CN106753994A - 一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物材料及其应用技术领域，为解决现有白酒中杂醇油含量较高，异戊醇含量较高，危及人体健康的问题，提供一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法。包括高产酯土著生香酵母的分离、单菌株活化，单一菌株或联合菌株与大曲进行酒精发酵，测定酒精度。菌株分离自传统山西老陈醋大曲，具有独特性，表现出极强的耐高温、耐酸、耐乙醇、耐高渗性能；实际生产中无论是双菌种强化，还是单菌种发酵，均极显著地降低了白酒中异戊醇的含量，酯类中除丁酸乙酯和乙酸异丁酯外，其他酯类含量均有不同程度的提高。酒精发酵液中的各种风味物质在总风味物质的比例发生了变化，因而呈现出不同的感官品质。

Description

一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒 度、降低异戊醇含量的方法

技术领域

本发明属于生物材料及其应用技术领域，具体涉及一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法。

背景技术

中国不同地区均拥有各自当地的食醋类型。山西老陈醋是山西省的代表性产品，有3000多年的生产历史，由于其上好而独特的风味及保健功能，被誉为中国四大名醋之首。山西老陈醋酿造工艺十分复杂，被列为国家非物质文化遗产。其独特品质也与当地的水、气候、土壤、生态系统等关系密切，因为这些因素决定了大曲的品质，在山西老陈醋的酿造过程中，大曲既是糖化剂，也是酒化发酵剂，是决定山西老陈醋产量及品质的关键因素，越来越受到研究者关注。

大曲，又称砖曲，主要以大麦、豌豆为原料，经粉碎加水搅拌，踩压成曲醅，通过自然接种的方法让各种微生物自然竞争生长而制成。经过长期的自然驯化及山西老陈醋独特工艺条件的驱使，老陈醋大曲形成了一个彼此共生、依次消长和代谢互补的特定微生物群落。酵母菌作为大曲中的主要功能微生物之一，在整个发酵阶段都起着重要作用，其作用包括酒化、酯化、提供生香前体物质及风味物质等。在酿造过程中起主要作用的有产酒酵母菌和生香酵母。产酒酵母发酵糖类生成乙醇，其发酵力强弱决定山西老陈醋的产量。在食醋生产的酒精发酵阶段，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是起主导作用的优势酵母菌，占了酵母总数的95%。尽管生香酵母数量极少，但可以形成多种芳香物质，在很大程度上决定了食醋、酒精饮料及其他发酵制品的风味和品质。

生香酵母，又称产酯酵母，狭义上讲是指在酯酶作用下催化酸类与醇类发生反应生成酯类物质的酵母菌，广义上讲是指在代谢过程中可以合成芳香气味物质的酵母菌。这些芳香物质或特别的风味物质将对酿造产品的总体风味产生积极影响，使产品的风味特征明显改善，并且不同种属的酵母菌所产生的风味物质的种类和数量也各不相同。生香酵母主要属于汉逊酵母属、球拟酵母属、假丝酵母属、毕赤氏酵母属、鲁氏接合酵母等。近些年来，生香酵母的潜力才引起人们的重视并被开发利用。山西老陈醋的酿造过程有关生香酵母的研究也很少，还有许多问题亟待解决。

杂醇油是三个碳以上的一元醇类物质的总称，尽管具有呈香作用，但白酒中如果杂醇油含量过高，对人体有毒害作用，它对人体的中毒和麻醉作用比乙醇强，能使神经系统充血，使人感觉头痛。杂醇油的主要成分中以异戊醇、异丁醇毒性比较高，不仅对人体有害，而且还给酒的风味带来邪杂昧。杂醇油是中国白酒苦味或涩味的主要来源之一，同时杂醇油也是造成我国白酒出现白色浑浊的原因之一。白酒中杂醇油含量最大的是异戊醇、异丁醇、正丙醇等。异戊醇通常是杂醇油中含量最多，研究的也最多的一种成份，一般要占杂醇油总量的45％以上，甚至高达65％以上。当饮料酒中异戊醇含量过高时，可刺激饮用者的眼睛和呼吸道，使人头部充血、头疼、眩晕、恶心、呕吐、腹泻，是导致人醉酒上头的主要原因之一。国标规定，白酒中的杂醇油含量不得超过0.20g/100ml(以异丁醇，异戊醇计)。

发明内容

本发明为了解决现有酵母菌耐乙醇能力较弱，其发酵活力就会受到严重影响，导致原料中的发酵性糖无法转化成酒精，从而降低出酒率，且白酒中杂醇油含量较高，异戊醇含量较高，危及人体健康的问题，提供了一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法，包括如下步骤：

（1）高产酯土著生香酵母的分离：采集传统山西老陈醋工艺发酵第3天和第6天的酒醅，分别利用孟加拉红选择培养基通过10倍递减梯度稀释法分离酵母菌，取梯度稀释样品液各100uL涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h，选择菌落特征明显的单菌落在孟加拉红选择培养基上进一步划线纯化培养2~3次，纯化后转入YEPD固体斜面，4℃保存，备用；经过了两批次的分离纯化实验，获得酵母菌，所得到的酵母菌通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、26s rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，以及产酒、产酯性能、环境耐受性检测，获得高产酯土著生香酵母：毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14，乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18；

