CN102816708A - 一株产2-苯乙醇酵母菌株及其培养方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株产2-苯乙醇酵母菌株及其培养方法与应用，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株，2010年12月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.4491。本发明筛选出的酿酒酵母WHH6菌株具有2-苯乙醇产量高的特点，经检测，该菌株2-苯乙醇产量可达到5.8564g/L；并且该菌株对2-苯乙醇耐受性高，有利于该菌株在2-苯乙醇工业生产中的应用。

Description

一株产2-苯乙醇酵母菌株及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及一株产2-苯乙醇酵母菌株及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。 

背景技术

2-苯乙醇也称β-苯乙醇，是一种具有玫瑰香气的芳香醇，天然存在于多种植物叶、花及提取的精油中，在面包、果酒、干酪及酱油等发酵食品中含量丰富。2-苯乙醇是玫瑰香型香气的主要成分，也是多种香型的补充成分，其衍生酯类如乙酸苯乙酯也是重要芳香产品。目前全球2-苯乙醇的产量超过万吨，其中大多数采用化工合成法，只有少量从植物精油中萃取。化工合成法成本较低，但合成所用原料苯或苯乙烯属于致癌物，对人体健康及环境有害。另外，化学合成2-苯乙醇中常含难以除去的联二苯、2-氯代乙苯等副产物，呈不悦气味，对产品质量及使用安全造成不良影响。因此，人们钟爱源于生物合成的2-苯乙醇，主要通过动植物原料提取或微生物转化法获得。但每5吨鲜玫瑰花才可制取约1千克玫瑰精油，生产成本高，周期长，产量远不能满足消费需求。因而，微生物转化法成为一条经济有效地生产途径。 

在酵母细胞中，2-苯乙醇可以通过合成芳香族氨基酸的莽草酸途径合成，或通过艾氏途径（Ehrlich pathway）合成（赵修报，唐育岐，刘天明等.β-苯乙醇的研究进展[J].中国酿造，2011,8:1-4.）。多种酵母具有合成2-苯乙醇的能力，如产朊球拟酵母、马克斯克鲁维酵母、发酵毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母及异常汉逊酵母等。少数真菌也具有合成2-苯乙醇的能力，如针层孔菌、安息香薄皮层菌、帚状地霉、猴头菌及黑曲霉等，但2-苯乙醇产率极低。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因具有食用安全、2-苯乙醇产率高等优势而成为国内外持续研究开发的重点对象。崔志峰（崔志峰，车智博，杨霄等.2-苯乙醇耐受性高产酵母菌株的选育[J].浙江工业大学学报，2008（36）：427-430.）和Etschmann M（Etschmann M,Bluemkee W,Sell D,et al.Biotechnological production of2-phenylethanol[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,59:1-8.）分别报道了酵母菌株单相分批发酵生产2-苯乙醇的方法，但整体来说，2-苯乙醇的合成成本仍然较高，上述研究结果获得的酵母菌株仍难以满足市场的需求，因此寻找更高产2-苯乙醇微生物菌株仍是解决上述问题的关键。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株产2-苯乙醇酵母菌株及其培养方法与应用。 

一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株，2010年12月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.4491。 

上述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株是从山东省济南市长清区农家自然发酵葡萄酒缸中分离，并经紫外诱变筛选获得。该菌株菌落呈白色，边缘圆整，中央稍隆起，细胞近圆形，平均大小15～21μm×14～16μm(长×宽)，发酵产香味浓，产乙醇可达9.8%（V/V），酵母菌株对2-苯乙醇有较好耐受性。在水相培养基中当2-苯乙醇浓度为3.5～ 4.5g/L时，菌体OD₆₀₀值为对照的70%～60%。在双相培养基中2-苯乙醇产量可达到5.8564g/L。可以作为2-苯乙醇、葡萄酒和饲料酵母生产菌种应用。 

