BR112019007786A2

BR112019007786A2 - cepa de saccharomyces bayanus subsp. uvarum, alimento inoculado, cultura de levedura e autolisado da mesma e seu uso como alimento inoculado e probiótico

Info

Publication number: BR112019007786A2
Application number: BR112019007786A
Authority: BR
Inventors: Polo Maurizio
Original assignee: Bioenologia 2 0 S R L
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2019-12-31
Also published as: LT3622051T; US20200048592A1; CL2019001557A1; CA3039479C; AU2018265499B2; WO2018207141A1; ES2902202T3; CN109906269B; US11525109B2; CA3039479A1; IL267688B1; EP3622051B1; IL267688B2; IL267688A; IT201700051113A1; CY1125426T1; AR112352A1; DK3622051T3; ZA201904271B; AU2018265499A1

Abstract

a invenção diz respeito a uma cepa de saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como serius e depositada no dbvpg com o número de depósito 36p. a invenção diz respeito adicionalmente ao uso da cepa de saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como serius (dbvpg 36p) como um alimento inoculado na produção de alimentos obtidos por fermentação alcoólica e um método de seleção para cepas de levedura do grupo saccharomyces adaptado à fermentação alcoólica, particularmente de uva, consistindo de uma etapa de isolamento para tais leveduras de flores.

Description

CEPA DE SACCHAROMYCES BAYANUS SUBSP.UVARUM, ALIMENTO INOCULADO, CULTURA DE LEVEDURA E AUTOLISADO DA MESMA E SEU USO COMO ALIMENTO INOCULADO E PROBIÓTICO

RELATÓRIO DESCRITIVO

Campo da técnica [0001] A presente invenção diz respeito a uma cepa de levedura pertencente à espécie Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, e um método de seleção para leveduras para uso enológico de flores. Além disso, a invenção refere-se ao uso da cepa de levedura na produção fermentativa de alimentos.

Estado da técnica [0002] O uso de iniciador de culturas de levedura na produção de vinho é uma prática fundamental que permite o controle e a direção do processo fermentative.

[0003] O termo levedura selecionada ou iniciador selecionado é usado para significar uma cepa de levedura caracterizada por propriedades fisiológicas, bioquímicas e enológicas que são otimizadas com relação às demandas tecnológicas dos processos de fermentação em termos de pureza (Pretorius, 2000).

[0004] O uso de leveduras selecionadas assegura a iniciação imediata da fermentação, uma vez que a qualidade e a quantidade de leveduras adicionadas ao mosto são cuidadosamente selecionadas; permite maior controle do processo fermentative pelo operador optando por conduzir a fermentação sem que o dito processo seja deixado para leveduras naturalmente presentes em uvas que nem sempre têm características positivas; reduz os problemas de detenção ou desaceleração do processo, típicos dos processos de fermentação espontânea; atinge bom rendimento da transformação do açúcar no álcool, reduzindo a possibilidade de que outros microrganismos se tornem estabelecidos no vinho, danificando-o assim (por exemplo, bactérias

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2/53 acéticas); reduz ou elimina as características organolépticas anômalas e, não por último, contribui para a padronização da produção de um determinado vinho, permitindo assim que seja reconhecível pelo consumidor ano após ano (Fleet e Heard, 1993).

[0005] Predominantemente, a seleção de leveduras ocorre por meio do isolamento de cepas de levedura de mostos ou uvas, que são submetidas à fermentação e testes de caracterização enológica. Os ditos testes são muito trabalhosos e exigem uma grande quantidade de tempo em que eles contemplam o estudo de numerosas características fisiológicas e metabólicas para a levedura. Além disso, os mostos e as uvas podem conter cópias múltiplas da mesma cepa, por meio do que há um risco de isolar as ditas cópias múltiplas e assim conduzir testes duplicados.

[0006] As características enológicas importantes podem ser subdivididas em dois grupos: aqueles com importância tecnológica, influenciando a progressão do processo de vinificação e aqueles que afetam a qualidade, influenciando as características químicas e sensoriais dos vinhos (Zambonelli, 2003). Entende-se pelo termo características tecnológicas que são as características associadas à atividade fermentativa das leveduras (potência alcoolgênica absoluta, força fermentativa, taxa de iniciação à fermentação), enquanto as características de qualidade incluem as características que contribuem para o aroma e, mais genericamente, para a qualidade organoléptica do vinho, como, por exemplo, a produção de glicerol, substâncias voláteis e compostos sulfurados (Pretorius, 2000; Fleet, 2008).

[0007] As principais características tecnológicas incluem a potência alcoolgênica ou de fermentação, que, segundo Delfini, é o nível máximo de álcool (entendido como etanol %) produzido por uma determinada levedura por meio da fermentação de um mosto contendo açúcar em excesso (Delfini, 1995). O principal álcool etílico produzido pela atividade de leveduras sob condições anóxicas é o composto que exerce

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3/53 uma ação inibitória em todos os microrganismos. Uma vez que, para uso enológico, as leveduras necessitam de características de desempenho significativas, por exemplo, para a produção de vinhos com alto teor alcoólico, também a resistência (tolerância ao álcool) ao álcool etílico tem, evidentemente, uma importância fundamental.

[0008] Uma característica tecnológica importante adicional é a força fermentativa (ou taxa de fermentação), expressando a taxa na qual a levedura inicia a fermentação, mesmo na presença de antissépticos em doses legalmente permitidas e em temperaturas entre 15 °C e 30 °C. A iniciação rápida do processo fermentative é uma das características que uma levedura enológica deve possuir independentemente do seu tipo de uso (fresco ou seco) e, portanto, deve ser considerada um requisito fundamental na seleção de leveduras para vinificação.

[0009] Uma característica adicional muito importante é a resistência ao dióxido de enxofre SO₂, ou seja, a habilidade de manter inalterada ou suficientemente alta a taxa de fermentação na presença de doses seletivas de SO₂ adicionada aos mostos a fim de evitar oxidação e alcançar uma estabilidade microbiológica adequada. Em que vinhos suplementados SO₂ são produzidos, portanto, é importante ter cepas disponíveis que são resistentes a este antisséptico, a fim de evitar problemas de iniciação que afetam o processo de fermentação.

[0010] Outro aspecto importante diz respeito aos métodos de crescimento, ou seja, o comportamento das células de leveduras na conclusão do processo de gemulação, uma vez que essa característica pode afetar a gestão do processo de fermentação. Crescimento de levedura pode ser distinguido entre crescimento pulverulento, floculento ou agregado. A taxa de sedimentação da cepa é, portanto, uma característica positiva adicional, uma vez que auxilia a clarificação do vinho e operações de filtração.

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4/53 [0011] As cepas que turvam o vinho da maneira mais irritante e persistente são as cepas geradoras de espuma. Capacidade de geração de espuma é uma característica dependente da cepa, associada com a hidrofobicidade da parede celular. Em muitas cepas (20-30%) as células aderem às bolhas de CO₂ produzidas durante a fermentação, e estas bolhas, mediante a chegada à superfície, em vez de se separarem, se fundem e aumentam em volume, dando origem a espumas que tomam uma cor castanho-acinzentado devido à presença das células. A ausência ou redução da produção de espuma é uma característica positiva, tanto em fermentações primárias quanto em refermentações, uma vez que reduz o volume ocupado pelo mosto.

[0012] No que diz respeito às características qualitativas, a serem posteriormente descritas em detalhe, as principais considerações incluem:

produção baixa ou zero de sulfeto de hidrogênio;

a produção ou degradação do ácido málico (como uma função do mosto e da safra enológica);

produção alta de glicerol;

produção baixa de ácido acético; potencial aromático alto.

[0013] Do ponto de vista qualitativo, os compostos sulfurados consistem principalmente de sulfureto de hidrogênio (ou H₂S) e dióxido de enxofre (SO₂); ditos compostos são sempre produzidos por cepas de S. cerevisiae comercialmente disponíveis como iniciadores de vinho, mesmo que em quantidades diferentes e variáveis, dependendo da cepa.

[0014] A vinificação usando leveduras de produção baixa de H₂S ou não produção é particularmente vantajosa para as variedades que são peculiarmente predispostas a redução. De fato, o sulfeto de hidrogênio é o principal composto de mercaptanos leves e tem a desvantagem de ter o cheiro de ovos podres. Vinhos exibindo defeitos

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5/53 olfativos rastreados para a presença de H₂S possuem concentrações do último variando entre 0,8 e 80 gg/l (Suzzi e Tofalo, 2014). O H₂S também pode reagir com outros compostos presentes no vinho, alterando o perfil aromático. Isto é, produzido principalmente durante a fermentação alcoólica, como resultado da ação de levedura.

[0015] Assim, o uso de uma levedura que não produza, ou produza pouco sulfeto de hidrogênio, não só permite fermentações mais limpas e vinhos mais fragrantes, mas também atrasa e/ou evita a trasfega na conclusão da fermentação, permitindo que o vinho permaneça mais tempo nas borras, com consequente enriquecimento de manoproteínas e outras substâncias resultantes da lise de leveduras. Sabe-se que a produção de H₂S em Saccharomyces cerevisiae varia de 0 gg/litro a 300 gg/litro e que a quantidade produzida é uma característica dependente da cepa. Além disso, os dados da literatura mostram que apenas cerca de 1% das cepas enológicas são incapazes de produzir H₂S (Zambonelli et al., 1984).

[0016] Além disso, a produção de SO₂ por leveduras mostra ampla variabilidade. Certas cepas que produzem quantidades significativas de SO₂ (100-120 mg/l) também têm uma tendência a produzir quantidades significativas de acetaldeído (para se defender contra o referido antisséptico) e o resultado, após a conclusão da fermentação, é uma alta concentração de ligação de SO₂, que pode comprometer a qualidade do vinho. Assim, durante as operações de seleção de cepas iniciadoras enológicas, deve-se dar preferência a cepas que produzem baixos níveis de SO₂ (máximo de 10-20 mg/l) (Vincenzini etal., 2005).

[0017] No que diz respeito à produção de ácido málico durante a fermentação alcoólica, isso representa uma vantagem na maioria dos processos de vinificação envolvendo uvas brancas de qualidade, em que a presença de altas quantidades de ácido málico dá uma sensação

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6/53 aumentada de frescor ao vinho resultante, em particular uma sensação ácida, considerada mais intensa, em comparação com o ácido tartárico.

[0018] Uma vantagem adicional é que a produção de ácido málico permite menor pH, resultando em aumento da atividade de dióxido de enxofre e, em geral, aumento da estabilidade microbiológica, além do aumento da acidez geral. A dita produção por leveduras de interesse enológico tem sido descrita no estado da técnica para certas leveduras criotolerantes, capazes de produzir até 1 g/l de ácido málico durante o processo de fermentação (Castellari etaL, 1994).

[0019] Outro produto secundário de fermentação por leveduras é o glicerol.

[0020] Depois de etanol e CO₂, glicerol é o composto produzido em maiores quantidades durante a fermentação alcoólica. Isso influencia significativamente o corpo do vinho, contribuindo para dar aos vinhos as características de plenitude e doçura, com um limiar de percepção correspondente a cerca de 5,2 g/l. A concentração de glicerol presente no vinho depende da concentração de açúcares presentes no mosto, das condições de fermentação e da cepa de levedura.

[0021] Em particular, em processos de vinificação, Saccharomyces pode produzir de 2 a 10 g/l, dependendo da espécie de levedura e cepa. Geralmente, S. cerevisiae é a levedura que produz as quantidades mais baixas de glicerol e esta é a principal razão para o seu elevado rendimento de etanol. Na realidade, este composto não é um produto de fermentação secundária, uma vez que é derivado diretamente dos açúcares, e, cepa por cepa, a quantidade produzida é proporcional à sua concentração (Zambonelli et al., 2000).

