约9.5g/l，更优选高于约10g/l；苹果酸高于约0.5g/l，优选高于约1g/l，更优选高于约2g/l。菌株SERIUS可以容易地培养，因此特别适合使用已知的标准方法生产生物质，甚至在工业规模上。
优选地，使用菌株SERIUS的生物质生产发生在含有右旋糖，酵母提取物，维生素和矿物盐的合成培养基上，进行分批式发酵(前24小时)，然后进料分批式发酵另外20-24小时。仍然优选地，生长发生在29至31℃的温度下。该菌株产生乙醇，因此特别适用于食品发酵。该菌株对人或动物无致病性。
本发明的另一方面涉及一种食品接种物，其由被鉴定为SERIUS(DBVPG 36P)的贝酵母菌株组成。
优选地，食品接种物是葡萄酒发酵剂。
本发明的另一方面涉及通过根据本发明的用途可获得的葡萄酒。有利地，葡萄酒是从选自白浆果葡萄和红浆果葡萄的葡萄发酵中获得的葡萄酒。有利地，所述葡萄可以来自天然葡萄品种和来自国际葡萄品种。
能够在通过酒精发酵生产食品的过程中用作食品接种物的通过本发明的菌株SERIUS的繁殖和/或倍增获得的酵母贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS的培养物也应理解为受本发明的保护。根据本发明优选的实施方案，所述菌株适合用于生产葡萄酒的酒精发酵过程，即酿酒过程。
特别优选的是可从本发明的菌株SERIUS的繁殖或倍增获得的培养物，其适合用于生产由选自白浆果葡萄和红浆果葡萄的葡萄生产的葡萄酒，其中所述葡萄可来自本地葡萄品种和国际葡萄品种。
优选地，所述培养物适用于生产含有由该菌株天然产生的以下浓度的甘油和苹果酸的葡萄酒：甘油高于约8.5g/l，优选高于约9.5g/l，更优选高于约10g/l；苹果酸高于约0.5g/l，优选高于约1g/l，更优选高于约2g/l。
与它们的菌种无关，众所周知的是，酵母可以有性繁殖以确保菌种的生存，创造遗传多样性，杂交是这种有性繁殖周期的重要组成部分，它可以存在于自然界中，也可以在实验室里被诱导。根据绝对非GMO的方法，上述杂交允许获得源自亲本菌株的新型酵母杂种。因此，杂交菌株的建立是天然酵母的进化模式。
因此，通过所谓的种内杂交，通过菌株SERIUS与属于相同菌种的酵母菌株或者更确切地说酵母(Saccharomyces)菌株杂交而获得的酵母菌株也形成本发明的一部分。
然而，不排除根据本发明的实施方式，可以通过种间杂交使菌株SERIUS与来自其他菌种的酵母菌株杂交来获得菌株。
本发明的另一方面涉及适用于酒精发酵，特别是葡萄的酒精发酵，来自花的酵母菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，贝酵母(Saccharomyces bayanus)和贝酵母亚种尤瓦鲁姆菌株的选择方法。显然，从花中取样也可以转移到其他菌株分离基质(例如果实，药草)。
根据本发明的选择方法优选包括从花中分离酵母的步骤，优选酵母鉴定步骤，平板上分离的酵母的接种阶段，以鉴定不产生或产生极少H2S的菌株，以及在葡萄汁中的接种阶段和葡萄的酿造，目的是研究葡萄酒的技术和质量特征。
优选地，使用的葡萄是选自白浆果葡萄(white berry grapes)或红浆果葡萄(redberry grapes)的葡萄。
根据本发明方法的优选实施方案，分析在上述酿造步骤中获得的葡萄酒，并测定其中存在的甘油和苹果酸的浓度。还进行了感官评估，目的是识别可追溯到存在硫化化合物的令人不快的气味。特别注意鉴定由于存在H2S而导致的还原缺陷。随后，选择具有增强的发酵活力的菌株，产生其中甘油和苹果酸的浓度满足以下限制的葡萄酒：甘油高于约8.5g/l，优选高于约9.5g/l，更优选高于约10g/l；苹果酸高于约0.5g/l，优选高于约1g/l，更优选高于约2g/l；此外，感官检查必须不给出由于存在H2S而导致的还原缺陷的嗅觉，即优选小于1-1.5μg/l。
有利地，已经显示对这种特定化合物组合的分析非常适合于替代更加艰辛的表征过程，以及产生具有令人愉悦和均衡香气的葡萄酒的菌株的发现。
在本发明的一个优选变体中，来自先前指定适合用于酒精发酵(特别是葡萄的酒精发酵)的酵母菌种的酵母菌株的选择方法包括以下步骤：
a)花的取样，优选在春季和葡萄酒生产活动较高的区域，甚至更优选远离酿酒厂，以避免被酿酒厂中使用的市售酵母污染，这些酵母不仅存在于酿酒厂，而且也在毗邻地区中存在；
b)在合适的基质上发酵样品并在分离培养基上培养发酵的样品，所述分离培养基优选含有溴甲酚绿；
c)如果分离培养基含有溴甲酚绿，则基于菌落形态和颜色鉴定推定的酵母属的酵母菌株，并且与具有较低酿酒学意义的非酿酒酵母区别开；
d)通过对步骤b)或步骤c)中分离的酵母菌落的遗传分析鉴定属于酵母属的分离物；有利地，使用分子方法进行的所述遗传分析能够鉴定菌种来源以及鉴定给定菌种内存在的各种菌株，或更确切地说是个体；
e)步骤d)中选择的菌株对合成葡萄汁和/或天然葡萄汁的实验室发酵，随后选择具有最有意义的技术和酿酒特征的菌株，同时在Biggy琼脂培养基中接种该菌株以确定其不产生或极少产生硫化氢；
f)在步骤e)中选择的菌株的酿酒厂酿造和基于对获得的葡萄酒的化学分析获得的结果选择最合适的菌株，优选包括pH，残余糖，醇，总酸度，挥发性酸度参数，特别地，甘油、苹果酸和优选硫化氢的量，其中后者通过嗅觉手段评估。
优选地，对于步骤a)和b)，通过避免用手接触花并且对采样设备进行定期消毒来执行花的收集及其后续处理，目的是尽可能地限制污染。
作为非限制性实例，在到达实验室时，将花转移到含有200ml合成葡萄汁或其他能够维持任何存在的酵母的生长的培养基的无菌烧瓶中。为了避免任何细菌的增殖，向每个样品中加入抗生素已被证明是特别有用的。
有利地，制剂用无菌石蜡油覆盖，以避免表面霉菌的生长。
在随后的步骤b)或c)中处理具有明显发酵的样品以分离酵母。用于所述步骤的非常合适和优选的分离培养基是WL琼脂分离培养基(4.0g/l酵母提取物，5.0g/l胰蛋白胨，50g/l葡萄糖，550mg/l磷酸二氢钾，425mg/l氯化钾，125mg/l氯化钙，125mg/l硫酸镁，2.5mg/l氯化亚铁，2.5mg/l硫酸锰，22mg/l溴甲酚绿，20g/l琼脂，最终pH5.5±2)。该培养基的显著特征是它含有染料溴甲酚绿，其能够以不同程度被酵母吸收。因此，可以基于菌落形态和它呈现的颜色来表征微生物。属于酿酒酵母属的菌株很难吸收溴甲酚绿，因此它们的菌落呈现从奶油色到绿色不同的颜色，从而与任何非酿酒酵母区别开。
有利地，溴甲酚绿的使用和步骤c)的实施允许简单地裁减，并且在该方法的初始步骤中，菌株数量有待于后续步骤d)。
仍然有利地，根据本发明方法的一个执行变体，在步骤d)之前，通过在合适的培养基上进行一次或多次再接种来对待分析的菌落进行纯化。优选地，在WL琼脂生长培养基上进行任何再接种。有利地，重复该过程以确保每个分离物明确地源自单个菌落。
步骤c)对于分离属于酵母属的菌株已经有一定程度的选择性，但除了酵母菌之外，还有其它菌株在该培养基中可显示出与酵母菌酵母非常相似的形态和着色。因此，为了从样品中清除这些菌株并对分离物进行确定的鉴定，优选进行步骤d)，通过快速且简单的遗传方法，可以进行分离物的大规模筛选，从而清除不属于酵母属的酵母，并在给定菌种的框架内鉴定存在的任何菌株(＝个体)。
有利地，所述初步遗传评估降低了对可能不适合葡萄酒生产的酵母进行技术表征的风险，并且同样有利地允许排除可能存在于给定样品中的相同菌株的任何多个拷贝。
仍然有利地，所述初步分析避免了对不属于酿酒酵母属的菌株进行技术和化学测试的需要。
进一步有利地，所述分析使得可以仅对真正不同的菌株进行技术和酿酒表征，而不是对同一菌株的任何可能的多拷贝进行。
为了确认酵母属的来源并因此排除从酿酒学的观点来看不感兴趣的属于其他属的酵母，优选使用遗传表征——设想使用PCR技术。能够识别各种酵母菌种的特定PCR技术和本领域技术人员已知的RAPD-PCR(随机扩增多态DNA分析)技术可用于此目的。
有利地，在使用PCR方法不能够进行可靠的菌株鉴定的情况下，可以采用rDNA序列的潜在分析；该分析使得可以区分酿酒酵母、贝酵母和贝酵母亚种尤瓦鲁姆这些与系统发育密切相关且具有高酿酒学意义的菌种，鉴定具有允许它们在葡萄酒中存活和生长的代谢特征的菌种。优选地，测序涉及核糖体操纵子的ITS(内转录间隔物)区域。