（2）高产酯土著生香酵母单菌株培养：Y14、Y18分别以2%的接种量接种在YEPD培养基中30℃培养20h,将菌种用冷却至室温的无菌水稀释至10⁷/ml；

（3）高产酯土著生香酵母菌与大曲共同酒精发酵：采用稀释至10⁷/ml的高产酯土著生香酵母Y14或Y18单一菌株或Y14和Y18的联合菌株与大曲共同进行酒精发酵，对照为大曲酿酒，每个样品重复三次；强化菌株的添加比例分别为25%(ml/g)。

所述毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形、卵形，大小为4.6-6.5×3.8-6.5mm.麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅白灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐；玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝；rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，测序引物为：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G；检测结果为：Genbank序列登录号为KP027538,其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；将Y14菌株活化，接种于醋酸钠产孢培养基平板上，25℃培养4~5d，利用芽孢染色法染色，高倍镜观察子囊孢子的形状及孢子数目，Y14可形成子囊孢子，用孔雀绿染色，子囊孢子呈现蓝色、绿色或无色；所述毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14保藏编号为：CGMCC NO.12407，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期是201６年４月２８日。

所述乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞卵形、腊肠形，大小为4.0-7.2×3.0-5.2mm.麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐；在玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝；rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，测序引物为：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAAAAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G；检测结果为：Genbank序列登录号为KP339953,其碱基序列如SEQ ID NO：2所示；将Y18菌株活化，接种于醋酸钠产孢培养基平板上，25℃培养4~5d，利用芽孢染色法染色，高倍镜观察子囊孢子的形状及孢子数目，Y18不形成子囊和子囊孢子；所述乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18保藏编号为：CGMCC NO. 12409，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期是201６年４月２８日。

本发明所述Y14和Y18菌株分离自传统的山西老陈醋大曲中，经中科院微生物研究所鉴定为：Pichia manshurica（Y14）和Candida ethanolica（乙醇假丝酵母，Y18）。

参考文献（Bhaskar B., Zareena B.,Sisinthy S.,2008.Pichiagarciniaesp.nov.,isolated from a rotten mangosteen fruit (Garcinia mangostanaL., Clusiaceae).International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology.58,2665–2669.）；（Heide-Marie Daniel, Gino Vrancken, Jemmy F.Takrama,Nicholas Camu, Paul De Vos, Luc De Vuyst, 2009.Yeast diversity ofGhanaian cocoa bean heap fermentations. FEMS Yeast Res.9,774–783.）与已报道上述文献对比，Y14和Y18虽然分别鉴定为Pichia manshurica 和 Candida ethanolica,在许多生理特性上与报道的同种酵母表现不同，P. manshurica NRRL Y-27978^T (BhaskarBhadra, et al. 2008)不能同化硝酸盐和亚硝酸盐，水解尿素和发酵D-葡萄糖，而Y14具有上述能力。从发酵可可豆中分离出的Pichia manshurica(Heide-Marie Daniel, et al.2009)可以同化蔗糖，而Y14不能；这些差异可被认为是种内株间差异。

由于Y14和Y18菌株分离自传统的山西老陈醋大曲中，在发酵实践中经历了长达3000年的选择和进化，必然表现出能适应山西食醋酿造所用的各种原辅料及发酵环境的相应特性，菌种具有独特性。经研究表明，其产酯能力甚至极显著地高于商品化的安琪生香酵母，表现出极强的耐高温、耐酸、耐乙醇、耐高渗性能；更为重要的是用大曲土著微生物强化大曲，克服了在酿造过程中菌种不相容的问题，如果使用外源的商品化的非大曲微生物强化大曲，不仅收不到应有的效果，甚至会严重影响白酒的品质。在实际生产中，按本发明所述方法强化大曲，无论是Y14+Y18双菌种强化，还是Y14和Y18单菌种强化，均可极显著地提高酒精发酵液中的乙醇含量，并且异戊醇含量显著降低。，酒精发酵液中的各种风味物质在总风味物质的比例发生了变化，因而呈现出不同的感官品质。

附图说明

图1为Y14（Pichia manshurica）麦芽汁液体培养3天后菌体形态观察结果图；图2为Y18（Candida ethanolica）麦芽汁液体培养3天后菌体形态观察结果图；图3为Y2（Candida ethanolica）麦芽汁液体培养3天后菌体形态观察结果图；图4为Y2和Y18（Candida ethanolica）经小室培养形成的假菌丝；图5为Y14（Pichia manshurica）形成的子囊以及子囊孢子显微图；图6为分离自山西老陈醋大曲中的各株酵母菌的产酯量结果图；图7-图10为毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14和乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y2、Y18的相关环境耐受性分析结果图；图11为毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14和乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y2、Y18强化大曲后酒精发酵液的酒精度测定结果图；图12为Y2强化酒精发酵液的HS-GC-MS 6-40min离子图；图13为菌株Y14强化酒精发酵液的的HS-GC-MS 6-40min的离子图；图14为菌株Y18强化酒精发酵液的的HS-GC-MS 6-40min的离子图；图15为对照大曲酒精发酵液的的HS-GC-MS 6-40min的离子图。