[0022] Entre os produtos secundários, mesmo que negativos, um papel muito importante é desempenhado pelo ácido acético, que, durante a fermentação, é derivado da degradação de açúcares devido à oxidação do acetaldeído (Ribéreau-Gayon, 2000). Além da espécie, a

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7/53 habilidade de produzir quantidades maiores ou reduzidas de ácido acético é uma característica que varia como uma função da cepa.

[0023] A dita habilidade de produzir ácido acético é, na verdade, definida pelo termo pureza fermentativa e é expressa como a razão entre a acidez volátil formada e o álcool etílico produzido. As melhores cepas são aquelas que têm o menor valor de pureza fermentativa e, geralmente, as leveduras usadas para fins enológicos não devem produzir quantidades de ácido acético superiores a 0,4 g/l.

[0024] No entanto, a acidez volátil dos vinhos pode ser o resultado de várias origens e não é apenas o resultado da atividade de levedura. Com efeito, a concentração final de ácido acético no vinho também depende da qualidade das uvas e das condições de vinificação. O acetaldeído é o composto de carbonila mais importante formado durante a fermentação e representa mais de 90% do teor total de aldeído de vinho. É um produto normal de fermentação alcoólica e seu teor em vinho pode variar significativamente (10-300 mg/l), dependendo da cepa de levedura e também das condições de vinificação e da concentração de dióxido de enxofre, ao qual o acetaldeído está ligado. A avaliação do teor de acetaldeído é usada como um indicador do grau de oxidação do vinho. Uma baixa concentração do dito composto no vinho dá ao último um agradável aroma frutado; no entanto, em concentrações crescentes, dá origem a um odor pungente e oxidado e um sabor de erva, a fim de tornar o vinho não mais vendável quando a concentração de acetaldeído excede 500 mg/l.

[0025] Para os vinhos brancos, o valor médio é geralmente 80 mg/l. Sabe-se que um dos principais fatores determinantes da variabilidade do teor de acetaldeído é a cepa de levedura. Também se sabe que o dióxido de enxofre pode induzir a produção de acetaldeído por leveduras devido à correlação entre a resistência das próprias leveduras ao dióxido de enxofre.

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8/53 [0026] Os álcoois superiores, geralmente representados em vinho por n-propanol, isobutanol, álcool amílico e álcool etílico 2-fenil, são produtos de fermentação de levedura secundários e são compostos que podem influenciar significativamente no aroma do vinho. Ditos compostos são predominantemente derivados do metabolismo dos aminoácidos presentes no mosto, mas também do metabolismo da glicose sem o envolvimento de aminoácidos precursores. De fato, não há correlação direta entre as quantidades de aminoácidos presentes no mosto e os álcoois superiores presentes no vinho. A produção dos ditos compostos é principalmente devida à ação das cepas de levedura que podem produzir de 100 a 500 mg/l, dependendo da composição do meio, da disponibilidade de oxigênio, da fonte de nitrogênio e da concentração inicial de açúcar. Geralmente, quando sua concentração total está abaixo de 300 mg/l, eles dão uma contribuição positiva para a complexidade do aroma, enquanto que, quando presentes em concentrações superiores a 400 mg/l, eles dão uma qualidade negativa ao produto (Suzzi e Tofalo, 2014). A exceção é o 2feniletanol, que libera uma fragrância perfumada como rosas e, mesmo em concentrações elevadas, contribui positivamente ao aroma do vinho (Vincenzini, 2005).

[0027] Durante a fermentação, leveduras podem produzir ésteres resultantes da condensação de ácido acético e ácidos graxos, predominantemente de cadeia média, com etanol ou outros álcoois presentes no vinho, e eles mesmos também produzidos pelo metabolismo da levedura. A atividade da esterase de levedura é muito importante no processo de vinificação, uma vez que tem um efeito poderoso sobre as características sensoriais do vinho, produzindo a maioria e os mais importantes dos aromas de fermentação. A influência dos ésteres na qualidade do vinho pode ser negativa e indesejável, particularmente no caso do acetato de etila, que confere o típico cheiro de vinagre (ou mesmo

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9/53 de solvente). Por outro lado, a produção de acetato de isoamila ou acetato de isobutila é positiva, pois é responsável por um caráter frutado.

Descrição da invenção [0028] O escopo da invenção é prover uma cepa de levedura a partir da espécie Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, equipada com as características tecnológicas e enológicas permitindo uma boa fermentação do mosto, permitindo a produção de um vinho agradável com maior e equilibrada complexidade aromática.

[0029] Um escopo adicional é prover uma cepa que produza ácido málico e glicerol em altas quantidades e, ao mesmo tempo, não produza sulfeto de hidrogênio durante a fermentação alcoólica.

[0030] Um outro escopo adicional da presente invenção é identificar uma cepa de levedura adequada para uso como uma cepa mãe para a obtenção de híbridos de levedura com potencial enológico.

[0031] A provisão de um autolisado de levedura a ser usada como um ativador de fermentação é também um escopo da presente invenção.

[0032] De modo algum o escopo final da invenção é a otimização de um método aperfeiçoado e rápido para a seleção de cepas de levedura para uso enológico, particularmente leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae e bayanus isolado das flores.

[0033] Os escopos mencionados acima são alcançados por meio da cepa de levedura como caracterizada na reivindicação 1, e precisamente por uma cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS e depositada no DBVPG com número de depósito 36P, e pelo método de seleção de cepas de levedura para uso enológico, as características das quais que são definidas posteriormente, e precisamente, por um método de seleção para cepas de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus e

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Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, adaptado para fermentação alcoólica, particularmente de uvas, isoladas de flores.

[0034] A cepa de levedura Saccharomyces bayanus subsp. uvarum de acordo com a invenção possui ótimas características enológicas, tanto tecnológicas quanto qualitativas, e tem sido isolada a partir de flores em uma área da região Vêneto com alta atividade de produção de vinho de uva. A cepa foi identificada pelo nome SERIUS e tem sido depositada em conformidade com o Tratado de Budapeste, em 24 de maio de 2016 com o Industrial Yeasts Collection DBVPG em Perugia, com número de depósito DBVPG 36P.

[0035] A cepa também foi selecionada por sua produção essencialmente inexistente de sulfeto de hidrogênio, uma característica muito rara em cepas de levedura do gênero Saccharomyces. De fato, em placas de meio de cultura de Agar BIGGY, preferencialmente usadas para verificar a habilidade de produzir H₂S, as colônias são brancas, demonstrando assim a incapacidade da cepa de produzir esse metabólito.

[0036] Outro aspecto positivo observado com esta levedura diz respeito à produção de glicerol. Com efeito, no mosto, a cepa produz glicerol em maiores concentrações em relação às cepas de S. cerevisiae disponíveis comercialmente usadas como controle.

[0037] Vantajosamente, a quantidade de glicerol produzida foi analisada em mostos de uva branca e mostos de uva escura e, com ambos os tipos de uva, a quantidade de glicerol produzida naturalmente foi maior em relação ao mosto correspondente obtido com a cepa de referência disponível comercialmente.

[0038] Vantajosamente, o vinho produzido usando a cepa de acordo com a invenção tem uma concentração de glicerol produzida naturalmente pela cepa superior a cerca de 8,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de 9,5 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 10 g/l.

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11/53 [0039] Pelo termo produzido pela cepa (neste documento e em contextos semelhantes) entende-se que o composto foi produzido como resultado da fermentação usando a cepa, e não foi adicionado artificialmente.

[0040] A cepa de acordo com a invenção também foi selecionada pela sua inesperada habilidade de produzir ácido málico.

[0041] Vantajosamente, a cepa da invenção tem a habilidade de produzir um vinho com uma quantidade de ácido málico superior a cerca de 0,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de 1 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 2 g/l. Esta molécula é particularmente vantajosa em processos de vinificação, particularmente para os processos de uva branca de qualidade, uma vez que dá ao vinho uma sensação aumentada de frescor.

[0042] Um aspecto adicional e vantajoso é dado pelo fato de que uma quantidade elevada de ácido málico torna possível ter vinho com pH mais baixo, uma característica que permite maior atividade de dióxido de enxofre.

[0043] Ainda vantajosamente, a cepa da invenção com sua produção de ácido málico inesperadamente alta torna possível obter maior estabilidade microbiológica para o vinho, com aumento da acidez total.

[0044] Devido às suas qualidades tecnológicas, a cepa SERIUS é, portanto, marcadamente superior às cepas comerciais atualmente disponíveis.

[0045] Vantajosamente, a cepa tem boa capacidade de fermentação, com valores de perda de peso médios análogos aos observados em leveduras comerciais da espécie Saccharomyces cerevisiae e com tempos de fechamento de fermentação que variam em função do tipo de mosto usado e da temperatura de fermentação, com durações, em temperatura de fermentação ideal, entre 10 a 15 dias.

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12/53 [0046] Ainda vantajosamente, a cepa da invenção tem boa capacidade fermentativa, mesmo a baixas temperaturas, particularmente em temperaturas entre 12°C e 15°C, assim, também permitindo seu uso para a fermentação dos vinhos em baixas temperaturas e, portanto, aumentando a possibilidade de ativar reações bioquímicas específicas conhecidas, levando à produção de compostos aromáticos adaptados para melhorar a qualidade do vinho.

[0047] Para a cepa da invenção, a habilidade de produzir ácido acético em mosto da fruta branca e escura natural também foi avaliada, e os resultados obtidos demonstram que a cepa SERIUS caracteriza-se pela habilidade de manter valores de acidez voláteis muito baixos; em particular, os valores obtidos são geralmente inferiores em comparação com os valores obtidos a partir de fermentações comparativas com as cepas de S. cerevisiae comercialmente disponíveis.

[0048] A cepa da presente invenção também foi selecionada com base em sua chamada atividade killer, ou seja, a habilidade de produzir toxinas que causam a morte de outras leveduras; de fato, no caso em que são usadas misturas de cepas, as cepas a serem usadas devem ser necessariamente compatíveis umas com as outras, ou seja, incapazes de produzir as toxinas killer que podem inibir as outras cepas presentes na mistura. A partir da análise realizada, mostrou-se, vantajosamente, que a cepa SERIUS não é capaz de inibir outras leveduras e, ainda mais vantajosamente, a cepa não foi, por sua vez, inibida por nenhuma das leveduras testadas.

[0049] A cepa foi classificada taxonomicamente a nível de espécie por meio de sequenciamento da região ITS (espaçador transcrito interno) do operão ribossomal e subsequente comparada por meio do alinhamento com a região homóloga disponível para a espécie mais filogeneticamente relacionada do gênero Saccharomyces Meyen ex Rees (1870), em conformidade com Vaughan-Martini e Martini; a dita análise

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13/53 molecular permitiu a identificação da cepa SERIUS como Saccharomyces bayanus subsp. uvarum.

[0050] A cepa também foi submetida à caracterização genotípica por meio da análise dos perfis de restrição de DNA mitocondrial usando a enzima Hint I, conforme descrito por Zilio et al. e comunicado em detalhe no exemplo 1, ponto 1.6 e, adicionalmente, por meio do uso de marcadores moleculares particulares, conhecidos como microssatélites, de acordo com um método, também descritos em detalhes no exemplo 1, ponto 1.6.

[0051] Se transferido ao meio de cultura adequado sob circunstâncias nutritivas limitantes, a cepa de acordo com a invenção é capaz de esporulação. Condições melhoradas para induzir esporulação da cepa SERIUS são obtidas em meio SP (1% acetato de potássio; 0,1% extrato de levedura; 0,05% glicose; 1,8% Agar) incubados a 25 °C por 7-10 dias.

[0052] Outros aspectos positivos encontrados para esta levedura foram observados durante o crescimento em mosto sintético e natural (exemplo 2).

[0053] A levedura que forma o assunto desta patente tem as características enológicas relatadas abaixo: açúcares consumidos após 2 dias (vigor fermentative): aproximadamente 4-5 g/100 ml; açúcares consumidos após 7 dias: cerca de 15-17 g/100 ml; 10-15 dias: duração da fermentação em temperatura ideal; baixa produção de espuma.