上述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株的培养方法，步骤如下： 

（1）从试管斜面挑取1～2环酿酒酵母WHH6接入液态种子培养基，在28～30℃、120～160r/m条件下，活化振荡培养16～20h，制得活化后的液态种子； 

（2）将步骤（1）制得的液态种子按照8～12%（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在28～30℃、120～160r/min条件下，培养50～60h，即得。 

根据本发明优选的，所述步骤（1）中液态种子培养基组分如下： 

酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6.0，蒸馏水定容。 

根据本发明优选的，所述步骤（2）中液体发酵培养基组分如下： 

葡萄糖80.0g/L、L-苯丙氨酸35.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L，pH5.5，蒸馏水定容。 

上述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株在制备2-苯乙醇中的应用。 

上述应用，步骤如下： 

（1）从试管斜面挑取1～2环酿酒酵母WHH6接入液态种子培养基，在28～30℃、120～160r/min条件下，活化振荡培养18～22h，制得活化后的液态种子； 

（2）将步骤（1）制得的液态种子按照8～12%（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在28～30℃、120～160r/m条件下，培养24～48h，然后加入液体发酵培养基体积18～22%的无菌油酸或无菌丙二醇2000，在28～30℃、120～160r/min条件下，继续培养至50～60h，经6000r/min下离心5～10min，取油相，制得2-苯乙醇。 

根据本发明优选的，所述步骤（1）中液态种子培养基组分如下： 

酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6.0，蒸馏水定容。 

根据本发明优选的，所述步骤（2）中液体发酵培养基组分如下： 

葡萄糖80.0g/L、L-苯丙氨酸25.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L，pH5.5，蒸馏水定容。 

根据本发明优选的，所述步骤（2）中加入无菌油酸；无菌油酸是油酸经灭菌过程制得。 

有益效果 

1、本发明筛选出的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株具有2-苯乙醇产量高的特点，经检测，该菌株2-苯乙醇产量可达到5.8564g/L； 

2、本发明通过对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株进行研究，优化了培养基中的主要影响因素，提高了该菌株2-苯乙醇的产量。 

3、本发明筛选出的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株2-苯乙醇耐受性高，有利于该菌株在2-苯乙醇工业生产中的应用。 

附图说明

图1是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株的菌落形态照片； 

图2是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株的细胞形态（放大10倍）照片； 

图3是3种芳香族氨基酸种类对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株合成2-苯乙醇的影响； 

图4是不同浓度L-苯丙氨酸对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株合成2-苯乙醇的影响； 

图5是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株在液体发酵培养基中生长曲线； 

图6是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株在液体发酵培养基中生长曲线； 

图7是2-苯乙醇标准品高效液相色谱图； 

图8是2-苯乙醇标准品制作的标准曲线； 

图9是发酵样品中2-苯乙醇的高效液相色谱图； 

图10是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株代谢产生2-苯乙醇的气相色谱-质谱联用图谱； 

图11是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株产2-苯乙醇样品的气相色谱-质谱联用图谱解析结果； 

图12是不同浓度2-苯乙醇条件下酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株的生长曲线。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。 

实施例中所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株，2010年12月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4491。 

实施例中所述2-苯乙醇标准品购自美国Sigma公司。 

实施例1 

一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株，2010年12月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4491。 

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株具有典型的酿酒酵母特征，菌落呈白色，边缘圆整，中央稍隆起，如图1所示；细胞近圆形，平均大小15～21μm×14～16μm(长×宽)，如图2所示；发酵产香味浓，产乙醇可达9.8%（v/v）。单相单菌株在优化培养基中发酵产2-苯乙醇可达5.4003g/L（表1）。可以作为2-苯乙醇、葡萄酒和饲料酵母生产菌种应用。 

实施例2 

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株的培养方法，步骤如下： 

（1）从试管斜面挑取1～2环酿酒酵母WHH6接入液态种子培养基，在28～30℃、120～160r/min条件下，活化振荡培养18～22h，制得活化后的液态种子； 

（2）将步骤（1）制得的液态种子按照8～12%（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在28～30℃、120～160r/min条件下发酵培养。培养24h后,每隔12h取样测定一次发酵液OD₆₆₀值及上清液中2-苯乙醇含量（结果如图5所示），发酵培养40h后每隔4h测定发酵上清液2-苯乙醇含量和菌液OD₆₆₀值（结果如图6所示），即得。 