根据本发明方法的优选实施方案，步骤d)中菌株水平的遗传表征通过分析总DNA的酶消化获得的线粒体DNA限制性酶切谱来进行。优选使用酶Hinf I进行总DNA的酶消化。这种类型的遗传分析使得可以将酵母组合成组，每组具有不同的遗传谱，对于属于该组的所有分离株是共同的。基于收集的遗传数据，然后可以对收集的酵母进行筛选，避免选择相同菌株的多个拷贝。
根据本发明方法的一个执行变体，通过线粒体DNA的限制性多态性分析的遗传表征与微卫星分析结合使用。微卫星是非编码DNA的重复序列，由非常短的重复单元(1-5bp)组成，排列为串联重复序列，可用作遗传基因座的分子标记。根据本发明方法的优选实施方案，对八种最易变的基因座进行贝酵母亚种尤瓦鲁姆菌种的微卫星分析，如Masneuf-Pomarede等人在2016年描述。随后详细报告分析条件(实施例1，1.6节)。通常，对以下每个基因座进行反应：SuYIL130W(16个等位基因形式)，SuYHR102W(8个等位基因形式)，SuYKR045C(10个等位基因形式)，SuHTZ1PLB3(7个等位基因形式)，SuARS409(5个等位基因形式)，SuYHR042-043(5个等位基因形式)，SuYBR049C(5个等位基因形式)，SuYGC170W(4个等位基因形式)。随后，为了定义菌株的图谱和表征，除了琼脂糖凝胶电泳迁移之外，根据已知方法进行与上述八个基因座相关的PCR产物的扩增。
有利地，根据本发明的方法，在步骤d)之后，任选地，用于表征酵母贝酵母亚种尤瓦鲁姆，通过多重PCR，优选两个多重PCR反应(定义为多重PCR1和多重PCR2)，进行上述八个基因座的进一步分析。通过所述多重PCR，可以同时扩增多于基因座。特别地，多重PCR1和多重PCR2分别允许扩增三个和五个基因座。详细地，多重PCR1允许分析基因座SuYIL130W，SuYHR102W和SuYGC170W的DNA-微卫星谱，而多重PCR2使得可以获得基因座SuYKR045C，SuHTZ1PLB3，SuARS409，SuYHR042-043和SuYBR049C的DNA-微卫星谱。
任选地，根据本发明方法的优选实施方案，在步骤e)之前进一步表征酵母贝酵母亚种尤瓦鲁姆，可以基于扩增四个基因座通过毛细管电泳进行进一步的遗传分析，所述基因座表征为根据文献中报道的数据具有更多数量的等位基因形式。
有利地，所述表征使得可以定义所考虑的基因座的PCR产物的确切大小。
根据本发明，考虑的位点如下：SuYIL130W，SuYHR102W，SuYKR045C和SuHTZ1PLB3。
优选地，为了在技术水平上表征步骤e)，评估以下参数：发酵活力，理解为2天后和7天后消耗的糖量，以及发酵持续时间，泡沫产生能力，生长类型，硫化氢产生(在BiggyAgar培养基上)，甘油产生，挥发性酸度产生，产生或降解苹果酸的能力，发酵物的嗅觉分布。
关于发酵的进展，在合成葡萄汁和/或天然葡萄汁的样品上监测这些，优选在两种类型的葡萄汁上进行监测。监测的主要参数优选涉及：pH，残余糖，醇水平，总酸度，挥发性酸度，发酵活力，甘油产生，苹果酸的产生/降解，嗅觉分布。步骤f)的酒厂酿造试验优选在来自白浆果葡萄的葡萄汁和来自红浆果葡萄的葡萄汁上进行。
有利地，根据具体需要，分析来自白浆果和红浆果的葡萄汁中菌株的发酵进程使得可以检查进展并评估菌株的活性以产生白葡萄酒、玫瑰葡萄酒和红葡萄酒。
特别有利地，根据本发明的方法的酿酒阶段在来自国内葡萄品种和国际葡萄品种的葡萄上进行。优选地，在获得的葡萄酒中测定甘油、苹果酸和硫化氢的浓度，并且选择葡萄酒产生菌株，其中浓度满足以下限制：甘油高于约8.5g/l，优选高于约9.5g/l，更优选高于约10g/l；苹果酸高于约0.5g/l，优选高于约1g/l，更优选高于约2g/l；硫化氢低于嗅觉水平，即小于约1-1.5μg/l。有利地，使用SERIUS菌株生产的葡萄酒的特征在于存在大量甘油和苹果酸，同时特别减少硫化氢的量。特别地，由本发明的菌株生产的葡萄酒具有超过9g/l的量的甘油，超过1.1g/l的苹果酸和低于感知的嗅觉水平的量的H2S。
所检查的技术和化学参数可以根据菌株所需的特征而变化，并且还取决于使用所选菌株生产的葡萄酒的类型。考虑到所有分析的所有结果，在各个步骤结束时选择最合适的菌株优选是组合选择。
该选择方法保证筛选源自花的多种酵母分离物。
在实施例1、2和3中已经描述了执行各个步骤的特定示例。各个步骤应该被认为是彼此独立的，即，以限定的方式执行步骤d)不会自动地暗示，例如，步骤e)的执行正如实施例中所报告的那样。步骤内的参数(例如，测试中的技术参数的类型)可以独立于其他步骤而改变。
附图简要说明
图1报道了基于ITS序列构建的系统发育树(phylogenetic tree)，其中本发明的菌株SERIUS表示为P16063.BI01；
图2显示了使用酶Hinf I获得的本发明菌株的线粒体DNA限制性酶切谱，由数字1)表示，其中表示为M的谱对应于分子量标记物；
图3显示了通过在八个最易变的基因座上扩增来自菌株SERIUS的DNA而获得的每种PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。显示的加载顺序如下：
(M)O’Gene Ruler标记物(Fermentas公司)，
(1)基因座SuYIL130W的PCR产物，
(2)基因座SuYHR102W的PCR产物，
(3)基因座SuYKR045C的PCR产物，
(4)基因座SuHTZ1PLB3的PCR产物，
(5)基因座SuARS409的PCR产物，
(6)基因座SuYHR042-043的PCR产物，
(7)基因座SuYBR049C的PCR产物，
(8)基因座SuYGC170W的PCR产物，
(9)通过在同一孔中加载基因座SuYIL130W、SuYHR102W，SuYKR045C和SuHTZ1PLB3的单个PCR反应获得的扩增产物而获得的谱，
(10)通过在同一孔中加载基因座SuARS409、SuYHR042-043、SuYBR049C和SuYGC170W的个体PCR反应获得的扩增产物而获得的谱；
图4报告了3％琼脂糖凝胶上2次多重PCR反应的电泳结果，加载顺序如下：
(M)O’Gene Ruler标记物(Fermentas公司)，
(1)基因座SuYIL130W、SuYHR102W和SuYGC170W的多重PCR1产物；
(2)基因座SuYKR045C、SuHTZ1PLB3、SuARS409、SuYHR042-043和SuYBR049C的多重PCR2产物。
实施例1-根据本发明的菌株的分离和选择步骤
1.1采样
在具有高葡萄酒生产活动的威尼托地区，通过在春天收集鲜花进行采样。
通过避免在所有阶段徒手触摸花朵并定期对剪刀进行消毒来进行收集，目的是尽可能地限制污染。
已经收获足够量的花以填充适当密封的无菌袋。到达实验室后，将花转移到含有200ml预先在蒸馏水中制备的合成葡萄汁的无菌烧瓶中，用KOH调节至pH3.2，并通过过滤灭菌，其组成报告在表1中。
表1
此外，合成葡萄汁补充有抗生素土霉素，浓度为0.1毫克/毫升，以避免细菌繁殖。然后用无菌石蜡油覆盖制剂以避免霉菌的形成。使用具有孔硅胶塞密封烧瓶，其中插入了在上端弯曲的巴斯德吸管。其目的是避免环境中存在的微生物的潜在污染，并允许CO2排出而不损失水蒸气。将烧瓶置于培养箱中，温度保持在22℃至25℃之间。
通过测量每个烧瓶的重量下降(指示糖发酵形成CO2，因而指示发酵进程)来监测发酵的进展。
1.2从样品中分离菌株
在发酵完成后，从每个烧瓶中取出10ml产物，进行第一次1:10连续稀释，从中除去1ml，并在Ringer溶液中进行5次后续连续稀释(1:10)；然后通过在WL琼脂培养基上(4.0g/l酵母提取物，5.0g/l胰蛋白胨，50g/l葡萄糖，550mg/l磷酸二氢钾，425mg/l氯化钾，125mg/l氯化钙，125mg/l硫酸镁，2.5mg/l氯化铁，2.5mg/l硫酸锰，22mg/l溴甲酚绿，20g/l琼脂)铺展100μl最终的三种稀释液，用高压灭菌器适当灭菌并调整最终pH为5.5±2。然后将平板在有氧条件下于28℃温育3天。在该培养基中，酵母菌属的酵母菌落具有不同的颜色，从奶油色到浅绿色，具有光滑不透明的表面和乳脂状稠度。酵母计数显示酵母菌浓度为约107CFU/ml，存在白色和绿色菌落，具有光滑不透明的表面和乳脂状稠度。
1.3分离物的纯化和储存