[0054] Um aspecto positivo particularmente vantajoso observado com esta levedura diz respeito à produção de H₂S, que é substancialmente ausente.

[0055] Além disso, a cepa é resistente a uma concentração de SO₂ de pelo menos 50, preferencialmente 100, ainda mais preferencialmente 200 e ulteriormente preferencialmente 300 ppm.

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14/53 [0056] A cepa também tem alta resistência ao cobre, em particular, é resistente a uma concentração de cobre de 300 μΐΊποΙ/Ι. Vantajosamente, a dita concentração de cobre também demonstrou ser superior à resistência de cobre de cepas de levedura disponíveis comercialmente, igual a cerca de 50-100 μΐΊποΙ/Ι.

[0057] Preferencialmente, a cepa é armazenada em forma congelada (-80 °C) na presença de agentes crioprotetores apropriados (40 p/p % de glicerol) ou preservada por meio de liofilização/dessecação. Congelamento ou liofilização/dessecação são alcançados através de métodos conhecidos pelos versados na técnica.

[0058] A cepa de acordo com a invenção pode ser vantajosamente industrializada em forma de creme, forma dessecada, forma liofilizada ou na forma de uma pasta, dependendo dos requisitos do usuário.

[0059] A cepa de acordo com a invenção é adaptada para ser usada como inóculo alimentar na produção de alimentos, obtidos através de fermentação alcoólica. Os alimentos que são produzíveis com esta levedura incluem, por exemplo, pão, produtos à base de leite, cidra, cerveja, espumante e vinho. Outras bebidas alcoólicas obtidas a partir da fermentação alcoólica de outras frutas ou cereais, como o trigo ou o arroz, também são, contudo, concebíveis. A cepa também é adaptada para ser usada como um probiótico em suplementos dietéticos ou em alimentos. Os testes de caracterização preliminares sugerem que esta cepa seja resistente à acidez e aos sais biliares e, portanto, tem a possibilidade de sobreviver ao trânsito gástrico.

[0060] Vantajosamente, a cepa de S. bayanus subsp. uvarum SERIUS da invenção tem sido particularmente adequada para a produção de um autolisado de levedura para ser usado como um ativador de fermentação na produção de vinho e outras bebidas alcoólicas.

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15/53 [0061] De acordo com uma variante executiva preferencial da invenção, a cepa é usada como um inóculo em vinificação a fim de obter vinhos, por exemplo, vinhos tintos, vinhos rosé ou vinhos brancos. Além disso, pode também ser usada tanto na fermentação primária quanto na refermentação.

[0062] Vantajosamente, o uso da cepa da invenção em um processo de vinificação permite a produção de um vinho com aromas agradáveis e equilibrados, com uma concentração de H₂S substancialmente inexistente, alta concentração de glicerol e alta concentração de ácido málico.

[0063] Vantajosamente, o vinho é um vinho produzido a partir de uvas selecionadas dentre uvas brancas e uvas escuras. Além disso, as ditas uvas podem ser derivadas tanto de variedades de videira nativa quanto de variedades de videira internacional.

[0064] Em particular, os testes de vinificação realizados em uvas selecionadas a partir de garganega, kerner, trebbiano, merlot, nerello mascalese, nero d'avola e traminer tornaram possível a obtenção de vinhos com aroma agradável e sabor equilibrado.

[0065] De acordo com a modalidade preferencial da invenção, a cepa SERIUS é usada para a produção de vinho contendo glicerol e ácido málico, produzido naturalmente pela cepa nas seguintes concentrações: glicerol superior a cerca de 8,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de

9,5 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 10 g/l; ácido málico superior a cerca de 0,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de 1 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 2 g/l. A cepa SERIUS pode ser facilmente cultivada e é, portanto, particularmente adequada para ser usada para produzir biomassa, mesmo em uma escala industrial, usando métodos padrão conhecidos.

[0066] Preferencialmente, a produção de biomassa usando a cepa SERIUS ocorre em um meio sintético contendo dextrose, extrato de

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16/53 levedura, vitaminas e sais minerais, com fermentação do tipo descontínua (primeiras 24 horas), seguido por fermentação do tipo descontínua alimentada por mais 20-24 horas. Ainda preferencialmente, o crescimento ocorre a uma temperatura entre 29 e 31 °C. A cepa produz etanol e é, portanto, particularmente aplicável na fermentação de alimentos. A cepa não é patogênica para seres humanos ou animais.

[0067] Um outro aspecto da invenção diz respeito a um inóculo alimentar que consiste na cepa de Saccharomyces bayanus identificada como SERIUS (DBVPG 36P). Preferencialmente, o inóculo alimentar é um iniciador de vinho.

[0068] Um aspecto adicional da invenção diz respeito a um vinho obtenível por meio do uso de acordo com a invenção. Vantajosamente, o vinho é um vinho obtido a partir da fermentação de uvas selecionadas dentre uvas brancas e uvas escuras. Vantajosamente, as ditas uvas podem ser vir tanto de variedades de videira nativa quanto de variedades de videira internacional.

[0069] Culturas da levedura de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum SERIUS, obteníveis por meio da reprodução e/ou multiplicação da cepa SERIUS da presente invenção, capaz de ser usada como alimento inoculado na produção de alimentos obtidos por fermentação alcoólica, também devem ser entendidas como sendo protegidas pela presente invenção. De acordo com a variante executiva preferencial da presente invenção, as ditas cepas são adaptadas para serem usadas em processos de fermentação alcoólica para a produção de vinho, ou seja, em processos de vinificação.

[0070] São particularmente preferidas as culturas obtidas a partir da reprodução ou multiplicação da cepa SERIUS da invenção, adaptada para ser usada para a produção de vinho produzido a partir de uvas selecionadas dentre uvas brancas e uvas escuras, em que as ditas

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17/53 uvas podem vir tanto de variedades de videira nativas quanto de variedades de videira internacional.

[0071] Preferencialmente, as ditas culturas são adaptadas para serem usadas para a produção de um vinho contendo glicerol e ácido málico, produzido naturalmente pela cepa nas seguintes concentrações: glicerol superior a cerca de 8,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de

9,5 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 10 g/l; ácido málico superior a cerca de 0,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de 1 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 2 g/l.

[0072] Independentemente de sua espécie, sabe-se que as leveduras podem se reproduzir sexualmente a fim de garantir a sobrevivência da espécie, criando diversidade genética, e a hibridização é uma parte essencial deste ciclo de reprodução sexual, que pode existir na natureza como é ou ser induzida em laboratório. A hibridização referida acima permite a obtenção de novos híbridos de levedura originários a partir de uma cepa mãe, de acordo com um processo que é absolutamente não OGM. Consequentemente, o estabelecimento de cepas híbridas é um modo de evolução para leveduras naturais.

[0073] Assim, as cepas de levedura obtidas através da hibridização da cepa SERIUS com uma cepa de levedura pertencente à mesma espécie, ou ainda, com uma cepa de Saccharomyces, por meio de uma chamada hibridização intraespécies, também formam uma parte da presente invenção.

[0074] Entretanto, não se exclui que, de acordo com as variantes executivas da invenção, as cepas possam ser obtidas por hibridização da cepa SERIUS com cepas de leveduras de outras espécies, por meio da hibridização entre espécies.

[0075] Outro aspecto da invenção diz respeito a um método de seleção de cepas de leveduras a partir de flores, particularmente cepas de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus e Saccharomyces

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18/53 bayanus subsp. uvarum, adaptadas à fermentação alcoólica, particularmente das uvas. Obviamente, a amostragem de flores também pode ser transferida para outras matrizes de isolamento de cepa (por exemplo, frutas, ervas medicinais).

[0076] O método de seleção de acordo com a presente invenção consiste preferencialmente em uma etapa para o isolamento de leveduras de flores, preferencialmente uma etapa de identificação de leveduras, uma fase de semeadura para as leveduras isoladas em placas, a fim de identificar cepas que sejam não produtoras ou de baixa produção de H₂S e uma fase de inoculação em mosto e a vinificação de uvas com o objetivo de estudar suas características tecnológicas e de qualidade.

[0077] De preferência, as uvas usadas são uvas selecionadas dentre uvas brancas ou uvas escuras.

[0078] De acordo com a modalidade preferencial do método da invenção, o vinho obtido durante a etapa de vinificação mencionada acima é analisado e as concentrações de glicerol e ácido málico presentes nele são determinadas. Uma avaliação sensorial também é realizada com o objetivo de identificar odores desagradáveis rastreáveis à presença de compostos sulfurados. É dada especial atenção à identificação dos defeitos de redução devido à presença de H₂S. Posteriormente, as cepas são selecionadas com vigor fermentative aprimorado, produzindo vinhos em que as concentrações de glicerol e ácido málico atendem aos seguintes limites: glicerol superior a cerca de 8,5 g/l, preferencialmente maior do que cerca de 9,5 g/l, mais preferencialmente maior do que cerca de 10 g/l; ácido málico superior a cerca de 0,5 g/l, preferencialmente superior a 1 g/l, preferencialmente superior a 2 g/l; Além disso, a examinação sensorial deve dar nenhuma percepção olfativa de defeitos da redução devido à presença de H₂S, isto é, preferivelmente menos do que 1-1,5 qg/l.

[0079] Vantajosamente, a análise desta combinação específica de compostos tem demonstrado ser muito adequada para a substituição de

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19/53 processos de caracterização mais trabalhosos e adicionais e o achado de cepas produzindo vinhos com aroma agradável e equilibrado.

[0080] Em uma variante preferencial da invenção, o método de seleção de cepas de leveduras da espécie Saccharomyces especificado anteriormente como adaptado para fermentação alcoólica, particularmente de uvas, consiste das seguintes etapas:

a) amostragem de flores, preferencialmente na primavera e em áreas de alta atividade de produção de vinho de uva, e ainda mais preferencialmente longe de vinícolas, a fim de evitar a contaminação com leveduras comerciais usadas em vinícolas que possam estar presentes não apenas nas vinícolas, mas também em áreas adjacentes;

b) fermentação das amostras em substratos adequados e cultivo das amostras fermentadas em meios de isolamento, preferencialmente contendo verde de bromocresol;

c) se o meio de isolamento contiver verde de bromocresol, a identificação de cepas de levedura presumidas do gênero Saccharomyces com base na morfologia e cor da colônia e sua discriminação de não leveduras de Saccharomyces de menor interesse enológico;

d) identificação de isolados pertencentes ao gênero Saccharomyces por meio da análise genética das colônias de levedura isoladas na etapa b) ou etapa c); vantajosamente, dita análise genética, realizada usando métodos moleculares, permite tanto a identificação das espécies de origem e a identificação das várias cepas, ou prefere os indivíduos, presentes dentro de uma dada espécie;

e) fermentação laboratorial das cepas selecionadas na etapa d) em mosto sintético e/ou em mosto natural, e subsequente seleção das cepas com as características tecnológicas e enológicas mais interessantes e ao mesmo tempo semeando as cepas em meio de Agar BIGGY, a fim de identificar aqueles que são não produtores ou de baixa produção de H₂S;

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f) a vinificação vinícola das cepas selecionadas na etapa e) e a seleção das cepas mais adequadas com base nos resultados obtidos através da análise química do vinho obtido, preferencialmente incluindo pH, açúcares residuais, álcool, acidez total, parâmetros de acidez volátil, e, em particular, a quantidade de glicerol, ácido málico e, preferencialmente, sulfeto de hidrogênio, em que este último é avaliado por meios olfativos.

[0081] Preferencialmente, a coleta de flores e seu processamento subsequente é realizada evitando tocar as flores com as mãos e com uma esterilização periódica do equipamento de amostragem, para as etapas a) e b), com o objetivo de limitar a contaminação o tanto quanto possível.

[0082] Por meio de exemplo não limitante, na chegada ao laboratório, as flores são transferidas para frascos estéreis contendo 200 ml de mosto sintético ou outro meio de cultura capaz de sustentar o crescimento de quaisquer leveduras presentes. A adição de um antibiótico a cada amostra, a fim de evitar a proliferação de qualquer bactéria, demonstrou ser particularmente útil.

