CN106244474A - 一株高产苯乙醇的酿酒酵母及其在干红葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产苯乙醇的酿酒酵母及其在干红葡萄酒酿造中的应用，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11646。采用本酿酒酵母进行发酵生产干红葡萄酒，酒中的苯乙醇含量高达169.38 mg/L，是商品酿酒酵母RC212酿造干红葡萄酒的2.8倍。本发明提高了干红葡萄酒中的苯乙醇含量，香气浓郁，对于提升干红葡萄酒的质量具有积极作用。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地讲是一株高产苯乙醇的酿酒酵母及其在干红葡萄酒酿造中的应用。
背景技术：
葡萄酒香气成分受多种因素影响，如葡萄品种、原料成熟度、酿造工艺、陈酿条件等。葡萄酒的独特风味是体现葡萄酒个性的关键，其酿造是多种微生物的应用过程，直接影响香气物质的种类和数量，也影响到香气物质的变化过程。因此微生物是形成葡萄酒质量和风格的重要因素，而酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是葡萄酒酿造的主要微生物，是控制葡萄酒质量的灵魂，不同的酿酒酵母可以赋予葡萄酒不同的感官风味。到目前为止，已鉴定出的葡萄酒香气成分超过1000种，被证实的由酵母发酵产生的香气物质成分超过400种。
优良的葡萄酒酵母可以从自然界中分离筛选获得，如葡萄园的土壤、成熟的葡萄浆果、葡萄酒厂区的土壤、发酵醪、葡萄皮渣、酒脚和沉淀物等，相对上述酵母筛选来源而言，葡萄酒厂未添加培养酵母的自然发酵过程更易获得高品质的酿酒酵母，因环境条件已对酵母群进行了初筛，目的性强，从中可以分离获得比其他材料更多的有用菌株。但目前我国葡萄酒生产绝大多数采用国外进口的活性干酵母进行发酵，导致各产区葡萄酒的产地特征不能有效发挥，造成国产葡萄酒质量的趋同化日益严重；除此之外，国内外葡萄酒酿造所用酵母发酵生产的葡萄酒中苯乙醇含量普遍偏低，导致玫瑰香特征香气不明显的问题。苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香，在苹果、杏仁、香蕉、桃子、梨子、草莓、可可、蜂蜜等天然植物中发现，它是葡萄酒等酒精饮料中的重要风味化合物。
发明内容：
本发明的目的是克服上述已有技术的不足，而提供一株高产苯乙醇的酿酒酵母。
本发明的另一目的提供高产苯乙醇的酿酒酵母在干红葡萄酒中的应用。
本发明主要解决现有葡萄酒中苯乙醇含量低而影响产品香气、口感和质量的问题。
本发明的技术方案是：一株高产苯乙醇的酿酒酵母，其特殊之处在于，采摘新疆地区的成熟霞多丽葡萄，破碎后分汁分装无菌容器中进行自然发酵3-5d；将发酵葡萄汁经逐级稀释后涂布筛选培养基上，经28-32℃下培养5 d后，挑取呈奶油色且稍带绿色、表面光滑且不透明的菌株即为所得酵母，经5.8S ITS 序列鉴定，确定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
所用的筛选培养基为WL营养琼脂(Wallerstein laboratory nutrient agar)培养基，其配制方法为：称取酵母粉4 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 50 g，加储液A 40 mL，加储液B1 mL，琼脂粉 20 g，加热融化后冷却室温调pH至5.5，将上述培养基组分在121℃下灭菌15min后，冷却至60℃左右，趁热在超净工作台中加入1ml储液C；储液A：磷酸二氢钾 5.5 g，氯化钾 4.25 g，氯化钙 1.25 g，硫酸镁 1.25 g，定容至400 mL，在4℃冰箱保存；储液B：氯化铁 0.25 g，硫酸锰 0.25 g，定容至100 mL，在4℃冰箱保存；储液C：溴甲酚绿0.44 g溶于10mL水和10mL无水乙醇中，其中10 mL水（带瓶）要提前灭菌。