所述步骤（1）中液态种子培养基组分如下： 

酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6.0，蒸馏水定容。 

所述步骤（2）中液体发酵培养基组分如下： 

葡萄糖80.0g/L、L-苯丙氨酸25.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L，pH5.5，蒸馏水定容。 

由图5可见，当发酵至56h时2-苯乙醇浓度达到最高，菌体光密度在60h达到最高。表明苯乙醇代谢与菌体生长量动态基本一致，但并不完全同步。 

由图6可以看出，菌体光密度优先于2-苯乙醇浓度的增长。在56h时，菌体产量和2-苯乙醇产量均达到最高值。 

产物的确认 

产物确认采用气相色谱-质谱联用检测，将实施例2制得的发酵液在4℃，6000r/m离心6min，取100mL上清液于分液漏斗，加入40mL二氯甲烷间断性混匀，萃取过夜，将有机相转入1.5mL离心管，10000r/min离心10min，有机相添加无水硫酸钠脱水，离心取上清液供气-质联用检测。 

气相色谱-质谱（GC-MS）仪（岛津GC-MS-QP2010型），装有DB-5MS型毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），进样口温度为260℃，柱温箱起始温度为50℃，保留2min，以5℃/min程序升温至240℃，保留2min至终点。载气为He,流速1.0mL/min，柱前压53.5kPa，分流比10:1。电离方式为EI，电离电压70eV，离子源温度200℃，质量扫描范围10-1500Da，连接杆温度250℃，检测器电压350V。 

质谱数据库采用NIST27.LIB,NIST147.LIB和WILERY7.LIB标准谱库。质谱离子图如图10所示，质谱离子图解析结果如图11所示。 

产物浓度的确定 

采用高效液相色谱法测定2-苯乙醇浓度，高效液相色谱（日本岛津LC-10AT）检测分析条件为：C18反相色谱柱（Agilent HC-C18，4.6×250mm,5μm），流动相为甲醇：水=50:50（v/v），流速0.7mL/min，检测波长260nm,进样量15μL。 

(1)2-苯乙醇标准甲醇溶液 

精确称量0.2029g 2-苯乙醇标准品，用色谱纯甲醇溶解并定容至10mL，得到浓度为20.29g/L的2-苯乙醇标准母液。分别准确量取20.29g/L2-苯乙醇溶液0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.2mL,1.4mL,1.6mL于小烧杯，用色谱纯甲醇定容至10mL。得到2-苯乙醇浓度分别为0.4058g/L，0.8116g/L，1.2174g/L，1.6232g/L，2.0290g/L，2.4348g/L，2.8406g/L，3.2464g/L，制得2-苯乙醇标准梯度溶液。 

(2)标准曲线的绘制 

将2-苯乙醇标准梯度溶液分别经过0.22μm有机滤膜过滤后，进样测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线。2-苯乙醇标准品高效液相色谱图如图7所示，2-苯乙醇标准品出峰时间在12～13min之间；每一浓度重复测定6次，求均值绘制2-苯乙醇标准品的标准曲线，如图8所示；根据该标准曲线获得该曲线的方程式为y=8.8004x+2.6141，其中峰面积为y值，浓度值为X。 

2-苯乙醇为挥发性化合物，为了明确样品中2-苯乙醇在代谢及室温放置过程中是否有挥发损失，进行了2-苯乙醇挥发损失实验。在250mL三角瓶中分装的浓度分别为0.4058及0.8116g/L的2-苯乙醇水溶液50mL，8层纱布包扎，于28℃，120r/min的恒温摇床中振荡 36h及72h后测定三角瓶中的2-苯乙醇浓度，两者结果之间无显著性差异。这表明在发酵培养的56h之内，2-苯乙醇没有明显的挥发损失，发酵上清液放入4℃冰箱经过72h保存也不会影响试验检测结果的准确度。 