[0083] Vantajosamente, as preparações são sobrepostas com óleo de parafina estéril, a fim de evitar o crescimento do bolor de superfície.

[0084] As amostras com fermentação óbvia em andamento são processadas para isolamento das leveduras na etapa subsequente b) ou c). Um meio de isolamento muito adequado e preferencial para a dita etapa é o meio de isolamento de Agar WL (4,0 g/l de extrato de levedura, 5,0 g/l de triptona, 50 g/l de glicose, 550 mg/l de fosfato de potássio monobásico, 425 mg/l de cloreto de potássio, 125 mg/l de cloreto de cálcio, 125 mg/l de sulfato de magnésio, 2,5 mg/l de cloreto ferroso, 2,5 mg/l de sulfato de manganês, 22 mg/l de verde de bromocresol, 20 g/l de Agar, pH final 5,5 ±

2). A característica saliente deste meio é que ele contém um corante, verde de bromocresol, que é capaz de ser absorvido pelas leveduras em uma extensão variada. Portanto, é possível caracterizar os microrganismos com

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21/53 base na morfologia das colônias e na cor que eles assumem. Cepas pertencentes ao gênero Saccharomyces absorvem o verde de bromocresol mal, e, portanto, suas colônias assumem uma cor que varia de creme para verde, permitindo a sua discriminação de qualqueis leveduras de não Saccharomyces.

[0085] Vantajosamente, o uso do verde de bromocresol e a execução da etapa c) permitem a redução simples, e em uma etapa inicial do método, do número de cepas a ser sujeitado à etapa subsequente d).

[0086] Ainda vantajosamente, de acordo com uma variante executiva do método da invenção, antes da etapa d), as colônias a serem analisadas são submetidas à purificação por meio de uma ou mais passagens de replantio em meio adequado. Preferencialmente, qualquer replantio ocorre no meio de crescimento de Agar WL. Vantajosamente, o procedimento é repetido a fim de garantir que cada isolado se origine definitivamente a partir de uma única colônia.

[0087] A etapa c) já é um pouco seletiva para o isolamento de cepas pertencentes ao grupo Saccharomyces, mas além de Saccharomyces existem também outras cepas que, neste meio de cultura, podem exibir morfologia e coloração muito semelhantes às das leveduras Saccharomyces. Portanto, a fim de eliminar essas cepas das amostras e dar identificação definitiva aos isolados, é preferível executar a etapa d) que, por meio de um método genético rápido e simples de executar, possibilita a realização de triagem em uma grande número de isolados, eliminando, assim, leveduras não pertencentes ao gênero Saccharomyces e identificando quaisquer cepas (= indivíduos) que devam estar presentes no âmbito de uma determinada espécie.

[0088] Vantajosamente, dita avaliação genética preliminar reduz o risco de realizar a caracterização tecnológica em leveduras que não são potencialmente adaptadas à produção de vinho e, igualmente

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22/53 vantajosamente, permite a exclusão de quaisquer cópias múltiplas da mesma cepa que possam estar presentes em uma dada amostra.

[0089] Ainda vantajosamente, a dita análise preliminar evita a necessidade de testar tecnologicamente e quimicamente as cepas não pertencentes ao gênero Saccharomyces.

[0090] Mais vantajosamente, a dita análise possibilita a realização da caracterização tecnológica e enológica apenas em cepas verdadeiramente diversas e não em quaisquer possíveis cópias múltiplas da mesma cepa.

[0091] A fim de confirmar a origem do gênero Saccharomyces e, consequentemente, excluir as leveduras que pertencem a gêneros diferentes e, consequentemente, desinteressantes a partir do ponto de vista enológico, é preferível usar a caracterização genética que prevê o uso da técnica de PCR. Ambas as técnicas específicas de PCR, capazes de reconhecer as várias espécies de leveduras, e as técnicas de RAPD-PCR (análise de DNA polimórfico amplificado aleatório), conhecidas pelos versados na técnica, podem ser usadas para esse fim.

[0092] Vantajosamente, em casos onde o uso de métodos PCR não permitem a identificação confiável da cepa é possível recorrer a análise potencial da sequência de rDNA; Esta análise torna possível distinguir entre

S. cerevisiae, S. bayanus e S. bayanus subsp. uvarum, espécies que são filogeneticamente intimamente relacionadas e com elevado interesse enológico, com tais características metabólicas para lhes permitirem sobreviver e crescer no vinho. Preferencialmente, o sequenciamento diz respeito à região ITS (espaçador transcrito interno) do operão ribossomal.

[0093] De acordo com a modalidade preferencial do método da invenção, a caracterização genética no nível da cepa na etapa d) é realizada por meio da análise do perfil de restrição de DNA mitocondrial, obtido pela digestão enzimática do DNA total. A digestão enzimática do DNA total é preferencialmente realizada usando a enzima Hint I. A análise

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23/53 genética desse tipo possibilita juntar as leveduras em grupos, cada qual com um perfil genético diferente, comum a todos os isolados pertencentes a esse agrupamento. Com base nos dados genéticos coletados, é possível realizar a triagem nas leveduras coletadas, evitando-se a seleção de múltiplas cópias da mesma cepa.

[0094] De acordo com uma variante executiva do método da invenção, caracterização genética, por meio da análise de polimorfismo de restrição do DNA mitocondrial é usada em associação com a análise de microssatélites. Os microssatélites são sequências repetitivas de DNA não codificado, consistindo em unidades repetidas muito curtas (1-5 bp) arranjadas como repetições em tandem que podem ser usadas como marcadores moleculares de loci genéticos. De acordo com a modalidade preferencial do método da invenção, a análise de microssatélite para a espécie Saccharomyces bayanus subsp. uvarum é realizada nos oito loci mais variáveis, descritos por Masneuf-Pomarede et al. em 2016. As condições de análise são subsequentemente comunicadas em detalhes (exemplo 1, ponto 1.6). Geralmente, uma reação é executada para cada locus nomeado: SuYIL130W (16 formas alélicas), SuYHR102W (8 formas alélicas), SuYKR045C (10 formas alélicas), SuHTZ1PLB3 (7 formas alélicas), SuARS409 (5 formas alélicas), SuYHR042-043 (5 formas alélicas), SuYBR049C (5 formas alélicas), SuYGC170W (4 formas alélicas). Posteriormente, para a definição do perfil e caracterização das cepas, é realizada a amplificação dos produtos de POR relativos aos oito loci citados acima, além da migração eletroforese de gel de agarose, de acordo com métodos conhecidos.

[0095] Vantajosamente, de acordo com o método da invenção, subsequentemente à etapa d), opcionalmente, para a caracterização das leveduras de S. bayanus subsp. uvarum, uma análise adicional dos oito loci descritos acima é executada por meio de PCR-multiplex, preferencialmente duas reações de PCR-multiplex, definido como PCR1 multiplex e PCR2

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24/53 multiplex. Por meio da dita PCR multiplex, é possível amplificar simultaneamente mais do que um locus de cada vez. Em particular, PCR1 multiplex e PCR2 multiplex permitem a amplificação de três e cinco loci respectivamente. Em detalhe, a PCR1 multiplex permite a análise do perfil de DNA-microssatélite para os loci SuYIL130W, SuYHR102W e SuYGC170W, enquanto PCR2 multiplex torna possível obter o perfil de DNA-microssatélite para os loci SuYKR045C, SuHTZ1PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 e SuYBR049C.

[0096] Opcionalmente, de acordo com a modalidade preferencial do método da invenção, para caracterizar adicionalmente as leveduras S. bayanus subsp. uvarum, antes da etapa e), é possível realizar análises genéticas adicionais por meio de eletroforese capilar baseada na amplificação dos quatro loci caracterizados por um maior número de formas alélicas, selecionados de acordo com os dados relatados na literatura.

[0097] Vantajosamente, a dita caracterização torna possível definir o tamanho exato dos produtos de PCR para os loci considerados.

[0098] De acordo com a presente invenção, os loci considerados são os seguintes: SuYIL130W, SuYHR102W, SuYKR045C e SuHTZ1PLB3.

[0099] Preferencialmente, para a caracterização da etapa e) no nível tecnológico, são avaliados os seguintes parâmetros: vigor fermentative, entendido como a quantidade de açúcar consumida após 2 e após 7 dias, e a duração de fermentação, a capacidade de produção de espuma, tipo de crescimento, produção de sulfeto de hidrogênio (em meio de Agar BIGGY), produção de glicerol, produção de acidez volátil, a habilidade de produzir ou degradar o ácido málico, o perfil olfativo dos fermentados.

[00100] No que diz respeito à progressão das fermentações, estes são monitorados em amostras de mosto sintético e/ou mosto natural, preferencialmente em ambos os tipos de mosto. Os principais parâmetros

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25/53 monitorados preferencialmente dizem respeito a: pH, açúcares residuais, nível de álcool, acidez total, acidez volátil, vigor fermentative, produção de glicerol, produção/degradação de ácido málico, perfil olfativo. Os testes de vinificação na vinícola para a etapa f) são preferencialmente realizados em mostos de uvas brancas e mostos de uvas escuras.

[00101] Vantajosamente, a análise da progressão da fermentação para as cepas em mostos de frutas brancas e frutas escuras possibilita verificar a progressão e avaliar a atividade de uma cepa para a produção de vinhos brancos, rosés e tintos, de acordo com necessidades específicas.

[00102] Particularmente vantajosamente, a fase de vinificação do método de acordo com a invenção é realizada em uvas tanto de variedades de videira nativa quanto de variedades de videira internacional. Preferencialmente, as concentrações de glicerol, ácido málico e sulfeto de hidrogênio são determinadas no vinho obtido e as cepas produtoras de vinho são selecionadas onde as concentrações atendem aos seguintes limites: glicerol superior a cerca de 8,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de 9,5 g/l, mais preferivelmente superior a cerca de 10 g/l; ácido málico superior a cerca de 0,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de 1 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 2 g/l; e sulfeto de hidrogênio abaixo do nível de percepção olfativo, ou seja, menos de 1-1,5 qg/l. Vantajosamente, o vinho produzido com a cepa SERIUS caracteriza-se pela presença de quantidades elevadas de glicerol e ácido málico, enquanto a quantidade de sulfeto de hidrogênio é particularmente reduzida. Em particular, o vinho produzido pela cepa da invenção tem glicerol em quantidades superiores a 9 g/l, ácido málico, em quantidades superiores a

1,1 g/l e H₂S em quantidades inferiores ao nível de percepção olfativo.

[00103] Os parâmetros tecnológicos e químicos examinados podem variar dependendo das características exigidas para a cepa e também dependem do tipo de vinho a ser produzido usando a cepa

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26/53 selecionada. A seleção das cepas mais adequadas no final das etapas individuais é preferencialmente uma seleção combinada considerando todos os resultados de todas as análises realizadas.

[00104] Este método de seleção garante a triagem de múltiplos isolados de levedura originários de flores.

[00105] Exemplos particulares de execução das etapas individuais foram descritos nos exemplos 1, 2 e 3. As etapas individuais devem ser consideradas como sendo independentes umas das outras, ou seja, a execução da etapa d) de maneira definida não implica automaticamente, por exemplo, na execução da etapa e) precisamente como relatado nos exemplos. Os parâmetros dentro de uma etapa (por exemplo, os tipos de parâmetros tecnológicos em teste) podem ser alterados independentemente das outras etapas.