从分离平板上挑取的菌落重新接种到WL琼脂生长培养基上，其组成已在实施例1的1.2节描述。该过程重复至少两次，以确保每个分离物来自单个菌落。使用无菌环挑取在平板上最终传代后获得的纯培养物，然后加入甘油至40重量％后于-80℃下冷冻保存。在平板上，该菌株随后被鉴定为贝酵母亚种尤瓦鲁姆，显示为具有强烈绿色的小菌落，而归因于酿酒酵母菌种的菌株来自较大的菌落，具有乳脂状稠度，颜色为白色或倾向于浅绿色。
1.4菌种和菌株水平的分离物鉴定
根据Andrighetto等人2000年描述的方法，使用M13引物通过RAPD-PCR在菌种水平鉴定推定的酵母菌落。在分析和随后处理从花中分离的酵母的扩增谱中，还包括来自酿酒和非酿酒学意义的各种酵母菌种的类型和参考菌株。比较这些谱可以识别归因于酿酒酵母和贝酵母的酵母。
为了能够在菌株水平上进行区分，已经使用了两种技术：
1)线粒体DNA限制性酶切谱分析；
2)微卫星分析；
这将在1.6节的执行实例中详细描述。
不排除所述遗传技术的实施可以使用本领域技术人员已知的方法进行，因此，本文所述的技术指标可以与前述实施例中报道的不同。
1.5分离菌株的技术特征
为了评估发酵特征，根据表1中所述的组成，使用天然或合成葡萄汁对所选择的每种酵母进行发酵测试。
接种物是用合成或天然葡萄汁制备的(取决于发酵活力评估试验是在合成葡萄汁还是天然葡萄汁上进行)，从斜面或平板生长培养物中获取的线环开始，然后在25℃温育24小时。随后，将其接种到烧瓶中10％的合成或天然葡萄汁的区域，最终体积为200ml，所述烧瓶用中心具孔的硅胶塞密封，在其中插入巴斯德吸管，弯曲以便允许排出二氧化碳而不会损失水蒸气。
每天监测由于设置用于发酵测试的烧瓶中的CO2损失导致的重量下降直至发酵完成，对应于重量下降保持恒定数天的阶段。对于每种生长的分离物，通过视觉评估评估在发酵过程中产生泡沫的能力。再次，通过视觉评估，评估发酵过程中的菌株(粉状或絮凝剂)的生长方法。
最后，为了评估硫化氢的产生，将每种分离物接种在Biggy琼脂培养基上(铋葡萄糖甘氨酸酵母琼脂：5g/l柠檬酸铋铵，3g/l亚硫酸钠，10g/l葡萄糖，10g/1甘氨酸，1g/l酵母提取物，16g/l琼脂，pH 6.8±0.2)并在25℃温育5天，之后评估在平板上生长的菌落的颜色。亚硫酸铋的产生导致硫化氢的量与颜色强度成正比(如果大量存在，则为深棕色)。花的分离物的技术特征使得鉴定某些酵母菌株成为可能，包括贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS菌株，具有有前景的酿酒学特征。
1.6菌株水平的遗传表征
为了能够在菌株水平上实现表征，已经使用了两种技术：
-线粒体DNA限制性酶切谱分析；
-微卫星分析。
采用限制酶Hinf I，基于1998年Zilio等人报道的方法进行限制性酶切谱分析。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳实现线性DNA片段的分离。使用软件GelComparII(AppliedMaths，比利时)进行限制性酶切谱的比较，该软件通过构建基质，能够计算谱之间的相似性水平并以图形方式将结果表达为树状图。使用酶Hinf I获得的本发明菌株SERIUS的线粒体DNA限制性酶切谱如图2所示。
微卫星分析设想使用PCR技术，其引物与被称为微卫星的DNA区域互补，微卫星是重复序列不同的串联重复DNA(1至6个碱基)的小序列，也可能位于内部基因组编码区(Legras，2005)。由于DNA复制错误，它们的长度变化很大，因此在同一菌种中的个体之间显示出一定程度的多态性。微卫星多态性分析是一种高度可重复的方法，因为采用了特异性引物和高退火温度实现它们的扩增。为了表征菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS，考虑了2016年Masneuf-Pomarede等人描述的八个最易变基因座并且对每个基因座进行反应：SuYIL130W(16个等位基因形式)，SuYHR102W(8个等位基因形式)，SuYKR045C(10个等位基因形式)，SuHTZ1PLB3(7个等位基因形式)，SuARS409(5个等位基因形式)，SuYHR042-043(5个等位基因形式)，SuYBR049C(5个等位基因形式)，SuYGC170W(4个等位基因形式)。
使用在1x缓冲液中的1U DNA聚合酶以体积20μl进行反应，加入浓度为1.5mM的氯化镁(MgCl2)，浓度为200μM的三磷酸核苷酸(dNTP)，对于每个反应，每种引物均为1μM。
在Mastercycler Nexus梯度(Eppendorf)中进行扩增，除了退火温度(Ta)之外，所有扩增反应都具有独特的热程序。使用的热方案显示在下表2中(每个循环的重复次数显示在括号中)。
表2
对于基因座SuYIL130W、SuYHR102W和SuYGC170W的PCR反应，使用的Ta设定为55℃；对于基因座SuYKR045C、SuHTZ1PLB3、SuARS409、SuYHR042-043和SuYBR049C的PCR反应，将上述Ta设定在50℃。
与贝酵母变体尤瓦鲁姆中八个最易变基因座相关的PCR产物的扩增和琼脂糖凝胶电泳迁移使贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS的菌株能够确定图3中报道的独特和特征性图谱。
除了个体的PCR反应之外，还通过能够分别同时扩增三个和五个基因座的两个多重反应分析了上述八个基因座。
特别是，使用了两个多重PCR反应：多重PCR1允许分析基因座SuYIL130W，SuYHR102W和SuYGC170W的DNA-微卫星谱，多重PCR2允许获得基因座SuYKR045C，SuHTZ1PLB3，SuARS409，SuYHR042-043和SuYBR049C的DNA-微卫星谱。
两个多重PCR反应以20μl的体积进行，采用在1x缓冲液中的1.5U和1U DNA聚合酶，加入浓度为1.5mM的氯化镁(MgCl2)和浓度为200μM的三磷酸核苷酸(dNTP)。引物浓度已如下优化。
在多重-PCR1的情况下，基因座SuYIL130W的两种引物的添加浓度为0.25μM，基因座SuYHR102W的两种引物的添加浓度为0.75μM，而基因座SuYGC170W的两种引物的添加浓度为1μM。
在多重-PCR2的情况下，基因座SuYKR045C，SuHTZ1PLB3，SuARS409，SuYHR042-043和SuYBR049C的两种引物的应用浓度为0.5μM。
在Mastercycler Nexus梯度(Eppendorf)中进行扩增，除了退火温度(Ta)之外，所有扩增反应都具有独特的热程序。使用的热程序显示在下表3中(每个循环的重复次数显示在括号中)。
表3
在多重-PCR1的情况下，使用的Ta为55℃，而在多重-PCR2的情况下，其为50℃。
从上述分析获得的谱在图4中报告。
此外，还通过基于四个基因座的扩增的毛细管电泳进行本发明菌株的表征，根据文献中的数据，所述四个基因座的特征在于更多数量的等位基因形式。
有利地，所述表征使得可以定义所考虑的4个基因座的PCR产物的确切大小。
考虑的基因座如下：SuYIL130W，SuYHR102W，SuYKR045C和SuHTZ1PLB3。已根据先前报道的方案进行扩增，其中单一变体由用荧光分子修饰正向引物的5'末端组成。特别地，SuYIL130W-FW和SuYKR045C-FW已经用六氯荧光素(HEX)标记，而SuHTZ1PLB3-FW和SuYHR102W-FW已经用6-羧基荧光素(FAM)标记。
使用具有内部参比ROX的D过滤器进行毛细管分布的分析。使用Peak Scanner 2.0软件进行了解释，其中包含以下参数：“尺寸标准：GS500(-250)”和“分析方法：尺寸默认值-NPP”。获得的结果(即片段的大小)在表4中报告，并以碱基对(bp)表示，误差为+/-1bp。
表4
不排除所述遗传技术的实施可以使用本领域技术人员已知的方法进行，因此，上述技术指标可以与报道的不同。
实施例2-酵母的技术表征
2.1产生硫化氢