本发明的高产苯乙醇的酿酒酵母，菌株代号为XXF8，该菌株已于2015年11月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址：北京市朝阳区大屯路3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No. 11646；建议分类命名为：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
本发明的高产苯乙醇的酿酒酵母在干红葡萄酒酿制中的应用，以高产苯乙醇的酿酒酵母XXF8为发酵酵母，按常规法酿造干红葡萄酒，具有高苯乙醇含量、香气浓郁的特点；具体方法为：以适合干红葡萄酒酿造的葡萄品种为原料，机械破碎后的带皮葡萄汁，加入酿酒酵母XXF8为发酵剂，发酵过程中检测酒精度和还原糖量，待含糖量低于4 g/L时终止发酵。
本发明所述的一株高产苯乙醇的酿酒酵母及其在干红葡萄酒酿造中的应用与已有技术相比具有突出的实质性特点和显著进步，通过选择性筛选方法，分离出一株高产苯乙醇的酿酒酵母，从而能够在葡萄酒的发酵生产中依靠酵母菌自身高产苯乙醇，生产的干红葡萄酒中的苯乙醇含量高达169.38mg/L，比常规酿酒酵母菌株酿造的干红葡萄酒提高2.8倍，酿造的葡萄酒香气浓郁，对于提升干红葡萄酒的产品质量具有积极作用。
具体实施方式：
为了更好地理解与实施，下面结合实施例详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。
实施例1，酿酒酵母XXF8的筛选、菌属鉴定与发酵特性：
采摘中国新疆地区的成熟霞多丽葡萄，破碎后分汁分装无菌容器中进行自然发酵3-5d；取1ml发酵葡萄汁经逐级稀释后涂布筛选培养基上，经28-32℃下培养5d，选取呈奶油色且稍带绿色、表面光滑且不透明的菌株，即有典型酿酒酵母菌落特征的单菌落，重复划线分离多次，获得纯培养并甘油管保藏（-20℃），即得酵母XXF8；所用的筛选培养基为WL营养琼脂(Wallerstein laboratory nutrient agar)培养基，其配制方法为：称取酵母粉4 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 50 g，加储液A 40 mL，加储液B 1 mL，琼脂粉 20 g，加热融化后冷却室温调pH至5.5，将上述培养基组分在121℃下灭菌15 min后，冷却至60℃左右，趁热在超净工作台中加入1ml储液C；储液A：磷酸二氢钾 5.5 g，氯化钾 4.25 g，氯化钙 1.25 g，硫酸镁1.25 g，定容至400 mL，在4℃冰箱保存；储液B：氯化铁 0.25 g，硫酸锰 0.25 g，定容至100mL，在4℃冰箱保存；储液C：溴甲酚绿0.44 g溶于10mL水和10mL无水乙醇中，其中10 mL水（带瓶）要提前灭菌。
提取菌株DNA，进行PCR，PCR产物电泳条带，切割所需 DNA 目的条带，纯化测序。以ITS1-TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4-TCCTCCGCTTATTGATATGC通用引物，PCR循环条件：94℃预变性4min，94℃45秒，55℃45秒，72℃1min循环30次，72℃10 min修复延伸，4℃终止反应；将测序结果与NCBI数据库中的已有序列进行比对，确认菌株XXF8为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
采用改进的YEPD培养基（葡萄糖220 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉 5g/L）作为初始培养基，杜氏管法考察发酵特性；其中酒精耐受力测定中乙醇终浓度分别为10%、13%、16%、19%，酸度耐受力测定中柠檬酸终浓度分别为5g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L，SO2耐受力测定中终浓度分别为60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，耐受高糖能力测定中葡萄糖终浓度分别为220g/L、300g/L、400g/L、500g/L，并与商品化酿酒酵母D254和RC212（D254和RC212为国内干红葡萄酒发酵常用的进口商品酿酒酵母）做对照。