Breve descrição das figuras [00106] Figura 1 relata a árvore filogenética construída com base em sequências de ITS, em que a cepa SERIUS da presente invenção é indicada como P16063.BI01;

[00107] Figura 2 mostra o perfil de restrição de DNA mitocondrial para a cepa da invenção, obtido usando-se a enzima Hint I, indicada pelo número 1), em que o perfil indicado como M corresponde ao marcador de peso molecular;

[00108] Figura 3 mostra os resultados da eletroforese de gel de agarose para cada produto de PCR obtido pela amplificação do DNA a partir da cepa SERIUS nos oito loci mais variáveis. A ordem de carregamento mostrada é a seguinte:

(M) Marcador O'Gene Ruler (Fermentas), (1) Produto de PCR para o locus SuYILI 30W, (2) Produto de PCR para o locus SuYHRI 02W, (3) Produto de PCR para o locus SuYKR045C, (4) Produto de PCR para o locus SuHTZI PLB3,

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27/53 (5) Produto de PCR para o locus SuARS409, (6) Produto de PCR para o locus SuYHR042-043, (7) Produto de PCR para o locus SuYBR049C, (8) Produto de PCR para o locus SuYGCI 70W, (9) o perfil obtido carregando os produtos da amplificação obtidos nas reações individuais de PCR para os loci SuYIL130W, SuYHR102W, SuYKR045C e SuHTZI PLB3 no mesmo poço, (10) o perfil obtido carregando os produtos da amplificação obtidos nas reações individuais de PCR para os loci SuARS409, SuYHR042-043, SuYBR049C e SuYGCI 70W no mesmo poço;

[00109] Figura 4 relata o resultado eletroforese para as 2 reações PCR-multiplex em 3% de gel de agarose, na ordem de carregamento que corresponde ao seguinte:

(M) Marcador O'Gene Ruler (Fermentas), (1) Produto PCR1 -multiplex para os loci SuYILI 30W, SuYHRI 02W e SuYGCI 70W, (2) Produto PCR2-multiplex para os loci SuYKR045C, SuHTZ1PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 e SuYBR049C.

Exemplo 1 - Etapas de isolamento e seleção para a cepa de acordo com a invenção

1.1 Amostragem [00110] A amostragem foi conduzida coletando flores durante a primavera, em uma área da região de Vêneto com a atividade de produção elevada de vinho de uva.

[00111] A coleta foi realizada evitando tocar as flores com a mão nua em todos os estágios e periodicamente esterilizando a tesoura, com o objetivo de limitar a contaminação, tanto quanto possível.

[00112] As flores foram colhidas em quantidade suficiente para encher um saco esterilizado devidamente selado. Após a chegada no laboratório, as flores foram transferidas para frascos esterilizados contendo

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200 ml de mesto sintético, previamente preparados em água destilada, ajustados para pH 3,2 usando KOH, e esterilizados por filtração, cuja composição é relatada na tabela 1.

Tabela 1

Categoria de componente	Componente	Dose por litro
Macroelementos	CaCI₂	0,1 g
NaCI	0,1 g
KH₂PO₄	1 g
MgSO₄ x 7H₂O	0,5 g
Ácido tartárico	3g
Microelementos	NaMoO₄ x 2H₂O	0,2 mg
ZnSO₄ x 7H₂O	0,4 mg
H3BO3	0,5 mg
CuSO₄ x 5H₂O	0,04 mg
Kl	0,1 mg
FeCI₃ x 6H₂O	0,4 mg
MnSO₄x H₂O	0,4 mg
Vitaminas	Cloridrato de piridoxina	400 μρ
Cloridrato de tiamina	400 μρ
Inosita	2000 μρ
Biotina	20 μρ
Pantotenato de cálcio	400 μρ
Nicotinamida	400 μρ
Ácido p- aminobenzoico	200 μρ
Componentes variados	(NH₄)₂SO₄	0,3 p
(NH₄)₂HPO₄	0,3 p
Glicose	200 p
Hidrolisado de caseína	0,2 p
Ácido málico	2g
[00113] Além d	isso, 0 mosto sintético foi suplementado com o

antibiótico, oxitetraciclina, em uma concentração de 0,1 mg/ml, de modo a evitar qualquer proliferação bacteriana. As preparações foram então sobrepostas com óleo de parafina esterilizado, a fim de evitar a formação de bolor. Os frascos foram selados usando um batoque de silicone furado, dentro do qual uma pipeta de Pasteur, curvada na extremidade superior, foi

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29/53 introduzida. Isto tem a finalidade de evitar a potencial contaminação com microrganismos presentes no ambiente e de permitir que o CO₂ ventile sem a perda de vapor de água. Os frascos foram colocados em uma incubadora a uma temperatura constante entre 22 °C e 25 °C.

[00114] O progresso da fermentação tem sido monitorado medindo-se a diminuição do peso para cada frasco (um indicador da fermentação de açúcares para CO₂ e, portanto, do progresso da fermentação).

/.2 Isolamento das cepas a partir das amostras [00115] Após a conclusão da fermentação, foram retirados 10 ml de produto de cada frasco, foi realizada uma primeira diluição em série de 1:10, a partir da qual 1 ml foi retirado e foram realizadas 5 diluições seriais subsequentes (1:10) na solução de Ringer; 100 μΙ das três diluições finais foram semeadas espalhando-se em meio de Agar WL (4,0 g/l de extrato de levedura, 5,0 g/l de triptona, 50 g/l de glicose, 550 mg/l de fosfato de potássio monobásico, 425 mg/l de cloreto de potássio, 125 mg/l de cloreto de cálcio, 125 mg/l de sulfato de magnésio, 2,5 mg/l de cloreto de ferro, 2,5 mg/l de sulfato de manganês, 22 mg/l de verde de bromocresol, 20 g/l de Agar) adequadamente esterilizado por autoclave e ajustado a um pH final de 5,5 ± 2. As placas foram incubadas então a 28 °C por 3 dias sob circunstâncias aeróbias. Neste meio, colônias de levedura do gênero Saccharomyces aparecem com cores diferentes, variando de creme a verde claro, com uma superfície lisa-opaca e uma consistência cremosa. A contagem da levedura revelou uma concentração de Saccharomyces de cerca de 10⁷ CFU/ml, com a presença de ambas colônias brancas e verdes, com uma superfície liso-opaca e uma consistência cremosa.

1.3 Purificação e armazenamento dos isolados [00116] As colônias colhidas das placas de isolamento foram replantadas em meio de crescimento de Agar WL, cuja composição foi especificada no ponto 1.2 do exemplo 1. O procedimento foi repetido pelo

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30/53 menos duas vezes, de modo a ter certeza de que cada isolado se origina a partir de uma única colônia. As culturas puras obtidas após a passagem final nas placas foram colhidas usando uma alça esterilizada e, em seguida, criopreservadas a -80 °C após a adição de glicerol a 40% (p/p). Em placas, a cepa, posteriormente identificada como Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, aparece como pequenas colônias, com uma cor verde intensa, enquanto cepas atribuíveis à espécie Saccharomyces cerevisiae vêm de colônias maiores, com uma consistência cremosa, cor branca ou tendendo para verde claro.

1.4 identificação dos isolados na espécie e nível de cepa [00117] As presumíveis colônias de leveduras Saccharomyces foram identificadas no nível de espécie por meio de RAPD-PCR usando o primer M13, de acordo com o método descrito por Andrighetto et al. em 2000. Na análise e subsequente processamento de perfis de amplificação para as leveduras isoladas de flores, foram também incluídas cepas de referência e tipo de várias espécies de leveduras de interesse enológico e não enológico. A comparação dos perfis possibilitou o reconhecimento de leveduras atribuíveis à espécie S. cerevisiae e S. bayanus.

[00118] Para ser capaz de discriminar a nível de cepa, duas técnicas foram usadas:

1) Análise de perfis de restrição de DNA mitocondrial;

2) Análise de microssatélites;

que será descrita em detalhes nos exemplos executivos da seção 1.6.

[00119] Não se exclui que a implementação das ditas técnicas genéticas possa ser realizada usando métodos conhecidos em si pelos versados na técnica e que, portanto, as indicações técnicas descritas neste documento podem variar do relatado nos exemplos citados acima.

1.5 Caracterização tecnológica das cepas isoladas

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31/53 [00120] A fim de avaliar as características da fermentação, cada uma das leveduras selecionadas foi submetida a testes de fermentação, usando mosto natural ou sintético de acordo com a composição descrita na tabela 1.

[00121] O inóculo foi preparado em mosto sintético ou natural (dependendo se o teste de avaliação de vigor fermentative foi realizado em mosto sintético ou mosto natural), iniciando a partir de uma trava de laço de arame retirada de uma cultura de crescimento inclinado ou em placa, e foram então incubadas a 25 °C durante 24 horas. Subsequentemente, isso tem sido inoculado na região de 10% em mosto sintético ou natural com um volume final de 200 ml, em frascos selados com um batoque de silicone de centro furado, dentro do qual foi inserida uma pipeta Pasteur, dobrado de modo a permitir a ventilação de dióxido de carbono sem perda de vapor de água.

[00122] A queda de peso devido à perda de CO₂ a partir dos frascos, configurada para o teste de fermentação, foi monitorada diariamente até a conclusão da fermentação, correspondendo à fase em que a queda de peso permaneceu constante por vários dias. Para cada isolado crescido, a habilidade de produzir espuma durante a fermentação foi avaliada por meio de avaliação visual. Novamente, por meio da avaliação visual, o método de crescimento foi avaliado para a cepa durante a fermentação (pulverulenta ou floculenta).

[00123] Finalmente, para a avaliação da produção de sulfeto de hidrogênio, cada isolado foi semeado em meio de Agar BIGGY (Agar de bismuto glicose glicina levedura: 5 g/l de citrato de amônio e bismuto, 3 g/l de sulfito de sódio, 10 g/l de glicose, 10 g/l de glicina, 1 g/l extrato de levedura, 16 g/l de Agar, pH 6,8 ± 0,2) e incubados a 25 °C por 5 dias, após os quais a cor das colônias cultivadas nas placas foi avaliada. A quantidade de sulfeto de hidrogênio é diretamente proporcional à intensidade da cor, devido à criação de sulfito de bismuto (marrom escuro se presente em

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32/53 quantidades significativas). A caracterização tecnológica dos isolados a partir de flores tornou possível identificar certas cepas de levedura Saccharomyces, incluindo a cepa Saccharomyces bayanus subsp. uvarum SERIUS, dotada de promissores características enológicas.

1.6 Caracterização genética ao nível da cepa [00124] A fim de alcançar a caracterização ao nível da cepa, foram usadas duas técnicas:

Análise de perfis de restrição de DNA mitocondrial;

Análise de microssatélites;

[00125] A análise dos perfis de restrição foi realizada seguindo o método relatado em Zilio et ai. em 1998, usando a enzima de restrição Hint

I. a separação dos fragmentos lineares de DNA foi obtida por eletroforese em gel de agarose a 1%. A comparação dos perfis de restrição foi realizada usando o software GelComparll (Applied Maths, Bélgica), o qual, por meio da construção de uma matriz, é capaz de calcular o nível de similaridade entre os perfis e expressar os resultados graficamente como um dendrograma. O perfil de restrição de DNA mitocondrial para a cepa SERIUS da invenção, obtida utilizando a enzima Hinf I. é mostrado na Figura 2.

[00126] A análise de microssatélite contempla o uso da técnica de PCR com primers que são complementares às regiões do DNA conhecidas como microssatélites, que são pequenas sequências de DNA repetido em tandem (de uma a seis bases) variando no número de repetições, podendo também ser localizadas dentro de regiões de codificação genômicas (Legras, 2005). Eles são extremamente variáveis em comprimento, como resultado de erros de replicação de DNA, e, portanto, exibem um certo grau de polimorfismo entre indivíduos na mesma espécie. A análise do polimorfismo de microssatélites é um método altamente reprodutível porque os primers específicos e temperaturas elevadas de recozimento são usadas para sua amplificação. Para a

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33/53 caracterização da cepa de S. bayanus subsp. uvarum SERIUS, os oito loci mais variáveis descritos por Masneuf-Pomarede et al. em 2016 foram considerados e uma reação foi executada para cada locus nomeado: SuYIL130W (16 formas alélicas), SuYHR102W (8 formas alélicas), SuYKR045C (10 formas alélicas), SuHTZ1PLB3 (7 formas alélicas), SuARS409 (5 formas alélicas), SuYHR042-043 (5 formas alélicas), SuYBR049C (5 formas alélicas), SuYGC170W (4 formas alélicas).