通过在Biggy琼脂培养基中(1g/l酵母提取物，10g/l甘氨酸，10g/l葡萄糖，5g/l柠檬酸铋铵，3g/l亚硫酸钠，16g/l琼脂)于25℃温育5天，评估SERIUS菌株产生硫化氢。温育完成后，在该培养基中，根据它们产生的硫化氢的量，菌落呈现出不同的颜色。深褐色的菌落表明高硫化氢产量，颜色为褐色-米色的菌落表明产量适中，而白色菌落的特征在于它们不能产生硫化氢。在Biggy琼脂培养基上温育后，本发明菌株的菌落呈现白色，因此，在测试条件下，菌株不能产生H2S。在25℃温育的醋酸铅琼脂培养基(15g/l蛋白胨，5g/l蛋白胨，1g/l葡萄糖，0.2g/l醋酸铅，0.08g/l硫代硫酸钠，15g/l琼脂)中通过分析硫化氢产量重复进行测试，得到的结果类似于用Biggy琼脂培养基获得的结果。
2.2发酵活力
在合成葡萄汁(其特征已经在实施例1，1.1节中描述)以及各种类型的天然白浆果葡萄和红浆果葡萄的葡萄汁中评价本发明菌株的发酵活力。接种物是用合成或天然葡萄汁制备的(取决于发酵活力评估试验是在合成葡萄汁还是天然葡萄汁上进行)，从斜面或平板生长培养物中获取的线环开始，然后在25℃温育24小时。随后，将其接种到烧瓶中10％的合成或天然葡萄汁的区域，最终体积为200ml，所述烧瓶用中心具孔的硅胶塞密封，在其中插入巴斯德吸管，弯曲以便允许排出二氧化碳而不会损失水蒸气。这样，通过监测由于CO2的产生导致的重量下降(糖的发酵指标)，可以跟踪发酵的进程。温育在25℃的恒定温度下进行，并且每1-2天进行一次重量损失评估，直至达到恒重。使用收集的数据制备生长曲线，并且将菌株贝酵母变体尤瓦鲁姆的发酵活力SERIUS与贝酵母和酿酒酵母的市售菌株的发酵活力进行了比较。在各种发酵试验中，本发明的菌株显示出良好的发酵能力，在第2天和第7天的平均重量损失值类似于用酿酒酵母的市售酵母观察到的那些，并且发酵完成时间取决于使用的葡萄汁类型(从10到15天)。
通过在12、15和24℃的温度下温育，还在从特雷比奥罗(Trebbiano)葡萄获得的天然葡萄汁中评估该菌株的发酵活力。分析表明该菌株即使在12℃和15℃的温度下也具有良好的发酵能力。
有利地，本发明菌株的这一特征允许其在低温下的葡萄酒发酵中使用，因此增加了激活特定生物化学反应的可能性，导致产生对所产生的葡萄酒的感官品质具有积极影响的芳族化合物。
2.3产生甘油
在天然白浆果葡萄和红色浆果葡萄的葡萄汁中接种菌株SERIUS，25℃温育直至发酵完成，通过HPLC(Jasco RI 930检测器，RezexTM ROA-有机酸H+8％色谱柱(300X 7.8mm)评估甘油的产生。
此外，建立其中接种酿酒酵母的市售菌株的比较试验。所得结果列于表5，其中产生的甘油量以g/l表示。可以观察到，本发明的菌株显示出显著的甘油产生，平均高于用作比较的市售酵母产生的甘油量。
表5
2.4产生苹果酸
测试本发明的菌株在25℃温育直至发酵完成后天然白浆果和红浆果葡萄汁中产生苹果酸的能力。特别地，使用上述菌株在发酵之前和之后存在于各种葡萄汁中的苹果酸的量已经通过HPLC Jasco UV 975检测器，ResexTM ROA-有机酸H+8％柱(300×7,8mm)评估。类似于实施例2.3，用先前使用的酿酒酵母市售菌株的接种物进行了比较试验。所得结果列于表6，其中苹果酸的量以g/l表示。可以观察到在所测试的6种葡萄汁的5种中菌株SERIUS能够产生苹果酸，即使效率不同，这与市售菌株不同，市售菌株的特征在于部分降解苹果酸的能力。
表6
2.5产生挥发性酸
在天然白浆果葡萄和红色浆果葡萄的葡萄汁中接种菌株SERIUS，25℃温育直至发酵完成，通过HPLC Jasco RI 930检测器，RezexTM ROA-有机酸H+8％(300×7,8mm)色谱柱评估产生乙酸的能力。还建立了用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)市售菌株接种的比较试验。所得结果报告于表7中，其中报告了以g/l表示的乙酸产量值，表明本发明的菌株的特征在于产生很少的挥发性酸度的能力。
表7
2.6杀伤活性
使用YEPD琼脂培养基研究酵母SERIUS中杀伤活性的存在，所述YEPD琼脂培养基通过预先接种和过夜孵育敏感指示菌株的培养物而制备。在操作上，在将包括指示菌株的所述平板干燥后，将10μl新菌株SERIUS培养物沉积在平板上，并将相同的平板在25℃下温育48小时。随后，在温育期结束时，通过在受试菌株的菌落周围出现“抑制晕圈”(抑制晕圈被理解为没有生长的区域)来检测杀伤活性。
相对于SERIUS菌株，已经分别测试了属于酿酒酵母和贝酵母菌种的10种酿酒酵母菌株的杀伤活性。
分析表明，所测试的酵母均未被本发明的菌株抑制。此外，所测试的10种酵母中没有一种能够抑制菌株SERIUS。
2.7铜耐受性和二氧化硫耐受性
通过在合成YNB(酵母氮碱)培养基中生长来测定铜耐受性，其特征在于不存在氨基酸并且存在6.7g/l硫酸盐，20g/l葡萄糖和20g/l琼脂，补充有各种浓度为CuSO4(分别为50,100,200,300μmol/l)。关于二氧化硫耐受性，通过在补充有偏亚硫酸氢钾的琼脂化葡萄汁中生长进行评估，其中偏亚硫酸氢钾的浓度使得最终的SO2浓度基本上对应于50,100,200和300ppm。上述两种分析都是通过将菌株SERIUS在预先制备的培养基中于26℃温育48小时来进行的，并且已经在平板上评估了可见的生长。
所得结果列于表8中，表示为MTC(最大耐受浓度，分别为铜或二氧化硫)。从下表中可以看出，菌株SERIUS表现出在300ppm SO2和300μmol/l铜存在下生长的能力。
作为比较，还对5种市售可得的酿酒酵母菌株进行了上述试验，用于酿酒用途。
表8
菌株 MTC SO<sub>2</sub>(ppm) MTC CuSO<sub>4</sub>(mol/l)
SERIUS 300 300
市售酿酒酵母1 300 50
市售酿酒酵母2 300 50
市售酿酒酵母3 50 50
市售酿酒酵母4 300 100
市售酿酒酵母5 300 100
2.8乙醇耐受性
使用包括不同浓度的乙醇(分别对应于12％，14％，16％和18％)的琼脂化葡萄汁测定乙醇耐受性。将菌株SERIUS在所述培养基中于26℃温育48小时，完成后，在平板上评估可见生长。
分析表明菌株SERIUS的乙醇MTC值等于16体积％。
2.9碳源使用
通过在含有酵母提取物(10g/l)，蛋白胨(20g/l)和浓度为20g/l的糖/有机酸的培养基中生长上述菌株来评估菌株SERIUS同化/发酵各种碳源化合物的能力。
分析表明SERIUS菌株能够利用半乳糖，棉子糖，麦芽糖和葡萄糖酸等有机化合物。
2.10产生挥发性化合物和芳香分布
在接种和使用菌株SERIUS发酵的特雷比奥罗葡萄汁的样品中以及在接种和使用市售酿酒酵母发酵的相同葡萄汁的样品中，发酵完成时评估乙醛、乙酸甲酯、乙酸乙酯和高级醇的产生。将适当蒸馏的葡萄酒样品直接注入ZB-WAX Plus极性柱(聚乙二醇的固定相，FID-火焰离子化检测器)，通过气相色谱法测定挥发性化合物。
获得的结果以mg/l表示，列于表9中。
表9
代谢物(mg/l) SERIUS 市售1
乙醛 52 42
乙酸甲酯 <2 <2
乙酸乙酯 41 25
甲醇 0.05 0.04
2-丁醇 <2 <2
正丙醇 55 23
异丁醇 43 40
乙酸异戊酯 <2 <2
正丁醇 <2 <2
异戊基类 69 120
SERIUS菌株产生的乙醛量略高于用于比较的市售酵母产生的乙醛量，但这些浓度不会影响葡萄酒的质量。事实上，众所周知，葡萄酒中低浓度的所述化合物会产生令人愉悦的水果香气，而在浓度增加时，葡萄酒具有释放刺激性和刺激性气味的倾向，因此当乙醛浓度超过500mg/l时会变得无法销售。
关于高级醇，与市售参考菌株相比，菌株SERIUS产生更大量的正丙醇，同时它产生相似量的异丁醇；然而，这些醇在葡萄酒中不起明显的嗅觉作用。
另一方面，与市售酿酒酵母菌株相比，菌株SERIUS产生较低量的异戊醇；后者的高级醇起着重要的作用，因为它会产生所谓的“酒精样(amylic)”气味，从嗅觉的角度来看，这被认为是非常不利的。
与上述菌株在25℃温育持续一段足以实现发酵完全的时间之后获得的特雷比奥罗葡萄的葡萄汁，通过固相萃取(SPE)技术评估SERIUS菌株的芳香分布。此外，类似地，通过比较测定了两种市售酿酒酵母菌株。
在操作上，10ml取样的每种菌株(SERIUS和两种市售菌株)用30ml水稀释并掺入内标(1-庚醇)且吸附到SPE C18柱上。使用二氯甲烷进行洗脱，并将减少至小体积的洗脱液注入Shimadzu GC2010/QP2010GC/MS系统。通过搜索在制备本申请时可获得的最新版本的Whiley和NBS文库，已经进行了所得化合物的鉴定。