(3)高效液相色谱法的精密度及加样回收率的确定 

连续进同一样品6次，测定精密度。向某一浓度的样品中添加不同浓度的2-苯乙醇标准品，测定加样回收率。 

(4)样品的制备： 

取发酵液8mL，加入10mL离心管中，6000r/min离心6～10min，取上清液，用0.22μm水性滤膜过滤，收集滤液于1mL离心管中，制得样品，待用。 

高效液相色谱分析参数：C18反相色谱柱（Agilent HC-C18，4.6×250mm,5μm），流动相为甲醇：水=50:50（v/v），流速0.7mL/min，检测波长260nm,进样量15μL。外标法测定2-苯乙醇含量。 

样品的高效液相色谱图如图9所示，由图中可以看出，在12～13min之间有一峰，与标准品出峰时间一致，证明制得了2-苯乙醇； 

高效液相色谱测定的样品的峰面积带入方程y=8.8004x+2.6141，峰面积为y值，换算出2-苯乙醇浓度X。 

氨基酸的优选： 

方案1 

采用实施例2的方法培养酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株，不同之处在于，液体发酵培养基中L-苯丙氨酸改为L-酪氨酸。 

方案2 

采用实施例2的方法培养酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株，不同之处在于，液体发酵培养基中L-苯丙氨酸变为L-色氨酸。 

通过图3可以看出，当液体发酵培养基中采用L-苯丙氨酸时，2-苯乙醇的产量最高。 

关于氨基酸浓度的优选 

采用实施例2的方法培养酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株，不同之处在于，液体发酵培养基中L-苯丙氨酸浓度分别采用5.0g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L，经发酵培养后，2-苯乙醇的产量如图4所示。由此可以发现，当L-苯丙氨酸浓度为25g/L时，2-苯乙醇的产量最高。 

酿酒酵母WHH6对2-苯乙醇耐受性实验 

分别向各摇瓶液体发酵培养基（葡萄糖80.0g/L、L-苯丙氨酸35.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L，pH5.5，蒸馏水定容）中添加不同浓度2-苯乙醇，使2-苯乙醇的浓度分别为1.5g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.5g/L、5.5g/L，按10%（v/v）接种量接种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6，在28℃、160r/min条件下培养，分别在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h取样测定酵母菌体生长量（OD₆₀₀值），比较2-苯乙醇各个浓度对菌体生长的影响，结果如图12所示。 

由图12可知，在添加0g/L～5.5g/L的2-苯乙醇时菌体生长量OD₆₀₀值在1.31～0.45之间。在水相中当其浓度为3.5～4.5g/L时，菌体OD₆₀₀值为对照的70%～60%，即2-苯乙醇抑制了30%～40%酵母菌体的生长量。表明该酵母菌株对2-苯乙醇有较好耐受性，而已报道 的酵母在2-苯乙醇浓度为2.5g/L时就可抑制75%酵母菌体的生长。 

实施例3 

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株在制备2-苯乙醇中的应用，步骤如下： 

（1）从试管斜面挑取2环酿酒酵母WHH6接入液态种子培养基，在28℃、120r/min条件下，活化振荡培养20h，制得活化后的液态种子； 

（2）将步骤（1）制得的液态种子按照8%（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在28℃、120r/m条件下，培养发酵，分别在24～40h各时间点加入液体发酵培养基体积10%的灭菌油酸，在28℃、120r/min条件下，继续培养至总时间为56h，经6000r/min下离心10min，取油相，制得2-苯乙醇。 

根据本发明优选的，所述步骤（1）中液态种子培养基组分如下： 

酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6.0，蒸馏水定容。 

根据本发明优选的，所述步骤（2）中液体发酵培养基组分如下： 

葡萄糖80.0g/L、L-苯丙氨酸25.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L，pH5.5，蒸馏水定容。 

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的无菌油酸是油酸经100℃间歇灭菌过程制得。 

产物浓度的确定 

同实施例2产物浓度的确定，不同之处在于样品的制备，过程如下： 

取发酵液8mL于10mL离心管中，6000r/m离心10min，分三层。上层为有机相，经色谱纯甲醇稀释4倍，用0.22μm有机滤膜过滤，收集滤液于1mL离心管中备用；中层为水相，处理方法同单水相发酵液；下层为微生物细胞，丢弃或用来测定微生物的生物量。有机相及水相发酵液2-苯乙醇测定方法与实施例2中所述的测定方法相同。 

有机相的选择 

采用实施例3的方法，不同之处在于步骤（2）中加入10%灭菌的聚丙二醇2000。灭菌过程同实施例3。 

以不加有机相做为对照。 

水-有机溶剂两相体系中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株代谢生成2-苯乙醇浓度如表1所示。 

表1 

由表1可知，以聚丙二醇2000作为有机相可以有效萃取水相中的2-苯乙醇，其中含量达到18.0538g/L，油酸萃取水相中的2-苯乙醇含量达到13.3926g/L。有机萃取有利于减轻2-苯乙醇产物对酵母菌体生长和代谢的毒害效应。但考虑到油酸成本低，沸点286℃明显高于2-苯乙醇沸点220℃，有利于产品的蒸馏提取，故选用油酸为萃取剂。 

油酸添加量的选择 

采用实施例3的方法，不同之处在于步骤（2）中分别加入液体发酵培养基体积5%、10％、15％、25％的灭菌油酸。 

油酸添加量对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株合成2-苯乙醇的影响如表2所示。油酸添加量为液体发酵培养基体积5～25%时，种子液和油酸添加时间同步，结果以油酸添加量为液体发酵培养基体积10%时效果最好，2-苯乙醇浓度达到5.8564g/L。 

表2 

油酸添加时间的选择 

采用实施例3的方法，不同之处在于步骤（2）中,分别在液态种子接种于液体发酵培养基后第0h、12h、24h、36h、48h加入液体发酵培养基体积10%的灭菌油酸。 

油酸不同添加时间点对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株合成2-苯乙醇的影响如表3所示。 

表3 

由表3可知，培养36h时发酵体系中2-苯乙醇最高达5.8269g/L。在24h～48h时段内添加油酸，产2-苯乙醇量之间无显著差异。 

Claims (9)

1.一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株，2010年12月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.4491。

2.权利要求1所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株的培养方法，步骤如下：

（1）从试管斜面挑取1～2环酿酒酵母WHH6接入液态种子培养基，在28～30℃、120～160r/m条件下，活化振荡培养16～20h，制得活化后的液态种子；

（2）将步骤（1）制得的液态种子按照8～12%（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在28～30℃、120～160r/min条件下，培养50～60h，即得。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中液态种子培养基组分如下：

酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6.0，蒸馏水定容。

4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中液体发酵培养基组分如下：

葡萄糖80.0g/L、L-苯丙氨酸35.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L，pH5.5，蒸馏水定容。

5.权利要求1所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH6菌株在制备2-苯乙醇中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）从试管斜面挑取1～2环酿酒酵母WHH6接入液态种子培养基，在28～30℃、120～160r/min条件下，活化振荡培养18～22h，制得活化后的液态种子；

（2）将步骤（1）制得的液态种子按照8～12%（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在28～30℃、120～160r/m条件下，培养24～48h，然后加入液体发酵培养基体积18～22%的无菌油酸或无菌丙二醇2000，在28～30℃、120～160r/min条件下，继续培养至50～60h，经6000r/min下离心5～10min，取油相，制得2-苯乙醇。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中液态种子培养基组分如下：

酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH6.0，蒸馏水定容。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中液体发酵培养基组分如下：

葡萄糖80.0g/L、L-苯丙氨酸25.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L，pH5.5，蒸馏水定容。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中加入无菌油酸。

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