[00127] A reação foi conduzida em um volume de 20 μΙ usando 1 U do polimerase de DNA no amortecedor 1 x, com a adição de cloreto do magnésio (MgCI₂) em uma concentração de 1,5 mM, trifosfatos de nucleótidos (dNTPs) em uma concentração de 200 μΜ e de 1 μΜ para cada um dos primers para cada reação.

[00128] A amplificação foi realizada em um Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf) com um programa térmico único para todas as reações de amplificação, com exceção da temperatura de recozimento (Ta). O protocolo térmico usado é relatado na tabela 2 abaixo (o número de repetições para cada ciclo é relatado entre parênteses).

Tabela 2

Protocolo de amplificação
Ciclo	Temperatura	Duração
Ciclol (1x)	94°C	5 min
Ciclo2 (30x)	94°C	30 s
Ta °C	30 s
72°C	30 s
Ciclo3 (1x)	72°C	10 min

[00129] A Ta usada foi ajustada em 55 °C para reações de PCR a respeito dos loci SuYIL130W, SuYHR102W e SuYGC170W; enquanto a Ta mencionada acima foi ajustada em 50 °C para as reações de PCR a respeito dos loci SuYKR045C, SuHTZ1PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 e SuYBR049C.

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34/53 [00130] Amplificação e migração de eletroforese de gel de agarose dos produtos de PCR relacionados com os oito loci mais variáveis em S. bayanus var. uvarum, tornaram possível, para a cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum SERIUS, definir o perfil único e característico repostado na Figura 3.

[00131] Além da reação individual de PCR, os oito loci mencionados acima foram também analisados por meio de duas reações multiplex, capazes da amplificação simultânea de três e cinco loci, respectivamente.

[00132] Em particular, duas reações da PCR-multiplex foram usadas: PCR1-multiplex permite a análise do perfil de DNA-microssatélite para loci SuYIL130W, SuYHR102W e SuYGC170W, e PCR2-multiplex permite a obtenção do perfil de DNA-microssatélite para o loci SuYKR045C, SuHTZ1PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 e SuYBR049C.

[00133] As duas reações PCR-multiplex foram conduzidas em um volume de 20 μΙ, usando 1,5 U e 1 U do polimerase de DNA respectivamente em amortecedor 1 x, com a adição de cloreto do magnésio (MgCI₂) em uma concentração de 1,5 mM e trifosfatos de nucleótidos (dNTPs) em uma concentração de 200 μΜ. A concentração de primers foi otimizada conforme o seguinte.

[00134] No caso de PCR1-multiplex, os dois primers para o locus SuYIL130W foram adicionados em uma concentração de 0,25 μΜ, os dois primers para o locus SuYHR102W em uma concentração de 0,75 μΜ, enquanto os dois primers para o locus SuYGC170W em uma concentração de 1 μΜ.

[00135] No caso de PCR2-multiplex, os dois primers para os loci SuYKR045C, SuHTZ1PLB3, SuARS409, SuYHR042-043 e SuYBR049C foram aplicados em uma concentração de 0,5 μΜ.

[00136] A amplificação foi realizada em um Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf) com um programa térmico único para todas as

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35/53 reações de amplificação, com exceção da temperatura de recozimento (Ta). O programa térmico usado é relatado na tabela 3 abaixo (o número de repetições para cada ciclo é relatado entre parênteses).

Tabela 3

Protocolo de amplificação
Ciclo	Temperatura	Duração
Ciclo 1 (1x)	94°C	5 min
Ciclo 2 (30x)	94°C	30 s
Ta °C	30 s
72°C	30 s
Ciclo 3 (lx)	72°C	10 min

[00137] No caso de PCR1-multiplex, a Ta usada foi de 55 °C, enquanto que no caso de PCR2-multiplex foi de 50 ° c.

[00138] Os perfis obtidos a partir da referida análise são relatados na Figura 4.

[00139] Além disso, a caracterização da cepa da invenção também foi realizada por meio de eletroforese capilar com base na amplificação dos quatro loci que, segundo dados da literatura, caracterizam-se por um maior número de formas alélicas.

[00140] Vantajosamente, a dita caracterização tornou possível definir o tamanho exato dos produtos de PCR para os 4 loci considerados.

[00141] Os loci considerados são os seguintes: SuYIL130W, SuYHR102W, SuYKR045C e SuHTZ1PLB3. A amplificação foi executada de acordo com o protocolo relatado previamente, com a única variação que consiste na modificação da 5' extremidade dos primers para frente com uma molécula fluorescente. Em particular, SuYIL130W-FW e SuYKR045CFW foram rotulados com Hexacloro-fluoresceína (HEX), enquanto SuHTZI PLB3-FW e SuYHR102W-FW foram rotulados com 6carboxifluoresceína (FAM).

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36/53 [00142] Análise do perfil capilar foi executada usando o filtro D, com referência interna ROX. A interpretação foi realizada usando o software Peak Scanner 2,0, com os seguintes parâmetros: tamanho padrão: GS500 (-250) e método de análise: dimensionamento padrão NPP. Os resultados obtidos, ou seja, os tamanhos dos fragmentos, são relatados na tabela 4 e expressos em pares de base (bp) com um erro de +/-1 bp.

Tabela 4

Cepa	SuYIL130W	SuYHR102 W	SuYKR045 C	SuHTZIPLB 3
Saccharomyce s bayanus var. uvarum SERIUS	179	219	300	259

[00143] Não se exclui que a implementação das ditas técnicas genéticas possa ser realizada usando métodos em si conhecidos pelos versados na técnica e que, portanto, as indicações técnicas mencionadas acima podem variar do relatado.

Exemplo 2 - Caracterização tecnológica da levedura

2.1 Produção de sulfeto de hidrogênio [00144] A produção de sulfeto de hidrogênio pela cepa SERIUS foi avaliada por meio de incubação a 25 °C por 5 dias em meio de Agar BIGGY (1 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de glicina, 10 g/l de dextrose, 5 g/l de citrato de amônio e bismuto, 3 g/l de sulfito de sódio, 16 g/l de Agar). Na conclusão da incubação, neste meio, as colônias aparecem com cores diferentes, com base na quantidade de sulfeto de hidrogênio que produzem. Colônias que são de cor marrom escuro indicam alta produção de sulfeto de hidrogênio, colônias que são de cor marrom claro-bege indicam produção moderada, enquanto as colônias brancas são caracterizadas pelo fato de que são incapazes de produzi-lo. Após a incubação no meio de Agar BIGGY, colônias da cepa da invenção aparecem em cor branca, assim, sob as condições testadas, a cepa é

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37/53 incapaz de produzir H₂S. Testes também foram repetidos pela análise da produção de sulfeto de hidrogênio em meio de Agar acetato de chumbo (15 g/l de peptona, 5 g/l de peptona proteose, 1 g/l de glicose, 0,2 g/l de acetato de chumbo, 0,08 g/l de tiossulfato de sódio, 15 g/l de Agar) incubado a 25 °C e os resultados obtidos foram análogos àqueles obtidos com meio de Agar BIGGY.

2.2 Vigor fermentativo [00145] O vigor fermentativo da cepa da invenção foi avaliado em tanto mostos sintéticos, as características de que são descritas no exemplo 1, ponto 1.1, quanto em vários tipos de mosto naturais de uvas brancas e de uvas escuras. O inóculo foi preparado em mosto sintético ou natural (dependendo se o teste de avaliação de vigor fermentativo foi realizado em mosto sintético ou mosto natural), iniciando a partir de uma trava de laço de arame retirada de uma cultura de crescimento inclinado ou em placa, e foram então incubadas a 25 °C durante 24 horas. Subsequentemente, isso tem sido inoculado na região de 10% em mosto sintético ou natural com um volume final de 200 ml, em frascos selados com um batoque de silicone de centro furado, dentro do qual foi inserida uma pipeta Pasteur, dobrado de modo a permitir a ventilação de dióxido de carbono sem perda de vapor de água. Desta forma, foi possível acompanhar o andamento da fermentação por meio do monitoramento da queda de peso devido à produção de CO₂, um indicador de fermentação dos açúcares. A incubação foi conduzida em uma temperatura constante de 25 °C e a avaliação da perda de peso foi executada cada 1-2 dias, até conseguir o peso constante. Usando os dados coletados, as curvas de crescimento foram preparadas e o vigor fermentativo da cepa de Saccharomyces bayanus var. uvarum SERIUS foi comparado com o vigor fermentativo de cepas comerciais de Saccharomyces bayanus e cerevisiae. Nos vários testes de fermentação, a cepa da invenção tem apresentado uma boa habilidade de fermentação, com perda média de valores de peso aos 2 e 7 dias que são análogas

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38/53 àquelas observadas com leveduras comerciais da espécie Saccharomyces cerevisiae e com tempos de completação de fermentação variando dependendo do tipo de mosto usado (de 10 a 15 dias).

[00146] O vigor fermentative da cepa também foi avaliado em mosto natural obtido a partir de uvas Trebbiano, por meio de incubação a temperaturas de 12, 15 e 24 °C. A análise revela que a cepa tem boa habilidade fermentativa, mesmo em temperaturas de 12 °C e 15 °C.

[00147] Vantajosamente, esta última característica da cepa da invenção permite seu uso em fermentações de vinho a baixas temperaturas, aumentando assim a possibilidade de ativação de reações bioquímicas específicas, levando à produção de compostos aromáticos tendo uma influência positiva sobre as qualidades organolépticas do vinho produzido.

2.3 Produção de glicerol [00148] A produção de glicerol foi avaliada por meio de HPLC (detector Jasco RI 930, coluna RezexTM ROA-Organic Acid H+ 8% (300 x 7,8 mm) em mosto natural de uvas brancas e uvas escuras inoculado com a cepa SERIUS, com incubação a 25 °C até a conclusão da fermentação.

[00149] Além disso, testes comparativos foram estabelecidos quando uma cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae foi inoculada. Os resultados obtidos são relatados na tabela 5, em que a quantidade de glicerol produzido é expressa em g/l. Pode-se observar que a cepa da invenção mostra significativa produção de glicerol, maior em média do que a quantidade de glicerol produzida no mesmo mosto por levedura comercial usada como comparação.

Tabela 5

	Mostos de fruta branca	Mostos de fruta escura
Cepa	Garganega	Kerner	Trebbiano	Merlot	Nerello Mascalese	Nero d' Avo Ia
SERIUS	8,8	10,6	8,7	9,1	9,8	9,5

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39/53

s. cerevisiae comercial

6,8

7,5

5,8

8,1

6,5

A Produção de ácido málico [00150] A cepa da invenção foi testada para a habilidade de produzir ácido málico em mosto natural de fruta branca e fruta escura, após a incubação a 25 °C até a conclusão da fermentação. Em particular, a quantidade de ácido málico presente nos vários mostos antes e após a fermentação, usando a cepa mencionada acima, foi avaliada por meio do detector HPLC Jasco UV 975, coluna ResexTM ROA-ácido orgânico H + 8% (300 X 7,8 mm). Analogamente ao exemplo 2.3, os testes comparativos foram conduzidos com um inóculo da cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae usado previamente. Os resultados obtidos são relatados na tabela 6, em que a quantidade de ácido málico é expressa em g/l. Pode-se observar que a cepa SERIUS é capaz de produzir ácido málico, embora com eficiência variável, em 5 dos 6 mostos testados, diferentemente da cepa comercial, que se caracteriza pela habilidade de degradar parcialmente o ácido málico.