从目前的分析，证明本发明的菌株使得葡萄酒中脂肪酸(异戊酸，己酸，辛酸，丁酸，癸酸)的浓度比用两种市售菌株获得的葡萄酒中检测到的那些少平均2-3倍。已知某些中链和长链脂肪酸(C6，C8，C10，C12)对酵母的发酵活性具有抑制作用。特别是，即使在低浓度(几毫克/升)下，癸酸(C10)在发酵过程中也显示出显著的拮抗活性。
将菌株SERIUS与通过比较使用的两种市售菌株区分开的另一个特征是辛酸苯乙酯(产生绿色可可典型香气的挥发性化合物)的产量显著更高(平均大30倍)。最后，用酵母SERIUS获得的葡萄酒显示出浓度降低的吡嗪和哌嗪，这些分子负责草本和植物的香气。
实施例3-酵母的酿酒学表征，酿造试验
通过对红浆果葡萄和白浆果葡萄的葡萄汁的酒厂酿酒试验测试本发明的菌株。
使用的生产方法是进料分批类型，然后通过离心浓缩培养物。然后，以乳膏形式制备酵母生物质，干物质含量基本上等于22％，酵母浓度约为100亿CFU/g。
为了随后的葡萄汁接种，将生物质重新悬浮在由酵母、葡萄汁和活化剂组成的葡萄酒悬浮液中。
特别是，对于在5000升罐中使用，1公斤酵母SERIUS的乳膏状生物质在25℃的温度下悬浮在200升的葡萄汁中，补充有制造商推荐并且在商业上已知的工作浓度的活化剂。使用搅拌器或倒灌泵将悬浮液保持运动2/4小时。随后，通过倒灌将所述悬浮液添加到葡萄汁中。
3.1使用具有葡萄汁酸化的琼瑶浆葡萄葡萄汁的测试
将本发明的酵母在酿酒厂中用琼瑶浆(白浆果)葡萄的葡萄汁的50hl的罐进行测试。
以新鲜乳膏形式制备的酵母以20g/hl的剂量使用。
向葡萄汁中添加100g/hl的酵母自溶物和140g/hl的酒石酸后，用先前根据一般部分中描述的方法制备的菌株SERIUS接种。发酵在13℃下进行19天。
表10报告了关于酵母接种前葡萄汁和发酵完成时葡萄酒的分析数据。可以观察到菌株如何有利地产生大量的苹果酸和甘油，同时显示低挥发性酸度产生。
关于芳香分布，在发酵完成时，与市售酵母相比，注意到更大的花复杂性(floralcomplexity)，与萜烯分布协同。
表10
葡萄汁 葡萄酒
总酸度g/l 4.80 6.57
pH值 3.47 3.46
苹果酸g/l 1.09 1.92
柠檬酸g/l 0.12 0.2
乳酸g/l 0.10 0.22
葡萄糖g/l 88.1 0.4
果糖g/l 106.9 6.5
琥珀酸g/l 0.07 0.99
甘油g/l 3.47 11.45
乙酸g/l 0.21 0.09
乙醇％ 2.82 14.11
3.2使用没有葡萄汁酸化的琼瑶浆葡萄葡萄汁的测试
将酵母SERIUS在酿酒厂中用琼瑶浆(白浆果)葡萄的葡萄汁的100hl的罐进行测试。酵母以新鲜形式(乳膏)制备，并以20g/hl的剂量使用。如前所述进行接种物的制备。在接种之前，将90g/hl的酵母自溶物加入到葡萄汁中。葡萄汁没有用酒石酸酸化。发酵在17℃下进行7天。
表11报告了关于酵母接种前葡萄汁和发酵完成时葡萄酒的分析数据。
获得的结果显示了SERIUS菌株产生大量甘油和低挥发性酸度的能力。关于琼瑶浆葡萄汁的先前实施例，其中已观察到苹果酸产生，在本实施例的情况下，未观察到苹果酸产生。应该注意的是，实施例3.1中的葡萄汁用酒石酸酸化，而在本实施例中葡萄汁没有补充酒石酸。因此，SERIUS菌株产生的苹果酸似乎与葡萄汁的酒石酸酸化有关。
嗅觉分析证实了在3.1节描述的实施例中显示的结果。
表11
葡萄汁 葡萄酒
总酸度g/l 6.70 6.29
pH值 3.26 3.30
苹果酸g/l 1.24 1.10
柠檬酸g/l 0.16 0.27
乳酸g/l 0.23
葡萄糖g/l 81.5 0.3
果糖g/l 100.3 5.7
琥珀酸g/l 0.55
甘油g/l 3.54 10.15
乙酸g/l 0.08 0.15
乙醇％ 2.72 13.10
3.3使用具有葡萄汁酸化的卡尔卡耐卡葡萄葡萄汁的测试
将菌株SERIUS在酿酒厂中用卡尔卡耐卡(白浆果)葡萄的葡萄汁的150hl的罐进行测试。酵母以新鲜形式(乳膏)制备，并以20g/hl的剂量使用。如前所述进行接种物的制备。在接种之前，将120g/hl的酵母自溶物和120g/hl的酒石酸加入到葡萄汁中。发酵在16℃下进行15天。
获得的结果示于表12中。显示了SERIUS菌株产生苹果酸、大量甘油和低挥发性酸度的能力。
关于芳香分布，报道了具有一丝甘氨酸的明显花香。
表12
葡萄汁 葡萄酒
总酸度g/l 4.72 8.85
pH值 3.53 3.27
苹果酸g/l 0.97 2.70
柠檬酸g/l 0.16 0.23
乳酸g/l 0.01 0.24
葡萄糖g/l 80.6 0.3
果糖g/l 90.4 9.2
琥珀酸g/l 0.02 1.36
甘油g/l 1.55 10.34
乙酸g/l 0.02 0.16
乙醇％ 1.21 11.23
3.4使用没有葡萄汁酸化的卡尔卡耐卡葡萄葡萄汁的测试
将菌株SERIUS在酿酒厂中用卡尔卡耐卡(白浆果)葡萄的葡萄汁的100hl的罐进行测试。酵母以新鲜形式(乳膏)制备，并以20g/hl的剂量使用。如前所述进行接种物的制备。在接种之前，将120g/hl的酵母自溶物加入到葡萄汁中。葡萄汁没有用酒石酸酸化。发酵在16℃下进行12天。
表13报告了在接种之前葡萄汁以及在发酵完成时葡萄酒获得的结果。
可以观察到菌株如何能够产生具有低挥发性酸度产生的大量甘油。同样，在这种情况下，在不存在用酒石酸酸化的情况下，没有报道苹果酸产生。
芳香分布证实在实施例3.3中观察到的结果，即存在带有一丝甘氨酸的明显花香。
表13
3.5在具有葡萄汁酸化的西拉(Syrah)、小维多(Petit Verdot)，赤霞珠 (Cabernet)葡萄葡萄汁中进行测试
将菌株SERIUS在酿酒厂中用西拉(Syrah)、小维多(Petit Verdot)，赤霞珠(Cabernet)(红浆果)葡萄葡萄汁的100hl的罐进行测试。酵母以新鲜形式(乳膏)制备，并以20g/hl的剂量使用。如前所述进行接种物的制备。在接种之前，将150g/hl的酵母自溶物和100g/hl的酒石酸加入到葡萄汁中。发酵在20℃下进行10天。
表14报告了在接种之前葡萄汁以及在发酵完成时葡萄酒获得的结果。同样，在这种情况下，观察到菌株SERIUS产生苹果酸和大量甘油的能力。
关于芳香分布，使用SERIUS菌株生产的葡萄酒具有独特的蓝莓、覆盆子和野草莓味。
表14
实施例4-从贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS获得的杂交体
使用贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS作为亲本菌株，以获得具有额外和改进的酿酒特征的酵母杂交体。选择直接杂交技术，并且遵循标准的孢子-孢子偶联方案，只是稍作修改以获得杂交体(Solieri等人，2008)。最初，对选择用于杂交的菌株进行孢子形成研究。已经为此目的测试了几种培养基。孢子活力和孢子形成效率研究允许选择SP培养基(1％乙酸钾；0.1％酵母提取物；0.05％葡萄糖；1.8％琼脂)。在25℃下将菌株在SP上生长7-10天，然后部分消化细胞壁，以便随后使用显微操纵器针从ascii中分离孢子。将具有半消化细胞壁的ascii置于YPD平板的一侧(2％葡萄糖；2％蛋白胨；1％酵母提取物；2％琼脂)，然后进行显微操作。两种亲本菌株的孢子随机放置。连续观察可以确定成功的结合。在25℃温育2-3天后，选择的菌落在YPD培养基上重新划线。以下步骤是菌株的稳定化(也在WL培养基上进行)。然后通过分子分析确认杂交种，然后葡萄汁进行发酵试验以及表型分析，以验证它们的生理特征和酿酒潜力。
实施例5-从菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS开始生产酵母自溶物
菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS可用于生产酵母自溶物，用作葡萄酒和其他酒精饮料生产中的发酵活化剂。为此，将如上所述制备的酵母膏进行适当的热处理(40-60℃，12-48小时)。获得的自溶物可以原样使用或通过适当的过滤/离心/滗析进一步处理，目的是分离固相或液相用于随后的合适应用。