具体实施方式

实施例1：一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法，包括如下步骤：

1.高产酯土著生香酵母的分离：采集传统山西老陈醋工艺发酵第三天和第六天的酒醅，分别利用孟加拉红选择培养基通过10倍递减梯度稀释法分离其中的酵母菌，取梯度稀释样品液各100uL涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h，选择菌落特征明显的单菌落在孟加拉红选择培养基上进一步划线纯化培养2~3次，纯化后转入YEPD固体斜面，4℃保存，备用；结果表明：第三天的样品，平板上布满了霉菌菌丝，同时还可看到大量的酵母菌菌落，但这些酵母菌的菌落特征极为相似；

经过了两批次的分离纯化实验，获得15株酵母菌，所得到的酵母菌通过菌落形态观察及镜检最后保留并合并为6株；第六天的样品，平板上完全没有霉菌，并且酵母菌数量激增，且种类较第3天的样品更为丰富；第三天样品中大量存在的绝对优势酵母菌在第六天的样品中同样处于优势地位；经过了两批次的试验，分离纯化了研究了29株酵母菌，最后保留并合并为19株，分别编号为Y1~Y19；通过理化特征检测、rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，以及产酒、产酯性能、环境耐受性检测，最终获得高产酯土著生香酵母，根据各菌株的培养特征、细胞显微形态特征、生理生化特征以及26s rRNA D1/D2区序列等实验数据综合分析，经中科院微生物研究所鉴定为：毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14，乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y2和Y18；

1.1毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14的鉴定：

（1）毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14显微形态特征：

麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，显微形态见图1，细胞球形、卵形，大小为（4.6-6.5）×（3.8-6.5）mm。麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅白灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐。玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝。

（2）毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14生理生化检测结果见表1：

表1：Y14（Pichia manshurica）理化特征

（3）毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14的rRNA 基因D1/D2区序列测定结果

测序引物为：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAGACG G。测定结果如下：Genbank序列登录号为KP027538，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，即：

5¢-AAATCGTGTTTCGGCACGAGTTGTAGAGTGTAGGCGGGAGTCTCTGTGGAGCGCGGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCTGAGAGGGTGAGAGCCCCGTAGGGTGCTGCGCGAAGCTTTTGAGGCCCTGCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCCAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGGGGTGCGCACCGCTGTCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCCCTCTGGGCCAGCATCGGTTCCTGCTGCGGGAGAAGGGGCTCCGGAAAGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCGGGGCCAGATGCCGCGTGTGGGGACCGAGGACTGCGGCTTCTGTCTCGGATGCTGGCATAACGGCGCAATACCGCCCGTCTTGAA-3¢。

1.2乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18的鉴定：

（1）乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18显微形态特征：

麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，显微形态见图2，细胞卵形、腊肠形，大小为（4.0-7.2）×（3.0-5.2）mm。麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐。玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝。

（2）乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18生理生化检测结果见表2：

表2:Y18（Candida ethanolica）理化特征

（3）乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18的rRNA 基因D1/D2区序列测定：

测序引物为：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAGACG G。测定结果如下：Genbank序列登录号为KP339953，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示，即：

5¢-AAGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAAATCGTGTTTCGGCACGAGTTGTAGAGTGTAGGCTGGAGTCTCTGTGGAGCGCGGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCTGAGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGGTGCTGCGCGAAGCTTTGAGGCCCTGCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCCCGACATGGGGAGTGCGCACCGCTGTCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCTCTCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTGCGAGAGAAGTGGCGCCGGAAAGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCGGTGCCGGATGTCGCGTGCGGGGACCGAGGGCTGCGACATCTGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCTTGA-3¢。

1.3乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y2的鉴定：

（1）乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y2显微形态特征：

麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，显微形态见图3，细胞卵形、腊肠形，大小为（4.5-12）×（3.8-5.5）mm.，麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐。玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝。与Y18基本相同，只是菌体比Y18要长。

（2）乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y2生理生化检测结果见表3：

由表2和表3可知，Y2与Y18的不同之处是Y18可以同化甘油，而Y2不能。

表3 Y2（Pichia manshurica）理化特征

（3）乙醇假丝酵母(Candida ethonolica)Y2的26s rRNA 基因D1/D2区序列测定：

引物 D1D2区扩增引物为 NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG和NL4：GGT CCGTGT TTC AAG ACG G。ITS扩增引物为:ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC和ITS5：GGA AGTAAA AGT CGT AAC AAG C。