Tabela 6

Mosto	Antes da fermentação	Fim da fermentação SERIUS	Fim da fermentação comercial S. cerevisiae
Garganega	1,3	3,9	1,2
Kerner	3,0	4,0	2,1
Trebbiano	1,8	1,3	1,5
Merlot	2,3	3,0	1,2
Nerello Mascalese	2,8	3,1	1,4
Nero d' Avo Ia	1,5	2,5	1,2

2.5 Produção de acidez volátil [00151] A habilidade de produzir ácido acético foi avaliada por meio de HPLC detector Jasco RI 930, coluna RezexTM ROA-Organic Acid H+ 8% (300 X 7,8 mm) em mosto natural de uvas brancas e uvas escuras inoculado com a cepa SERIUS, incubado a 25 °C até a conclusão da

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40/53 fermentação. Testes comparativos inoculados com uma cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae também foram estabelecidos. Os resultados obtidos são relatados na tabela 7, onde os valores de produção de ácido acético, expressos em g/l, são relatados, demonstrando que a cepa da invenção é caracterizada pela habilidade de produzir pouca acidez volátil.

Tabela 7

Mosto	Antes da fermentação	Fim da fermentação SERIUS	Fim da fermentação comercial S. cerevisiae
Garganega	0	0,11	0,29
Kerner	0	0,22	0,18
Trebbiano	0	0,16	0,23
Merlot	0	0,30	0,39
Nerello Mascalese	0	0,22	0,46
Nero d' Avola	0	0,1	0,18

2.6 Atividade Killer [00152] A presença de atividade killer na levedura SERIUS tem sido estudada usando-se meio de Agar YEPD, preparado por meio da inoculação prévia e da incubação de noite anterior de uma cultura de uma cepa indicadora sensível. Operativamente, após ter deixado as ditas placas incluindo a cepa indicadora para secar, 10 μΙ de uma cultura fresca da cepa SERIUS foi depositada neles e as mesmas placas foram deixadas para incubar por 48 horas em 25 °C. Posteriormente, após a conclusão do período de incubação, a atividade killer foi detectada pelo aparecimento de halos de inibição (um halo de inibição é entendido como sendo uma área com a ausência de crescimento) em torno da colônia da cepa sendo testada.

[00153] No que diz respeito à cepa SERIUS, a atividade killer foi testada em relação a 10 cepas de leveduras enológicas pertencentes às espécie S. cerevisiae e S. bayanus respectivamente.

[00154] A análise mostrou que nenhuma das leveduras testadas foi inibida pela cepa da invenção. Além disso, nenhuma das 10 leveduras testadas demonstrou a habilidade de inibir a cepa SERIUS.

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2.7 Resistência ao cobre e resistência ao dióxido de enxofre [00155] A resistência de cobre foi experimentada por meio do crescimento no meio sintético de YNB (base de nitrogênio da levedura), caracterizada pela ausência de aminoácidos e pela presença de 6,7 g/l de sulfato, 20 g/l de glicose e 20 g/l de Agar, suplementado com várias concentrações de CuSO₄ (50, 100, 200, 300 μΐΊΠοΙ/Ι respectivamente). No que diz respeito à resistência ao dióxido de enxofre, esta tem sido avaliada por meio de crescimento em mosto agarizado suplementado com metabissulfito de potássio em tais concentrações como para dar uma concentração de SO₂ final essencialmente correspondente a 50, 100, 200 e 300 ppm. Ambas as análises descritas acima foram realizadas por meio de incubação da cepa SERIUS em mídia previamente preparada por 48 horas a 26 °C e um crescimento visível foi avaliado em placas.

[00156] Os resultados obtidos são relatados na tabela 8, expressa como MTC (concentração máxima tolerada, de cobre ou dióxido de enxofre, respectivamente). Como pode ser observado a partir da tabela a seguir, a cepa SERIUS demonstra a habilidade de crescer na presença de 300 ppm de SO₂ e 300 μΐΊποΙ/Ι de cobre.

[00157] A título de comparação, os testes mencionados acima também têm sido conduzidos sobre 5 cepas comercialmente disponíveis de

S. cerevisiae para uso enológico.

Tabela 8

Cepa	MTC SO₂ (ppm)	MTC CuSO₄ (μπίοΐ/ΐ)
SERIUS	300	300
S. cerevisiae Comercial 1	300	50
S. cerevisiae Comercial 2	300	50
S. cerevisiae Comercial 3	50	50
S. cerevisiae Comercial 4	300	100
S. cerevisiae	300	100

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Comercial 5

2.8 Tolerância ao etanol [00158] A tolerância ao etanol foi experimentada usando mosto agarizado incluindo concentrações variadas de etanol, correspondendo a 12, 14, 16 e 18%, respectivamente. A cepa SERIUS foi incubada no dito meio por 48 horas a 26 °C, após a conclusão da qual o crescimento visível foi avaliado em placas.

[00159] A análise mostra que a cepa SERIUS tem um valor MTC para etanol igual a 16% vol/vol.

2.9 Uso de fonte de carbono [00160] A habilidade da cepa SERIUS para assimilar/fermentar vários compostos de fonte de carbono foi avaliada por meio do crescimento da cepa mencionada acima em meios contendo extrato de levedura (10 g/l), peptona (20 g/l) e açúcar/ácido orgânico em uma concentração de 20 g/l.

[00161] A análise demonstrou que a cepa SERIUS é capaz de usar tais compostos orgânicos como galactose, rafinose, maltose e ácido glucônico.

2.10 Produção de composto volátil e perfil aromático [00162] A produção de acetaldeído, acetato de metilo, acetato de etila e álcoois superiores foi avaliada após a conclusão da fermentação em amostras de mosto Trebbiano inoculado e fermentado usando a cepa SERIUS e em amostras do mesmo mosto inoculado e fermentados com uma levedura de Saccharomyces cerevisiae comercial. A determinação dos compostos voláteis foi conduzida por meio de cromatografia gasosa, injetando amostras de vinho adequadamente destilado diretamente em uma coluna polar ZB-WAX Plus (fase estacionária de polietileno glicol, FID detector de ionização de chamas).

[00163] Os resultados obtidos, expressados em mg/l, são relatados na tabela 9.

Tabela 9

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43/53

Metabólito (mg/l)	SERIUS	COMM 1
Acetaldeído	52	42
Acetato de metilo	<2	<2
Acetato de etila	41	25
Metanol	0,05	0,04
2-butanol	<2	<2
N-propanol	55	23
Isobutanol	43	40
Acetato de isoamilo	<2	<2
N-butanol	<2	<2
Isoamilos	69	120

00164] A cepa SERIUS produz quantidades ligeiramente mais elevadas de acetaldeído em relação àquelas produzidas pela levedura comercial usada para comparação, concentrações, no entanto, que não estão comprometendo a qualidade dos vinhos. Na verdade, sabe-se que uma baixa concentração do dito composto no vinho dá um aroma frutado agradável, enquanto em concentrações crescentes, o vinho tem uma tendência a liberar um odor pungente e irritante, de modo a tornar-se não comercializável quando a concentração de acetaldeído excede 500 mg/l.

[00165] No que se refere a álcoois superiores, a cepa SERIUS produz N-propanol em maiores quantidades comparadas com a cepa de referência comercial, enquanto produz quantidades similares de isobutanol; no entanto, estes álcoois não tem um papel olfativo significativo no vinho.

[00166] Por outro lado, em comparação com a cepa comercial S. cerevisiae, a cepa SERIUS produz uma menor quantidade de álcool isoamílico; o último álcool mais elevado desempenha um papel importante, uma vez que resulta no chamado odor amílico, que é considerado muito negativo a partir de um ponto de vista olfativo.

[00167] O perfil aromático da cepa SERIUS foi avaliado por meio da técnica de extração em fase sólida (SPE) usada em mosto de uvas Trebbiano, obtido após a incubação com a cepa mencionada acima a 25 °C por um período de tempo suficiente para atingir a conclusão da

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44/53 fermentação. Além disso, analogamente, duas cepas comerciais de S. cerevisiae foram examinadas por meio de comparação.

[00168] Operativamente, 10 ml de cada cepa amostrada (SERIUS e as duas cepas comerciais) foram diluídos com 30 ml de água e cravados com padrão interno (1-heptanol) e absorvidos na coluna SPE C18. A eluição foi realizada usando diclorometano e o eluato, reduzido a um pequeno volume, foi injetado no sistema Shimadzu GC2010/QP2010 GC/MS. A identificação dos compostos resultantes foi realizada por meio da pesquisa das versões mais recentes das bibliotecas Whiley e NBS disponíveis no momento da preparação da presente aplicação.

[00169] A partir da presente análise, demonstra-se que a cepa da invenção permite a obtenção de um vinho com concentrações de ácidos graxos (ácido isovalérico, ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido butanoico, ácido decanoico) que são, em média, 2-3 vezes menos que os detectados em vinhos obtidos com as duas cepas comerciais. Sabe-se que certos ácidos graxos de cadeia média e longa (C6, C8, C10, C12) podem ter efeitos inibitórios em relação à atividade fermentativa das leveduras. Em particular, mesmo em baixas concentrações (alguns miligramas/litro), o ácido decanoico (C10) mostra uma atividade antagônica significativa em relação aos processos de fermentação.

[00170] Uma característica adicional que diferencia a cepa SERIUS das duas cepas comerciais usadas por meio da comparação é a produção significativamente maior (30 vezes maior em média) de ésteres fenil-etílicos do ácido octanoico, compostos voláteis que dão o aroma típico de cacau verde. Finalmente, o vinho obtido com a levedura SERIUS mostra concentrações reduzidas de pirazina e piperazina, moléculas responsáveis por aromas de ervas e plantas.

Exemplo 3 - Caracterização enológica da levedura, testes de vinificação

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45/53 [00171] A cepa da invenção foi testada por meio de testes de vinificação de vinícolas em mostos de uvas escuras e de uvas brancas.

[00172] O processo produtivo usado foi o tipo descontínuo alimentado, seguido pela concentração da cultura por meio de centrifugação. Em seguida, uma biomassa de levedura foi preparada em forma de creme, com um teor de substância seca essencialmente igual a 22% e uma concentração de levedura de aproximadamente 10 bilhões de UFC/g.

[00173] Para posterior inoculação do mosto, a biomassa foi ressuspendida em uma suspensão vínica consistindo de levedura, mosto e ativadores.

[00174] Em particular, para uso em um tanque de 5000 litros, 1 kg de biomassa em forma de creme da levedura SERIUS foi suspensa a uma temperatura de 25 °C em 200 litros de mosto, suplementado com ativadores nas concentrações de trabalho recomendadas pelo fabricante e conhecido comercialmente. A suspensão foi mantida em movimento usando um agitador ou bomba de trasfega por 2/4 horas. Subsequentemente, a dita suspensão foi acrescentada ao mosto por meio de trasfega.

3.1 Teste usando mosto de uva Traminer com acidificação de mosto [00175] A levedura da invenção foi testada com mosto de uva Traminer (fruta branca) de uma vinícola em um tanque de 50 hl.

[00176] A levedura, preparada em forma de creme fresco, tem sido usada em uma dose de 20 g/hl.

[00177] A adição ao mosto de 100 g/hl de autolisado de levedura e 140 g/hl de ácido tartárico tem sido seguida pela inoculação com a cepa SERIUS, preparada previamente de acordo com o método descrito na seção geral. A fermentação foi conduzida a 13 °C por um período de 19 dias.

[00178] A tabela 10 relata os dados analíticos relativos ao mosto antes da inoculação de levedura e o vinho na conclusão da fermentação.

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Pode-se observar como a cepa produz vantajosamente altas quantidades de ácido málico e glicerol, e, ao mesmo tempo, mostra baixa produção de acidez volátil.

[00179] No que diz respeito ao perfil aromático, na conclusão da fermentação, maior complexidade floral é notável, sinérgica com o perfil de terpenos, em comparação com a levedura comercial.