因此，基于以上所述，本发明实现了所有预设目标。
特别地，提供了具有贝酵母亚种尤瓦鲁姆的酵母菌株的目标，其具有允许葡萄汁良好发酵的技术和酿酒特征，从而实现令人愉悦的葡萄酒的生产。
实现的另一个目标是提供一种菌株，该菌株能够获得以大量苹果酸和甘油为特征的葡萄酒，同时在酒精发酵过程中不产生硫化氢。
本发明实现的另一个目标涉及使用菌株SERIUS作为亲本菌株以获得具有新的酿酒潜力的杂交酵母的可能性。
实现的另一个目标涉及使用形成本发明主题的菌株获得酵母自溶物以用作发酵活化剂的可能性。
本发明的目的还是优化选择用于酿酒用途的酵母菌株的完善和快速方法，特别是从花中分离的贝酵母(Saccharomyces bayanus)。
参考文献
1.Andrighetto C.,Psomas E.,Tzanetakis N.,Suzzi G.,Lombardi A.(2000):Randomly Amplified Polymorphic DNA(RAPD)PCR for the identification of yeastsisolated from dairy products(随机扩增多态性DNA(RAPD)PCR用于鉴定从乳制品中分离的酵母).Letters in Applied Microbiology,30:5-9；
2.Cai J.,Roberts I.N.和Collins M.D.(1996):Phylogenetic relationshipsamong members of the ascomycetous yeast genera Brettanomyces,Debaryomices,Dekkera,and Kluyveromyces deduced by small-subunit rRNA gene sequences(通过小亚基rRNA基因序列推断的子囊菌科酵母菌属酒香酵母，德克酵母和克鲁维斯酵母成员之间的系统发育关系).Int.J.Syst.Bacteriol.46:542-549；
3.Castellari L.,Ferruzzi M.,Magrini A.,Giudici P.,Passarelli P.,Zambonelli C.(1994):Unbalanced wine fermentation by cryotolerant vs.non-cryotolerant Saccharomyces strains Vitis(通过低温耐受性和非低温耐受性酿酒酵母菌株Vitis进行不平衡葡萄酒发酵),33,49-52；
4.Delfini C.(1995):Scienza e tecnica di microbiologiaenologica.Edizioni Il Lievito,Asti；
5.Esteve-Zarzoso B等，(1999):Identification of yeasts by RFLP analysisof the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers(通过RFSP分析5.8S rRNA基因和两个核糖体内转录间隔区鉴定酵母).Int J Syst Bacteriol49Pt 1:329-37；
6.Fleet G.H(2008):Wine yeasts for the future(未来的葡萄酒酵母).FEMSYeast Res 8；979–995；
7.James S.A.,Collins M.D.和Roberts I.N.(1996):Use of an rRNA internaltranscribed spacer region to distinguish phylogenetically closely relatedspecies of the genera Zygosaccharomyces and Torulaspora(使用rRNA内部转录间隔区来区分接合酵母属和德布尔有孢酵母属的系统发育上密切相关的菌种).Int.J.Syst.Bacteriol.46:189-194；
8.Legras J.L.,Ruh O.,Merdinoglu D.,Karst F.(2005):“Selection ofhypervariable micro satellite loci for the characterization of Saccharomycescerevisiae strains”(用于表征酿酒酵母菌株的高变微卫星位点的选择),InternationalJournal of Food Microbiology 102:73-83；
9.Masneuf-Pomarede I.,Salin F.,M.,Coton E.,Coton M.,Jeune C.L.,Legras J.L.(2016):Microsatellite analysis of Saccharomyces uvarum diversity(杜氏酵母菌多样性的微卫星分析).FEMS Yeast Res.16(2):fow002；
10.Suzzi G,Tofalo R.(2014):Microbiologia Enologica Edagricole；
11.Pretorius IS(2000):Tailoring wine yeast for the new millennium:novel approaches to the ancient art of winemaking(为新千年量身定制葡萄酒酵母：古老酿酒艺术的新方法)Yeast 16:675±729；
12.Ribéreau-Gayon P.,Dubordieu D.,Doneche B.,Lonvaud A.(2000):Handbook of Enology Volume 1The Microbiology of Wine and Vinification(酿酒手册第1卷葡萄酒和酿酒的微生物学),John Wiley&Sons Ltd；
13.Solieri L,Antúnez O,Pérez-Ortín JE,Barrio E,Giudici P.(2008):Mitochondrial inheritance and fermentative oxidative balance in hybridsbetween Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum Yeast(酿酒酵母和葡萄汁酵母中杂种的线粒体遗传和发酵氧化平衡).25(7):485-500；
14.Vaughan-Martini A.&Martini A.(2011):第61章–Saccharomyces Meyen exReess(1870).The Yeasts(第50版).伦敦:Elsevier；
15.Vincenzini M.,Romano P.e Farris G.A.(2005):Microbiologia delvino.Edizioni Ambrosiana；
16.White T.J.,Bruns T.,Lee S.和Taylor J.(1990):PCR protocols.A guideto methods and applications.In Amplification and direct sequencing of fungalribosomal RNA genes for phylogenetics(PCR方案。方法和应用指南。用于系统发育的真菌核糖体RNA基因的扩增和直接测序),第315-322页.Innis M.A.,Gelfand D.H.,SninskyJ.J.,White T.J.(Eds)Academic Press,San Diego；
17.Zambonelli C,Soli MG&Guerra D(1984):A study of H2S nonproducingstrains of wine yeasts(葡萄酒酵母不产生H2S菌株的研究).Ann Microbiol 34:7–15；
18.Zambonelli C.,Tini V.和Castellari L.(2000).Guida all’uso deilieviti selezionati in enologia(a cura del Centro Ricerche ProduzioniVegetali)(在酿酒学中使用选定酵母的指南(由植物生产研究中心提供)，agricole编撰；