Y2（Candida ethanolica）26s rDNA D1D2 区序列如SEQ ID NO：3所示，即：

5¢-AAATCGTGTTTCGGCACGAGTTGTAGAGTGTAGGCGGGAGTCTCTGTGGAGCGCGGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCTGAGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGGTGCTGCGCGAAGCTTTGAGGCCCTGCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCCCGACATGGGGAGTGCGCACCGCTGTCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCTCTCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTGCGAGAGAAGTGGCGCCGGAAAGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCGGTGCCGGATGTCGCGTGCGGGGACCGAGGGCTGCGACATCTGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCTTGAACC-3¢。

Y2（Candida ethanolica）26s rDNA ITS 序列如SEQ ID NO：4所示，即：

5¢-ATCTGAGGTCGAGCTCATAGTGCTCGGAGACCCCAAGCGTCCTGTTCTAGTTCGCTCGTGGCCTCGTTTCTTTTCGGCGGGGCCGTGGCCGGGCCAGCTCTGCGCAACTCTCGTCTTGCAAGAAGGAAACGACGCTCAGACAGGCATGCCCGCCGGAATGCCGACGGGCGCAATGTGCGTTCAAGAACTCGATGATTCACGATGGCTGCAATTCACACTAGGTATCGCATTTCGCTGCGCTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGTGTTAAAATAAAAACTCCTGAACTAGTATACGTGTTTGTGTGTTGTGTGCGCTCACGCAGTGTGGAACAATAATCACAGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACtTTTTTACTTCCA-3¢。

1.4假菌丝形态观察以及子囊孢子形态观察：

有些酵母菌繁殖时形成假菌丝，若用接种环挑取使菌丝断裂，无法看到假菌丝的完整形态，因此采用小室培养为酵母菌生长繁殖提供一个相对独立的环境，以便随时观察酵母菌假菌丝形成情况。Y2和Y18（Candida ethanolica）经小室培养形成的假菌丝见图4；将待观察菌株活化，接种于醋酸钠产孢培养基平板上，25℃培养4~5d，利用芽孢染色法染色，于高倍镜下观察子囊孢子的形状及孢子数目。结果表明乙醇假丝酵母Y2和Y18不形成子囊和子囊孢子。Y14虽可形成子囊孢子，见图5，但用孔雀绿染色时很不容易染色，子囊孢子呈现蓝色、绿色或无色。

1.5毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14和乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y2/Y18的产酒与产酯性能检测：

（1）产酒性能：采用YEPD培养基杜氏管产气试验，结果表明，Y14（Pichia manshurica）和Y2/Y18（Candida ethanolica）分别培养48h菌株仍无产气现象，说明其发酵能力较弱。而发酵力强的菌株培养12h便开始产气。

（2）产酯性能：将山西老陈醋大曲中分离的19株酵母菌（Y1~Y19），对照菌株为Y20（安琪高活性酿酒干酵母）及Y21（安琪生香干酵母）在YEPD培养基中活化，以3%的接种量接入含有80ml产酯发酵液的150mL三角瓶中，28℃静置培养7d，按GB19777-2005规定的碱夜皂化法测定测定发酵液中总酯含量。实验结果见图6。与对照安琪生香干酵母Y21相比，菌株Y2、Y5、Y6、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y18产酯能力较强，其余菌株产酯能力较弱。产酯能力最高的三株菌为Y14、Y2和Y18，其产酯量分别为36.05g/L、33.75g/L、33.47g/L。差异显著性分析结果见表4，11株高产酯酵母产酯量均极显著地高于安琪生香酵母，但Y2与Y18差异不显著。

表4：酵母菌产酯量差异性分析

1.6毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14和乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y2/Y18的相关环境耐受性分析：酵母菌的性能分析主要包括酵母菌对温度、pH、酒精度、糖度等因素的耐受性，接种活化酵母菌菌悬液0.3mL于含10 mL YEPD培养基试管中,除耐高温测定，均在30℃培养3d，将培养液4000r/min离心10min，倒掉上清液，测菌体湿重。结果见图7-图10。

从图中可以看出，在温度高达40℃时Y14和Y18依然生长良好，但随着温度继续升高，在50℃时，其生长明显受到抑制，可能由于温度升高至一定程度时酶活力受到抑制，使细胞新陈代谢减弱，菌体生长缓慢，而Y2在40℃虽然还有生长现象，但生长情况不及Y14和Y18。酵母菌在相对低的温度下生长较强，这与山西老陈醋实际生产中低温酒精发酵环境的长期驯化有着直接的关系。Y14和Y18这两株产酯酵母在35℃、40℃的温度下依然可以生长，则可以在醋酸发酵阶段继续作用生成香气成分，进而提高醋的品质。

当pH由起始值4降低到2时，Y18的生长量反而增加，Y2和Y14的生长量仅略有减少，但pH1.5时，菌体的生长大受抑制。这些产酯酵母可耐受醋酸发酵过程中酸性环境，则可利用醋酸发酵形成的多种有机酸生成更多的酯类物质，改善醋的风味，从而提高醋的品质。

在所有分离的酵母菌菌株中，Y18的耐乙醇能力最强。pH对Y2和Y14生长的影响趋势基本相同。3菌株在乙醇浓度8%时生长很旺盛，并且均可耐受10%的乙醇浓度，12%的乙醇浓度使生长完全抑制。