Tabela 10

	Mosto	Vinho
Acidez total g/l	4,80	6,57
PH	3,47	3,46
Ácido málico g/l	1,09	1,92
Ácido cítrico g/l	0,12	0,2
Ácido láctico g/l	0,10	0,22
Glicose g/l	88,1	0,4
Frutose g/l	106,9	6,5
Ácido succínico g/l	0,07	0,99
Glicerol g/l	3,47	11,45
Ácido acético g/l	0,21	0,09
Etanol %	2,82	14,11

3.2 Teste usando mosto de uva Traminer sem acidificacão de mosto [00180] A levedura SERIUS foi testada com mosto de uva Traminer (fruta branca) de uma vinícola em um tanque de 100 hl. A levedura foi preparada em forma fresca (creme) e usada em uma dose de 20 g/hl. A preparação do inóculo foi realizada conforme descrito anteriormente. Antes da inoculação, 90 g/hl de autolisado de levedura foram adicionados ao mosto. O mosto não foi acidificado com ácido tartárico. A fermentação foi conduzida a 17 °C por um período de 7 dias.

[00181] A tabela 11 relata os dados analíticos relativos ao mosto antes da inoculação de levedura e o vinho na conclusão da fermentação.

[00182] Os resultados obtidos evidenciam a habilidade da cepa SERIUS em produzir altas quantidades de glicerol e baixa acidez volátil. No que diz respeito ao exemplo anterior em mosto de Traminer, em que a produção de ácido málico tem sido observada, neste caso, a produção de ácido málico não é observada. Note-se que o mosto no exemplo 3.1 tinha

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47/53 sido acidificado com ácido tartárico, enquanto o mosto neste exemplo não foi submetido à suplementação com ácido tartárico. Assim, a produção de ácido málico pela cepa SERIUS parece estar correlacionada com a acidificação do ácido tartárico do mosto.

[00183] Análise olfativa confirma os resultados de destaque no exemplo descrito no ponto 3.1.

Tabela 11

	Mosto	Vinho
Acidez total g/l	6,70	6,29
PH	3,26	3,30
Ácido málico g/l	1,24	1,10
Ácido cítrico g/l	0,16	0,27
Ácido láctico g/l		0,23
Glicose g/l	81,5	0,3
Frutose g/l	100,3	5,7
Ácido succínico g/l		0,55
Glicerol g/l	3,54	10,15
Ácido acético g/l	0,08	0,15
Etanol %	2,72	13,10

3.3 Teste usando mosto de uva Garganega com acidificação de mosto [00184] A cepa SERIUS foi testada com mosto de uva Garganega (fruta branca) em uma vinícola em um tanque de 150 hl. A levedura foi preparada em forma fresca (creme) e usada em uma dose de 20 g/hl. A preparação do inóculo foi realizada conforme descrito acima. Antes da inoculação, 120 g/hl de autolisado de levedura e 120 g/hl de ácido tartárico foram adicionados ao mosto. A fermentação foi conduzida a 16 °C por uma duração de 15 dias.

[00185] Os resultados obtidos são relatados na tabela 12. A habilidade da cepa SERIUS em produzir ácido málico, altas quantidades de glicerol e baixa acidez volátil é evidenciada.

[00186] No que diz respeito ao perfil aromático, notas florais marcadas com uma pitada de glicina são relatadas.

Tabela 12

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	Mosto	Vinho
Acidez total g/l	4,72	8,85
PH	3,53	3,27
Ácido málico g/l	0,97	2,70
Ácido cítrico g/l	0,16	0,23
Ácido láctico g/l	0,01	0,24
Glicose g/l	80,6	0,3
Frutose g/l	90,4	9,2
Ácido succínico g/l	0,02	1,36
Glicerol g/l	1,55	10,34
Ácido acético g/l	0,02	0,16
Etanol %	1,21	11,23

3.4 Teste usando mosto de uva Garganega sem acidificacão de mosto [00187] A cepa SERIUS foi testada com mosto de uva Garganega (fruta branca) em uma vinícola em um tanque de 100 hl. A levedura foi preparada em forma fresca (creme) e usada em uma dose de 20 g/hl. A preparação do inóculo foi realizada conforme descrito acima. Antes da inoculação, 120 g/hl de autolisado de levedura foram adicionados ao mosto. O mosto foi acidificado com ácido tartárico. A fermentação foi conduzida a 16 °C por um período de 12 dias.

[00188] A tabela 13 relata os resultados obtidos com o mosto antes da inoculação e do vinho após a conclusão da fermentação.

[00189] Pode-se observar como a cepa tem a habilidade de produzir altas quantidades de glicerol com baixa produção de acidez volátil. Novamente, neste caso, na ausência de acidificação do mosto com ácido tartárico, nenhuma produção de ácido málico é relatada.

[00190] O perfil aromático confirma o observado no exemplo 3.3, a saber, a presença de notas florais marcadas com uma pitada de glicina.

Tabela 13

	Mosto	Vinho
Acidez total g/l	6,36	6,44
PH	3,47	3,59
Ácido málico g/l	2,86	2,64
Ácido cítrico g/l	0,40	0,46
Ácido láctico g/l	0,02	0,13

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Glicose g/l	96,9	0,3
Frutose g/l	105,8	3,7
Ácido succínico g/l	0,08	0,56
Glicerol g/l	1,68	9,74
Ácido acético g/l	0,07	0,25
Etanol %	1,35	13,60

3.5 Teste em mosto de uvas Syrah, Petit Verdot, Cabernet com acidificação de mosto [00191] A cepa SERIUS foi testada com mosto de uva Syrah, Petit Verdot, Cabernet (fruta escura) em uma vinícola em um tanque de 100 hl. A levedura foi preparada em forma fresca (creme) e usada em uma dose de 20 g/hl. A preparação do inóculo foi realizada conforme descrito acima. Antes da inoculação, 150 g/hl de autolisado de levedura e 100 g/hl de ácido tartárico foram adicionados ao mosto. A fermentação foi conduzida a 20 °C por um período de 10 dias.

[00192] A tabela 14 relata os resultados obtidos com o mosto antes da inoculação e do vinho após a conclusão da fermentação. Mais uma vez, neste caso, a habilidade da cepa SERIUS para produzir ácido málico e quantidades elevadas de glicerol é observada.

[00193] No que diz respeito ao perfil aromático, o vinho produzido com a cepa SERIUS tem distintas notas de mirtilo, framboesa e morangosilvestre.

Tabela 14

	Mosto	Vinho
Acidez total g/l	4,85	7,48
pH	3,78	3,74
Ácido málico g/l	1,37	3,70
Ácido cítrico g/l	0,58	0,63
Ácido láctico g/l	0,4	0,44
Glicose g/l	125,7	1,6
Frutose g/l	138,3	16
Ácido succínico g/l	0,04	0,80
Glicerol g/l	2,2	12,46
Ácido acético g/l	0,19	0,15
Etanol %	1,4	16,62

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Exemplo 4 - Híbridos obtidos a partir da levedura de S. bayanus subsp. uvarum SERIUS [00194] A cepa S. bayanus subsp. uvarum SERIUS pode ser usada como cepa mãe a fim de obter híbridos de levedura com características enológicas adicionais e melhoradas. A técnica de hibridação direta foi escolhida e um protocolo padrão de conjugação esporo-esporo com ligeiras modificações tem sido seguido para obtenção de híbridos (Solieri et al., 2008). Inicialmente, um estudo de esporulação foi realizado nas cepas selecionadas para a hibridação. Diversos meios de cultura foram testados para esta finalidade. O estudo de eficiência de viabilidade e esporulação de esporos permitiu a seleção do meio SP (1% acetato de potássio; 0,1% extrato de levedura; 0,05% glicose; 1,8% Agar). O crescimento da cepa em SP em 25 °C por 7-10 dias foi seguido pela digestão parcial da parede celular a fim de permitir a separação subsequente dos esporos a partir de ASCII usando uma agulhado micromanipulador. O ASCII, com a parede celular semidigerida,foi colocado em um lado de uma placa YPD (2% glicose; 2% peptona; 1% extrato de levedura; 2% Agar) e, em seguida, submetidoa micromanipulação. Os esporos das duas cepas mães foram colocados aleatoriamente ao lado um do outro. Observação contínua permitiu a identificação de conjugação bem-sucedida. Após a incubação a 25 °C por 2-3 dias, as colônias selecionadas foram rematizadas em meio YPD. A etapa seguinte foi a estabilização das cepas (também realizada em meio WL). Os híbridos, em seguida, foram confirmados por meio de análise molecular e, em seguida, foram submetidos a testes de fermentação em mosto, juntamente com a análise fenotípica, a fim de verificar suas características fisiológicas e potencial enológico.

Exemplo 5 - Produção de autolisados de levedura começando a partir da cepa de S. bayanus subsp. uvarum SERIUS

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51/53 [00195] A cepa de S. bayanus subsp. uvarum SERIUS pode ser usada para produzir um autolisado de levedura para ser usado como um ativador de fermentação na produção de vinho e outras bebidas alcoólicas. Para este fim, o creme de levedura, preparado conforme descrito acima, é submetido a tratamento térmico adequado (40-60 °C por 12-48 horas). O autolisado obtido pode ser usado como é ou processado posteriormente por meio de filtração/centrifugação/decantação apropriada com o objetivo de separar as fases sólidas ou líquidas para aplicações adequadas subsequentes.

[00196] Consequentemente, com base no acima, a presente invenção alcançou todos os objetivos pré-estabelecidos.

[00197] Em particular, o objetivo de prover uma cepa de levedura da espécie Saccharomyces bayanus subsp. uvarum, equipada com as características tecnológicas e enológicas permitindo uma boa fermentação do mosto, permitindo a produção de um vinho agradável é alcançado.

[00198] Outro objetivo alcançado é o de prover uma cepa que permite a obtenção de um vinho caracterizado por grandes quantidades de ácido málico e glicerol e, ao mesmo tempo, que não produz sulfeto de hidrogênio durante a fermentação alcoólica.

[00199] Outro objetivo alcançado pela presente invenção referese à possibilidade de usar a cepa SERIUS como a cepa mãe para obter leveduras híbridas com novo potencial enológico.

[00200] Um objetivo adicional alcançado diz respeito à possibilidade de usar a cepa formando o objeto da invenção para obter um autolisado de levedura para ser usado como um ativador de fermentação.

[00201] Um objeto, de modo algum final, da invenção alcançada é a otimização de um método aperfeiçoado e rápido para a seleção de cepas de levedura para uso enológico, particularmente leveduras da espécie Saccharomyces bayanus isolado das flores.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum caracterizada pelo fato de que está identificada como SERIUS e depositada no DBVPG com o número de depósito 36P.
2. Cepa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está em forma de creme, forma dessecada, forma liofilizada ou sob a forma de uma pasta.
3. Uso da cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS (DBVPG 36P), conforme qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que se dá como um alimento inoculado na produção de alimentos obtidos através da fermentação alcoólica.
4. Uso da cepa, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o alimento é um vinho e a fermentação alcoólica é um processo de vinificação.
5. Uso da cepa, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vinho é um vinho produzido a partir de uvas selecionadas dentre uvas brancas ou uvas escuras.
6. Uso da cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o vinho contém glicerol e ácido málico, produzido naturalmente pela cepa nas seguintes concentrações: glicerol superior a cerca de 8,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de

9,5 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 10 g/l; ácido málico superior a cerca de 0,5 g/l, preferencialmente superior a cerca de 1 g/l, mais preferencialmente superior a cerca de 2 g/l.
7. Uso da cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS (DBVPG 36P), conforme qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que se dá como probiótico em suplementos alimentares e alimentos.

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8. Alimento inoculado, caracterizado pelo fato de que compreende a cepa de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum identificada como SERIUS e depositada no DBVPG com o número de depósito 36P.
9. Alimento inoculado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito alimento inoculado é um iniciador de vinho.
10. Cultura de levedura de Saccharomyces bayanus subsp. uvarum SERIUS obtida por reprodução ou multiplicação da cepa, conforme a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é adequada para ser usada para um uso conforme qualquer uma das reivindicações de 3 a 7, dita cultura sendo selecionada dentre uma cultura em uma forma fresca líquida, na forma de creme ou pasta ou uma cultura de forma seca dessecada ou liofilizada.
11. Cepa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está na forma de um autolisado.