19.Zambonelli C.(2003):Microbiologia e Biotecnologia deiVini.Edizioni Agricole；
20.Zilio F.,Lombardi A.,Galeotto A.,Comi G.(1998):Profili direstrizione del DNA mitocondriale di ceppi di Saccharomyces isolati nellazona di produzione del vino Soave DOC(在Soave DOC葡萄酒的生产区域中分离的酿酒酵母菌株的线粒体DNA的限制性特征).Riv.Vitic.Enolog.3:33-41.

Claims (11)

1.一种鉴定为SERIUS并且以保藏号36P保藏在DBVPG的贝酵母亚种尤瓦鲁姆(Saccharomyces bayanus subsp.Uvarum)菌株。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，它是乳膏形式、干燥形式、冻干形式或糊剂形式。
3.如前述权利要求中任一项所述的鉴定为SERIUS(DBVPG36P)的贝酵母亚种尤瓦鲁姆菌株作为食物接种物在通过酒精发酵获得的食品生产中的应用。
4.如权利要求3所述的菌株的应用，其特征在于，所述食物是葡萄酒，所述酒精发酵的酿酒过程。
5.如权利要求4所述的菌株的应用，其特征在于，所述葡萄酒是由选自白浆果葡萄或红浆果葡萄的葡萄酿造的葡萄酒。
6.如权利要求4或5中任一项所述的菌株的应用，其特征在于，所述葡萄酒含有以下浓度的由该菌株天然产生的甘油和苹果酸：甘油高于约8.5g/l，优选高于约9.5g/l，更优选高于约10g/l；苹果酸高于约0.5g/l，优选高于约1g/l，更优选高于约2g/l。
7.如权利要求1或2中任一项的所述的鉴定为SERIUS(DBVPG36P)的贝酵母亚种尤瓦鲁姆菌株作为膳食补充剂和食品中的益生菌的应用。
8.一种食物接种物，其包含鉴定为SERIUS并且以保藏号36P保藏在DBVPG的贝酵母亚种尤瓦鲁姆菌株。
9.如权利要求8所述的食物接种物，其特征在于，所述食物接种物是葡萄酒发酵剂。
10.如权利要求1所述的菌株的繁殖和/或倍增获得的贝酵母亚种尤瓦鲁姆SERIUS酵母培养物，其特征在于它适合用于根据权利要求3至7中任一项的用途，所述培养物选自液体新鲜形式、乳膏或糊状形式的培养物，或干燥或冻干形式的培养物。
11.从鉴定为SERIUS(DBVPG36P)的贝酵母亚种尤瓦鲁姆菌株的裂解获得的自溶物。
CN201880004158.2A 2017-05-11 2018-05-11 酵母菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆dbvpg36p，其在食品发酵生产中的应用和选择该菌株的方法 Active CN109906269B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102017000051113A IT201700051113A1 (it) 2017-05-11 2017-05-11 CEPPO DI LIEVITO Saccharomyces bayanus subsp. uvarum DBVPG36P, IL SUO USO PER LA PRODUZIONE FERMENTATIVA DI ALIMENTI E UN METODO PER LA SELEZIONE DEL CEPPO
IT102017000051113 2017-05-11
PCT/IB2018/053290 WO2018207141A1 (en) 2017-05-11 2018-05-11 A strain of yeast saccharomyces bayanus subsp. uvarum dbvpg36p, its use in the fermentative production of foods and a method for the selection of the strain.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109906269A true CN109906269A (zh) 2019-06-18
CN109906269B CN109906269B (zh) 2023-03-28

Family

ID=60294019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880004158.2A Active CN109906269B (zh) 2017-05-11 2018-05-11 酵母菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆dbvpg36p，其在食品发酵生产中的应用和选择该菌株的方法

Country Status (23)

Country Link
US (1) US11525109B2 (zh)
EP (1) EP3622051B1 (zh)
CN (1) CN109906269B (zh)
AR (1) AR112352A1 (zh)
AU (1) AU2018265499B2 (zh)
BR (1) BR112019007786A2 (zh)
CA (1) CA3039479C (zh)
CL (1) CL2019001557A1 (zh)
CY (1) CY1125426T1 (zh)
DK (1) DK3622051T3 (zh)
ES (1) ES2902202T3 (zh)
HR (1) HRP20212007T1 (zh)
HU (1) HUE056585T2 (zh)
IL (1) IL267688B2 (zh)
IT (1) IT201700051113A1 (zh)
LT (1) LT3622051T (zh)
MD (1) MD3622051T2 (zh)
PL (1) PL3622051T3 (zh)
PT (1) PT3622051T (zh)
RS (1) RS62770B1 (zh)
SI (1) SI3622051T1 (zh)
WO (1) WO2018207141A1 (zh)
ZA (1) ZA201904271B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804523A (zh) * 2019-11-25 2020-02-18 四川大学 一种发酵生产高品质桑葚酒的方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109971662A (zh) * 2019-04-16 2019-07-05 北京中特养生物技术研究所有限公司 一种从猪肠道分离贝氏酵母菌的方法及其发酵方法
IT202100025343A1 (it) * 2021-10-04 2023-04-04 Francy Oenology S R L Prodotto enologico per la vinificazione migliorato

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1978083A2 (en) * 2007-02-16 2008-10-08 Parco Scientifico e tecnologico della sicilia Yeasts for champagnization
ES2356011A1 (es) * 2009-08-31 2011-04-04 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) Microorganismo fermentador productor de altas concentraciones de glicerol y sus aplicaciones en la producción de bebidas alcohólicas/vino.