40%的糖浓度对Y14和Y18的生长毫无影响，两菌株在50%时生长受到抑制，但Y14在60%时，依然保持50%时的生长量，Y18则迅速降低。而超过30%的糖浓度显著抑制Y2菌株的生长。

研究表明，生理耐性优良的酵母菌在实际生产中对提高原料利用率、降低生产成本，提高产品的风味等都有极佳的效果。优良酵母菌通常具备以下生理耐性：

耐高温：传统菌种的最适发酵温度一般为28~35℃，当环境温度逐渐升高时，其发酵能力随之减弱。耐高温酵母菌在较高温度下可正常发酵，其合成酶活性比适温酵母菌的酶活更高。在食醋生产中，原料的糖化需高温进行，如果酵母菌耐高温，则可以边糖化边发酵，加快生产速度，缩短发酵周期。

耐乙醇：虽然乙醇是酵母菌厌氧发酵的产物，但其浓度积累到一定程度对其自身具有抑制作用。在酒精发酵后期，发酵醪液中酒精浓度较高，若酵母菌耐乙醇能力较弱，其发酵活力就会受到严重影响，导致原料中的发酵性糖无法转化成酒精，从而降低出酒率。耐乙醇性能好的酵母则可以发酵彻底，提高原料利用率，增加出品率。

耐酸性：山西老陈醋在酒精发酵结束转醋酸发酵的过程中要添加辅料，醋醅中会产生一些新增还原糖，在醋醅的酸度还没有显著提高的情况下，若酵母菌有一定的耐酸性，新增的还原糖就可被利用生成一定量的酒精和酯类物质，从而增加食醋的产量和香气成分。

耐高糖：酒精发酵过程中发酵醪的糖度过高，则会引起细胞失水，破坏细胞结构，导致体内酶活丧失，从而抑制其生长和发酵。因此，具有一定的耐高渗能力是良好发酵性能酵母菌所必备的性能。

Y2和Y18尽管均被鉴定为乙醇假丝酵母，但在环境耐受性表型却明显不同,Y2明显不耐高温以及高糖环境。综合各菌株的环境耐受性能可知，这三个菌株都可耐受醋实际生产发酵过程中的各种环境，也就意味它们可以在山西老陈醋整个发酵过程中发挥作用，将进一步促进双边乃至多边发酵工艺，缩短发酵周期。研究理论表明，发酵过程中有机酸的存在与相应的酯类生成有直接的关系，因此产酯酵母在醋酸发酵阶段继续作用，不仅可以提高酯的含量，还可丰富酯类物质的种类，从而改善醋的风味，提高醋的品质。

2.高产酯土著生香酵母单菌株活化：Y14、Y18分别以2%的接种量接种在YEPD培养基中30℃培养20h,将菌种用冷却至室温的无菌水稀释至10⁷/ml；

3.高产酯酵母单菌株与大曲共同酒精发酵：将高产酯酵母Y2、Y14、Y18单菌株与大曲共同进行酒精发酵，对照为大曲酿酒。每个样品重复三次。

原料预处理：称取80g玉米粉，加水调整湿度为60%，于烧杯中进行润料，浸润24h后蒸料1~1.5h，确保蒸料熟而不粘，不夹硬心，将熟料冷却至室温，准备酒精发酵。

发酵所需各种物质的准备：以原料（玉米）用量（g)为基准，无菌水、大曲、强化菌株的添加比例分别为：300%（g/g)、25%（g/g)，25%(ml/g)、糖化酶用量为300u/g原料。糖化酶、用于强化的酵母菌需提前活化，糖化酶活化：称取一定量的糖化酶于小烧杯中，加5倍水搅拌均与，浸泡15min；待强化酵母菌活化：将强化酵母菌菌株接种于YEPD液体培养基中，于30℃培养20h，经显微镜直接计数后用生理盐水稀释至10⁷/ml,备用。

酒精发酵：以80g玉米粉为原料，将按上述比例配制发酵基质、待强化酵母菌菌悬液20ml全部置于500ml无菌三角瓶中，搅拌均匀，用棉塞封口，置于25℃培养箱进行发酵，发酵开始后的第二天与第三天分别于超净工作台中搅拌发酵醪一次，在第二次搅拌后改为塑料膜封口，静置发酵6d，于第七天结束酒精发酵。

待酒精发酵结束后，测定其酒精度，同时组织相关专业人员对各发酵液的香气进行感官评价。

3.1高产酯酵母强化酒精发酵酒度测定结果：

Y2、Y14、Y18三株高产酯酵母菌分别与大曲共同酒精发酵，发酵液酒精度测定结果如图11所示，酒精度依次分别为：Y2（9.65%）>Y14（9.59%）>Y18（9.51%）,而未经强化的对照组其酒精度为9.42%，由此可见3株高产酯酵母强化发酵在一定程度上提高了发酵液的酒度。差异显著性分析结果表明，三株高产酯酵母强化与对照相比以及三株高产酯酵母强化组之间差异均为极显著，表明高产酯酵母与大曲共发酵使产酒量显著提高。

3.2酒精发酵液香气感官评价：

选10名受过食品感官评价训练的评价员（本专业研究生和老师组成）对高产酯酵母强化酒精发酵液的香气评价结果如表6所示。通过感官评价分析，强化发酵液与大曲发酵液相比，香气宜人。

表5:高产酯酵母强化酒精发酵液香气感官评价

3.3发酵液中挥发性香气成分的测定：高产酯酵母与大曲共同酒精发酵，利用HS-GC-MS对发酵液进行半定量分析，检测发酵液中的主要挥发性香气成分。将重复三次的发酵液混合均匀，4℃ 4000r/min冷冻离心15min，留取上清液，混匀取样10ml置于20ml顶空进样瓶中，加3g NaCl溶解，采用顶空自动进样，通过GC-MS测定发酵液中香气成分。HS-GC-MS测定条件如下：

1）顶空进样器条件：振荡温度70℃，振荡时间30min，进样量2ml。

2）GC分析条件：色谱柱为TR-5MS（30m×0.25mm，0.25um）。进样口温度250℃，载气He，流速1mL/min。进样量2μL，不分流进样。升温程序：起始温度35℃，保持8min，以5℃/min的速度升温至230℃，保持5min。

3）MS条件：电子轰击（EI）离子源，电子能量70eV，离子源温度250℃，传输线温度280℃，质量扫描范围m/z：30～350。

检测结果见图12-15，如图所示，四个样品总离子流图大致相同，主要是因为高产酯酵母源自大曲且又与大曲共发酵，强化发酵液中的主要成分种类相同，且发酵液中乙醇含量较高，导致其他峰较弱；由6~40min的离子流图可以看出发酵液中微量成分的峰，物质种类基本相同，但其在个发酵液中所占组分各不相同。

发酵液中酯类成分的GC-MS分析结果见表6。

表6：发酵液中酯类成分的GC-MS分析结果

由表6可以看出：Y2菌株发酵液中的挥发性香气成分经质谱分析出34种物质，其中醇类6种，占面积的62.12%；酯类18种，占面积的18.75%；醛类7种，占面积的0.43%；酮类1种，占面积的0.01%；醚类1种，占面积的2.3%；呋喃1种，占面积的0.155%；其它化合物占面积的18.7%。

Y14菌株发酵液中的挥发性香气成分经质谱分析出34种物质，其中醇类6种，占面积的63.48%；酯类16种，占面积的26.12%；醛类9种，占面积的0.48%；酮类1种，占面积的0.004%、醚类1种，占面积的2.86%；呋喃1 种，占面积的0.140%；其他化合物占面积的9.92%。

Y18菌株发酵液中的挥发性香气成分经质谱分析出33种物质，其中醇类7种，占面积的61.85%；酯类18种，占面积的18.31%；醛类7种，占面积的0.74%；呋喃1种，占面积的0.208%；其他化合物占面积的19.1%。

原大曲发酵液中的挥发性香气成分经质谱分析出28种物质，其中醇类5种，占面积的60.74%；酯类15种，占面积的12.92%；醛类7种，占面积的0.62%；呋喃1种，占面积的0.168%；其他化合物占面积的25.72%。上述其他化合物主要包括烃类、含氮化合物等。

三株菌的发酵液与对照相比分别多出8、7、6种物质，但这些物质都是微量。主要的挥发性香气成分种类基本相同，醇类主要有乙醇、异戊醇等，酯类主要包括乙酸乙酯、己酸乙酯、棕榈酸乙酯等，主要成分种类基本相同可能是因为这三高产酯的株菌均源自于大曲，同时与大曲共发酵。

杂醇油是三个碳以上的一元醇类物质的总称，尽管具有呈香作用，但白酒中如果杂醇油含量过高，对人体有毒窖作用，它对人体的中毒和麻醉作用比乙醇强，能使神经系统充血，使人感觉头痛。杂醇油的主要成份中以异戊醇、异丁醇毒性比较高，不仅对人体有害，而且还给酒的风味带来邪杂昧。杂醇油是中国白酒苦味或涩味的主要来源之一，同时杂醇油也是造成我国白酒出现白色浑浊的原因之一。白酒中杂醇油含量最大的是异戊醇、异丁醇、正丙醇等。异戊醇通常是杂醇油中含量最多，研究的也最多的一种成份，一般要占杂醇油总量的45％以上，甚至高达65％以上。当饮料酒中异戊醇含量过高时，可刺激饮用者的眼睛和呼吸道，使人头部充血、头疼、眩晕、恶心、呕吐、腹泻，是导致人醉酒上头的主要原因之一。国标规定，白酒中的杂醇油含量不得超过0.20g/100ml(以异丁醇，异戊醇计)。本研究通过Y2、Y14、Y18强化大曲，使酒精发酵液中的乙醇含量显著增加，异戊醇的含量显著降低。

由表还可知，Y2、Y14、Y18强化大曲发酵液中的乙醇和乙酸乙酯的含量显著高于大曲单独发酵，且含量最多的杂醇油，即异戊醇的含量也显著降低。酯类中除丁酸乙酯和乙酸异丁酯外，其他酯类含量均有不同程度的提高。主体酯类成分中，与其它菌种强化发酵液及对照相比，Y14强化大曲发酵液中的乙酸乙酯含量最多，至少是对照的2.3倍；Y18发酵液中的乙酸异戊酯和正己酸乙酯的含量最多，分别至少为对照的1.48倍和1.15倍，而Y2强化大曲发酵液中的辛酸乙酯和乙酸异戊酯含量最多。由此可见，不同菌株强化大曲进行发酵，酒精发酵液中的各种风味物质在总风味物质的比例发生了变化，因而呈现出不同的感官品质。

实施例2：一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法，高产酯土著生香酵母的分离、高产酯土著生香酵母单菌株培养与实施例1中所述高产酯土著生香酵母的分离、高产酯土著生香酵母单菌株培养方法相同，高产酯土著生香酵母菌与大曲共同酒精发酵：采用稀释至10⁷/ml的高产酯土著生香酵母Y14和Y18的联合菌株与大曲共同进行酒精发酵，对照为大曲酿酒，每个样品重复三次；强化菌株的添加比例为25%(ml/g)，Y14和Y18联合双菌株中Y14和Y18的用量各占高产酯土著生香酵母菌菌液总ml数的50%。本实施例所获得的酒精发酵液同样与对照大曲酿酒相比，酒精发酵液中的乙醇含量显著增加，异戊醇的含量显著降低，乙酸乙酯含量增多，各种风味物质在总风味物质的比例发生了变化，因而呈现出与大曲酿酒不同的感官品质。

序列表

<110> 山西农业大学

<120>一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法

<160>4

<170> PaUentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 514

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14的rRNA 基因D1/D2区序列

<400> 1

1 AAATCGTGTT TCGGCACGAG TTGTAGAGTG TAGGCGGGAG TCTCTGTGGA GCGCGGTGTC

61 CAAGTCCCTT GGAACAGGGT GCCTGAGAGG GTGAGAGCCC CGTAGGGTGC TGCGCGAAGC

121 TTTTGAGGCC CTGCTGACGA GTCGAGTTGT TTGGGAATGC AGCTCCAAGC GGGTGGTAAA

181 TTCCATCTAA GGCTAAATAT TGGCGAGAGA CCGATAGCGA ACAAGTACTG TGAAGGAAAG

241 ATGAAAAGCA CTTTGAAAAG AGAGTGAAAC AGCACGTGAA ATTGTTGAAA GGGAAGGGTA

301 TTGGGCTCGA CATGGGGGGT GCGCACCGCT GTCTCTTGTA GGCGGCGCTC TGGGCGCCCT

361 CTGGGCCAGC ATCGGTTCCT GCTGCGGGAG AAGGGGCTCC GGAAAGTGGC TCTTCGGAGT

421 GTTATAGCCG GGGCCAGATG CCGCGTGTGG GGACCGAGGA CTGCGGCTTC TGTCTCGGAT

481 GCTGGCATAA CGGCGCAATA CCGCCCGTCT TGAA

<210> 2

<211> 534

<212> RNA

<213>人工序列

<223> 乙醇假丝酵母(Candida ethonolic)Y18的rRNA 基因D1/D2区序列

<400> 2

1 AAGCGGCAAG AGCTCAGATT TGAAATCGTG TTTCGGCACG AGTTGTAGAG TGTAGGCTGG

61 AGTCTCTGTG GAGCGCGGTG TCCAAGTCCC TTGGAACAGG GTGCCTGAGA GGGTGAGAGC

121 CCCGTGGGGT GCTGCGCGAA GCTTTGAGGC CCTGCTGACG AGTCGAGTTG TTTGGGAATG

181 CAGCTCTAAG CGGGTGGTAA ATTCCATCTA AGGCTAAATA TTGGCGAGAG ACCGATAGCG

241 AACAAGTACT GTGAAGGAAA GATGAAAAGC ACTTTGAAAA GAGAGTGAAA CAGCACGTGA

301 AATTGTTGAA AGGGAAGGGT ATTGGGCCCG ACATGGGGAG TGCGCACCGC TGTCTCTTGT

361 AGGCGGCGCT CTGGGCGCTC TCTGGGCCAG CATCGGTTCT TGCTGCGAGA GAAGTGGCGC

421 CGGAAAGTGG CTCTTCGGAG TGTTATAGCC GGTGCCGGAT GTCGCGTGCG GGGACCGAGG

481 GCTGCGACAT CTGTCTCGGA TGCTGGCACA ACGGCGCAAT ACCGCCCGTC TTGA

<210> 3

<211> 516

<212> DNA

<213>人工序列

<223> 乙醇假丝酵母(Candida ethonolic)Y2的26s rDNA 基因D1/D2区序列

<400> 3

1 AAATCGTGTT TCGGCACGAG TTGTAGAGTG TAGGCGGGAG TCTCTGTGGA GCGCGGTGTC

61 CAAGTCCCTT GGAACAGGGT GCCTGAGAGG GTGAGAGCCC CGTGGGGTGC TGCGCGAAGC

121 TTTGAGGCCC TGCTGACGAG TCGAGTTGTT TGGGAATGCA GCTCTAAGCG GGTGGTAAAT

181 TCCATCTAAG GCTAAATACT GGCGAGAGAC CGATAGCGAA CAAGTACTGT GAAGGAAAGA

241 TGAAAAGCAC TTTGAAAAGA GAGTGAAACA GCACGTGAAA TTGTTGAAAG GGAAGGGTAT

301 TGGGCCCGAC ATGGGGAGTG CGCACCGCTG TCTCTTGTAG GCGGCGCTCT GGGCGCTCTC

361 TGGGCCAGCA TCGGTTCTTG CTGCGAGAGA AGTGGCGCCG GAAAGTGGCT CTTCGGAGTG

421 TTATAGCCGG TGCCGGATGT CGCGTGCGGG GACCGAGGGC TGCGACATCT GTCTCGGATG

481 CTGGCACAAC GGCGCAATAC CGCCCGTCTT GAACC

<210> 4

<211> 421

<212> DNA

<213>人工序列

<223> Y2（Candida ethonolic）26s rDNA ITS 序列

<400> 4

1 ATCTGAGGTC GAGCTCATAG TGCTCGGAGA CCCCAAGCGT CCTGTTCTAG TTCGCTCGTG

61 GCCTCGTTTC TTTTCGGCGG GGCCGTGGCC GGGCCAGCTC TGCGCAACTC TCGTCTTGCA

121 AGAAGGAAAC GACGCTCAGA CAGGCATGCC CGCCGGAATG CCGACGGGCG CAATGTGCGT

181 TCAAGAACTC GATGATTCAC GATGGCTGCA ATTCACACTA GGTATCGCAT TTCGCTGCGC

241 TCTTCATCGA TGCGAGAACC AAGAGATCCG TTGTTGAAAG TTTTGTGTTA AAATAAAAAC

301 TCCTGAACTA GTATACGTGT TTGTGTGTTG TGTGCGCTCA CGCAGTGTGG AACAATAATC

361 ACAGTAATGA TCCTTCCGCA GGTTCACCTA CGGAAACCTT GTTACGACtT TTTTACTTCC A

Claims (3)

1.一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

高产酯土著生香酵母的分离：采集传统山西老陈醋工艺发酵第3天和第6天的酒醅，分别利用孟加拉红选择培养基通过10倍递减梯度稀释法分离酵母菌，取梯度稀释样品液各100uL涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h，选择菌落特征明显的单菌落在孟加拉红选择培养基上进一步划线纯化培养2~3次，纯化后转入YEPD固体斜面，4℃保存，备用；经过了两批次的分离纯化实验，获得酵母菌，所得到的酵母菌通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、26s rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，以及产酒、产酯性能、环境耐受性检测，获得高产酯土著生香酵母：毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14，乙醇假丝酵母(Candida ethonolic)Y18；

高产酯土著生香酵母单菌株培养：Y14、Y18分别以2%的接种量接种在YEPD培养基中30℃培养20h,将菌种用冷却至室温的无菌水稀释至10⁷/ml；

高产酯土著生香酵母菌与大曲共同酒精发酵：采用稀释至10⁷/ml的高产酯土著生香酵母Y14或Y18单一菌株或Y14和Y18的联合菌株与大曲共同进行酒精发酵，对照为大曲酿酒，每个样品重复三次；强化菌株的添加比例分别为25%(ml/g)。

2.根据权利要求1所述的一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法，其特征在于：所述毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形、卵形，大小为4.6-6.5×3.8-6.5mm.麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅白灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐；玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝；rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，测序引物为：NL1: GCATAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G；检测结果为：Genbank序列登录号为KP027538,其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；将Y14菌株活化，接种于醋酸钠产孢培养基平板上，25℃培养4~5d，利用芽孢染色法染色，高倍镜观察子囊孢子的形状及孢子数目，Y14可形成子囊孢子，用孔雀绿染色，子囊孢子呈现蓝色、绿色或无色；所述毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14保藏编号为：CGMCC NO.12407，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期是201６年４月２８日。

3.根据权利要求1所述的一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法，其特征在于：所述乙醇假丝酵母(Candida ethonolic)Y18在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞卵形、腊肠形，大小为4.0-7.2×3.0-5.2mm.麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐；在玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝；rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，测序引物为：NL1: GCATAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G；检测结果为：Genbank序列登录号为KP339953,其碱基序列如SEQ ID NO：2所示；将Y18菌株活化，接种于醋酸钠产孢培养基平板上，25℃培养4~5d，利用芽孢染色法染色，高倍镜观察子囊孢子的形状及孢子数目，Y18不形成子囊和子囊孢子；所述乙醇假丝酵母(Candida ethonolic)Y18保藏编号为：CGMCC NO. 12409，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期是201６年４月２８日。