结果表明，本发明的菌株XXF8与商品化酿酒酵母相比具有优良的发酵特性，所有测试条件下均能够正常启动发酵，故酿酒酵母XXF8具备酿造高品质葡萄酒潜力。
实施例2，酿酒酵母XXF8酿造生产赤霞珠干红葡萄酒：
所用菌种：高产苯乙醇的酿酒酵母XXF8、商品化进口活性酿酒酵母D254和RC212。
酿酒酵母菌种制备：挑取斜面保藏菌种一环，接入装有200ml菌种制备培养基的500ml三角烧瓶中，置于28℃下培养48h；菌种制备培养基：葡萄糖100 g，蛋白胨20 g，酵母粉 10g，加水至1000ml，pH自然，115℃下灭菌20min；活化种子液采用冷冻离心机在10000r/min和6℃下离心4min收集菌体，离心完毕后菌体用无菌水重悬浮，洗涤离心2次，收集菌体备用。
酿造赤霞珠干红葡萄酒：成熟的赤霞珠酿酒葡萄榨汁破碎，装入10L玻璃容器中，装液量为容器体积的3/4，添加SO2至最终浓度为60mg/L；按照种子培养液体积的10%接入离心洗涤后的菌体，20℃下发酵5天，定期测定CO2失重、残糖量和酒精度，发酵完毕后（还原糖量小于4g/L）采用气相色谱法测定苯乙醇等香气物质的含量，其中酿酒酵母XXF8发酵样苯乙醇含量高达169.38 mg/L，而D254和RC212的发酵样苯乙醇含量分别为72.71mg/L和60.56mg/L。
发酵新酒专家感官品评：评酒专家由9名从事葡萄酒研究多年的专家组成，其中5名来自企业的酿酒工程师组成，具有较高的权威性和合理性。由专家品评结果可知，专家组一致认为本发明的酿酒酵母XXF8发酵酒样评价比较高，其主要突出点在于XXF8酿造的干红葡萄酒香气浓郁、口感略复杂，结构感好于D254和RC212的发酵酒样。
实施例3，酿酒酵母XXF8酿造生产蛇龙珠干红葡萄酒：
所用菌种：高产苯乙醇的酿酒酵母XXF8、商品化进口活性酿酒酵母D254和RC212。
酿酒酵母菌种制备：挑取斜面保藏菌种一环，接入装有200ml菌种制备培养基的500ml三角烧瓶中，置于28℃下培养48h。菌种制备培养基：葡萄糖100 g，蛋白胨20 g，酵母粉 10g，加水至1000ml，pH自然，115℃下灭菌20min。活化种子液采用冷冻离心机在10000r/min和6℃下离心4min收集菌体，离心完毕后菌体用无菌水重悬浮，洗涤离心2次，收集菌体备用。
酿造蛇龙珠干红葡萄酒：成熟的蛇龙珠酿酒葡萄榨汁破碎，装入10L玻璃容器中，装液量为容器体积的3/4，添加SO2至最终浓度为60mg/L。按照种子培养液体积的6%接入离心洗涤后的菌体，20℃下发酵5天，定期测定CO2失重、残糖量和酒精度，发酵完毕后（还原糖量小于4g/L）采用气相色谱法测定苯乙醇等香气物质的含量，其中酿酒酵母XXF8发酵样苯乙醇含量高达142.15 mg/L，而D254和RC212的发酵样苯乙醇含量分别为65.39.71mg/L和56.82 mg/L。
发酵新酒专家感官品评：评酒专家由9名从事葡萄酒研究多年的专家组成，其中5名来自企业的酿酒工程师组成，具有较高的权威性和合理性。由专家品评结果可知，专家组一致认为本发明的酿酒酵母XXF8发酵酒样评价比较高，其主要突出点在于XXF8酿造的干红葡萄酒香气浓郁、口感复杂，略偏酸，结构感好于D254和RC212的发酵酒样。
本发明的酿酒酵母XXF8还适用于梅乐、西拉、黑比诺等品种的干红葡萄酒生产。
Claims (2)
1. 一株高产苯乙醇的酿酒酵母，其特征在于，菌株代号为XXF8，现保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11646。
2.权利要求1所述的高产苯乙醇的酿酒酵母在干红葡萄酒酿造中的应用，其特征在于，以酿酒酵母XXF8为发酵酵母，常规法酿造具有高苯乙醇含量、香气浓郁的干红葡萄酒。
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