CN109135990A (zh) * 2018-11-27 2019-01-04 中粮长城葡萄酒（蓬莱）有限公司 一种加强型葡萄酒生产工艺

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100040732A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-18 Vdf Futureceuticals, Inc. Compositions and Methods for Fermented Nutraceuticals
ES2334753B1 (es) * 2009-07-22 2011-01-21 Guserbiot, S.L.U Cepa de saccharomyces cerevisiae cect 13030 y su uso para la elaboracion de bebidas alcoholicas.
ES2525343T3 (es) * 2012-02-29 2014-12-22 Guserbiot S.L.U. Cepa de Saccharomyces cerevisiae y su uso para la producción de bebidas alcohólicas

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1978083A2 (en) * 2007-02-16 2008-10-08 Parco Scientifico e tecnologico della sicilia Yeasts for champagnization
ES2356011A1 (es) * 2009-08-31 2011-04-04 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) Microorganismo fermentador productor de altas concentraciones de glicerol y sus aplicaciones en la producción de bebidas alcohólicas/vino.
CN109135990A (zh) * 2018-11-27 2019-01-04 中粮长城葡萄酒（蓬莱）有限公司 一种加强型葡萄酒生产工艺

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDRA VERSPOHL，等: "Exploration of genetic and phenotypic diversity within Saccharomyces uvarum for driving strain improvement in winemaking", 《APPLIED MICROBIAL AND CELL PHYSIOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804523A (zh) * 2019-11-25 2020-02-18 四川大学 一种发酵生产高品质桑葚酒的方法
CN110804523B (zh) * 2019-11-25 2021-08-20 四川大学 一种发酵生产高品质桑葚酒的方法

Also Published As

Publication number Publication date
LT3622051T (lt) 2021-12-27
DK3622051T3 (da) 2022-01-10
IT201700051113A1 (it) 2018-11-11
IL267688B1 (en) 2023-07-01
AR112352A1 (es) 2019-10-23
RS62770B1 (sr) 2022-01-31
AU2018265499B2 (en) 2020-10-15
ES2902202T3 (es) 2022-03-25
IL267688B2 (en) 2023-11-01
CL2019001557A1 (es) 2019-08-16
PL3622051T3 (pl) 2022-02-14
CA3039479C (en) 2021-06-29
WO2018207141A1 (en) 2018-11-15
CY1125426T1 (el) 2024-02-16
AU2018265499A1 (en) 2019-04-18
ZA201904271B (en) 2020-08-26
CN109906269B (zh) 2023-03-28
US20200048592A1 (en) 2020-02-13
HUE056585T2 (hu) 2022-02-28
US11525109B2 (en) 2022-12-13
EP3622051A1 (en) 2020-03-18
PT3622051T (pt) 2021-12-02
CA3039479A1 (en) 2018-11-15
IL267688A (en) 2019-08-29
MD3622051T2 (ro) 2022-03-31
SI3622051T1 (sl) 2022-02-28
EP3622051B1 (en) 2021-10-06
BR112019007786A2 (pt) 2019-12-31
HRP20212007T1 (hr) 2022-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Improvement of flavor profiles in Chinese rice wine by creating fermenting yeast with superior ethanol tolerance and fermentation activity
Crauwels et al. Brettanomyces bruxellensis, essential contributor in spontaneous beer fermentations providing novel opportunities for the brewing industry
Patrignani et al. Characterisation of yeast microbiota, chemical and sensory properties of organic and biodynamic Sangiovese red wines
CN101792719A (zh) 一株酿酒酵母及其在酿造葡萄酒中的应用
CN105802865B (zh) 一株高发酵活性和产香特性突出的冰酒酵母及其应用
JP5138194B2 (ja) 新規酵母と当該酵母による酒類の製造方法
WO2012033229A1 (ja) 焼酎の製造方法
CN109906269A (zh) 酵母菌株贝酵母亚种尤瓦鲁姆dbvpg36p，其在食品发酵生产中的应用和选择该菌株的方法
CN107164251A (zh) 一株酿酒酵母及其用于提高葡萄酒酯类物质含量的用途
Valles et al. Screening of cider yeasts for sparkling cider production (Champenoise method)
CN116138429A (zh) 矮小哈萨克斯坦酵母xj-65及其在辣椒发酵中的应用
WO2011004254A1 (en) The yeast strain saccharomyces cerevisiae dbvpg24p, its use as an inoculant for the fermentative production of food, in particular prosecco wine, and a relative inoculant
KR101477696B1 (ko) 현미 발효용 락토바실러스 속 신균주 및 이를 이용한 발효 현미 제조방법
CN112126595B (zh) 一株低产酒精的产香酵母及其在低醇葡萄酒中的应用
Sampaolesi et al. Identification and assessment of non-conventional yeasts in mixed fermentations for brewing bioflavored beer
CN109749962A (zh) 一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌及应用
Mas et al. Microbiological control of alcoholic fermentation
JP6110610B2 (ja) 醸造酵母の育種方法、並びに該醸造酵母を用いたアルコール飲料及び清酒の製造方法
CN104877923B (zh) 用于改善蓝莓果汁品质的酵母菌及其应用
CN109666594A (zh) 一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法
CN112746028B (zh) 一株高产香气物质的路西塔尼亚红冬孢锁掷孢酵母菌株qtx26及其应用
CN106244474A (zh) 一株高产苯乙醇的酿酒酵母及其在干红葡萄酒酿造中的应用
JP5713334B2 (ja) 酵母の自然変異株分離法及び変異株酵母
CN118048248A (zh) 一种增酸野生酵母及其应用
JP5807896B2 (ja) 有機酸組成の優れた自然変異株清酒酵母分離法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40007585

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant