KR102139018B1 - 고수율 β-페닐에탄올의 양조 효모 균주 및 이의 용도 - Google Patents
고수율 β-페닐에탄올의 양조 효모 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고수율 β-페닐에탄올의 양조 효모 균주 및 이의 용도를 개시하는 바, 이는 산업 미생물 기술분야에 속한다. 본 발명의 고수율 β-페닐에탄올 양조 효모 균주는 중국 전형적 배양물 기탁 센터(CCTCC)에 2016년 12월 26일자로 기탁 번호 M 2016785로서 기탁되었다. 본 발명의 균주는 고수율 β-페닐에탄올 능력을 구비하고 황주 발효, 맛술 발효, 양조 식초, 간장 발효, 백주 발효의 응용에서 β-페닐에탄올 함량은 각각 410mg/L, 450mg/L, 300mg/L, 200mg/L, 110mg/L, 370mg/L에 도달할 수 있으며 이 밖에 풍미 물질인 아세테이트-2-페닐에틸에스테르의 농도를 효과적으로 향상시킬 수 있다. 본 발명의 효모 균주는 발효 성능이 우수하고 발효 제품의 β-페닐에탄올 함량을 현저히 향상시키며 발효 제품의 품질을 개선시키므로 광범한 응용 전망을 가진다.
Description
본 발명은 고수율 β-페닐에탄올의 양조 효모 균주 및 이의 용도에 관한 것으로 산업 미생물 기술분야에 속한다
β-페닐에탄올은 장미향을 구비하는 방향족 알코올로서, 자스민, 장미 등 식물성 에센셜 오일에 자연적으로 존재하는 동시에, 중요한 향료 성분으로서 화장품, 담배 및 생활 화학 제품에도 광범하게 응용된다. β-페닐에탄올은 발효 식품의 특징적인 풍미 물질로서 발효 제품의 풍미와 전체적인 품질을 향상시킬 수 있다. 그러나 현재 화학 방법으로 β-페닐에탄올을 합성하는 과정에서 제거하기 어려운 부산물이 존재할 수 있고, 암을 초래하는 위험이 존재하여 제품의 품질에 심각한 영향을 미칠 수 있으며, 비록 천연 식물로부터 독성이 없고 무해하며 품질이 비슷한 β-페닐에탄올을 물리적으로 추출하여 식품 또는 다른 제품의 생산에 사용될 수 있지만, 성장 주기가 길고 생산량이 낮으며 가격이 높아 시장의 수요를 만족시키기 어렵다.
발효 식품의 β-페닐에탄올은 미생물 대사에 의해 생성될 수 있고, 미생물 발효를 통해 발효 식품의 β-페닐에탄올 함량을 향상시킬수 있으며, 획득한 제품은 천연 식품에 속한다. 양조 효모(Saccharomyces cerevisiae)는 발효 과정에서 에를리히(Ehrlich) 경로 및 다른 대사 경로를 통해 β-페닐에탄올을 생성하고, 황주 등 발효 식품에서의 β-페닐에탄올 함량은 100mg/L 가량에 도달할 수 있어, 비록 농도가 이미 비교적 높지만 β-페닐에탄올을 더 높이는 것이 황주 풍미 향상에는 현저한 효과를 가져온다. 비록 포도주의 β-페닐에탄올 함량은 60mg/L 가량에 도달할 수 있지만, 장미 방향성 과일주의 특징 개발에 있어서 β-페닐에탄올 함량을 더 향상시켜야 하므로, 우수한 성능의 효모를 선별할 필요가 있다.
비록 L-페닐알라닌 등 전구체 화합물을 외래적으로 첨가하면 양조 효모가 β-페닐에탄올을 생성하도록 촉진하여 발효 식품의 β-페닐에탄올을 향상시킬 수 있지만, 원가가 비교적 높고 식품의 원래의 생산 배합을 변화시킨다. 이 밖에 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii) 및 마르크스 클루이베로마이세스(Marx Kluyveromyces) 등과 같은 소수의 비양조 효모류의 효모는 L-페닐알라닌을 외래적으로 첨가하지 않는 경우에 일정한 농도의 β-페닐에탄올을 생성할 수 있어 발효 식품의 β-페닐에탄올 농도 향상에 사용되지만, 비양조 효모의 에탄올 생산 능력이 비교적 낮아 주류 및 식초 등 발효 식품의 양조에 주요한 균주로서 사용되지 못한다. Rafael 등(Overproduction of 2-phenylethanol by industrial yeasts to improve organoleptic properties of bakers' products, International Journal of Food Microbiology, 2014, 180(1):7-12.)에서 고수율 β-페닐에탄올 빵 효모의 베이킹 식품에서의 응용을 보고하였지만, 보고된 효모의 알코올 생산 특성에 대하여 보고를 하지 않았고, 이의 응용 범위는 고농도 알코올을 생성할 필요가 없는 베이킹 식품이다. 비록 일정한 농도의 양조 효모가 양조 식품에 응용되는 다수의 보고가 있지만, 균주가 비교적 높은 알코올 생산 능력을 구비하는 지의 여부는 아직 분명하지 않다. β-페닐에탄올이 효모에 대한 스트레스 능력이 에탄올보다 현저하게 높아, 고수율 β-페닐에탄올의 양조 효모의 에탄올 생산 능력은 통상적으로 감소되기 때문에, 기존의 고수율 β-페닐에탄올의 양조 효모의 알코올 생산 능력은 비교적 낮고, 따라서 전구체 화합물을 외래적으로 첨가하지 않는 경우 고수율로 β-페닐에탄올과 에탄올을 생성할 수 있는 양조 효모는 양조 산업에서 비교적 높은 응용 가치를 구비한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 외래 아미노산을 첨가하지 않고 고수율 β-페닐에탄올 특성을 구비하며 알코올 생산 특성이 우수한 양조 효모 균주, 및 황주, 맛술, 양조식초, 간장, 백주, 과일주에서의 상기 양조 효모 균주의 용도를 제공한다. 상기 균주는 β-페닐에탄올의 고수율 생산 능력 및 풍미 물질인 아세테이트-2-페닐에틸에스테르를 고수율로 생산할 수 있는 능력이 있고, 발효 성능이 우수하며, 발효 제품의 β-페닐에탄올 함량을 현저하게 향상시키고, 발효 제품의 품질을 개선시킬 수 있어, 광범위한 응용 전망을 갖고 있다.
본 발명의 첫번째 목적은, 중국 무한 무한대학 소재의 중국 전형적 배양물 기탁 센터(CCTCC)에 2016년 12월 26일자로 기탁 번호 M 2016785로서 기탁된 고수율 β-페닐에탄올의 양조 효모 균주(Saccharomyces cerevisiae)를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 양조 효모 균주는 황주 진액으로부터 선별한 양조 효모를 출발 균주로 하고, 자외선 돌연변이 유발 후에 p-플루오로페닐알라닌 저항성 선별을 진행한 후, 성장이 우수한 균주를 10%의 에탄올을 함유하는 YPD 액체 배지에 접종시키고, 알코올 내성 선별 및 황주 시뮬레이션 액체 발효 선별을 진행하여 얻은 β-페닐에탄올 생산량이 상대적으로 높은 균주를 상온, 동일한 압력, 동일한 이온의 돌연변이 유발 출발 균주로 하여, 2차 돌연변이 유발 후의 균주에 대하여 p-플루오로페닐알라닌 저항성 선별 및 발효 특성 선별을 진행함으로써, 고수율 β-페닐에탄올 양조 효모를 수득한다.
본 발명의 양조 효모는 하기와 같은 특성을 구비한다.
(1) 황주 발효 시스템에 적용할 경우, 발효에 의해 얻은 황주의 β-페닐에탄올 함량은 410mg/L에 도달할 수 있고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 56μg/L이며, 알코올 도수는 17%(v/v)이고;
(2) 맛술 발효 시스템에 적용할 경우, 발효에 의해 얻은 맛술의 β-페닐에탄올 함량은 450mg/L에 도달할 수 있고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 50μg/L이며, 알코올 도수는 15%(v/v)이고;
(3) 양조 식초 발효의 응용에 있어서, 본 발명의 양조 효모를 주모(seed mash) 대신 사용하고, 얻은 주료를 다시 초산을 통해 발효시키며, 양조 식초의 β-페닐에탄올 함량은 300mg/L이고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 45μg/L이며;
(4) 간장에서의 응용에 있어서, 상기 양조 효모를 간장 발효 시스템에 접종시키고, 발효시켜 얻은 간장의 β-페닐에탄올 함량은 200mg/L이며;
(5) 백주에서의 응용에 있어서, 상기 양조 효모를 백주 발효 시스템에 접종시키고, 증류한 백주의 β-페닐에탄올 함량은 110mg/L이며, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 64μg/L이고, 알코올 도수는 65%(v/v)에 도달할 수 있으며;
(6) 과일주(오디주, 산사주, 양매주, 아로니아주) 발효 시스템에 적용 시, 순종 발효시켜 얻은 과일주의 β-페닐에탄올 함량은 350mg/L에 도달할 수 있고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 50μg/L이며, 알코올 도수는 14.5%(v/v)이고;
(7) 균락은 흰색이고 원형 또는 타원형이며 가장자리가 가지런하다.
본 발명의 두번째 목적은 상기 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785 균주를 함유하는 미생물균제를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 실시형태에서 상기 미생물균제는 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785 균체의 살아있는 세포, 냉동 건조시켜 얻은 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785 건조 균체, 고정화된 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785 세포, 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785의 액체 균제, 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785의 고체 균제 또는 다른 임의의 형태로 존재하는 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785 균주를 함유한다.
본 발명의 세번째 목적은 상기 양조 효모 균주 또는 미생물균제의 용도를 제공하는 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 용도는 발효 식품의 제조에 사용된다.
하나의 실시형태에서, 상기 용도는 양조 기술분야에 적용된다.
본 발명의 네번째 목적은, 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785를 발효제 또는 주요 발효제로 하여 발효시켜 얻은 발효 식품을 제공하는 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 발효 식품은 양조 식품이다.
하나의 실시형태에서, 상기 양조 식품은 주류, 식초 또는 간장이다. 상기 주류는 황주, 맛술, 백주 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
하나의 실시형태에서, 상기 양조 식품은 황주이고, 상기 양조 효모를 주모로 사용한다.
하나의 실시형태에서, 상기 황주의 양조는 상기 양조 효모를 주모로 하고, 5%-10%의 첨가량으로 찌거나 젤라틴화된 원료에 첨가하며, 발효, 압착, 달임, 진양, 여과, 멸균, 주입포장하여 황주를 얻는다.
하나의 실시형태에서, 상기 황주의 양조는 구체적으로 하기와 같다. 먼저 상기 양조 효모를 배양하여 주모를 제조한 후, 전체 체적의 4%로 따라 누룩을 넣고, 전체 체적의 10%로 주모를 고온 젤라틴화된 찹쌀에 넣으며, 균일하게 교반한 후, 발효, 압착, 달임, 진양, 여과, 멸균, 주입포장하여 황주를 얻는다.
하나의 실시형태에서, 상기 양조 식품은 맛술이다.
하나의 실시형태에서, 상기 맛술의 양조는 먼저 상기 양조 효모를 주모로 양조하여 황주를 얻고, 얻은 황주를 사용하여 맛술을 제조한다.
하나의 실시형태에서, 상기 양조 식품은 식초이다.
하나의 실시형태에서, 상기 식초의 양조는 먼저 상기 양조 효모를 주모로 양조하여 황주를 얻고, 얻은 황주를 초산 발효 원료로 사용하여 식초를 양조한다.
하나의 실시형태에서, 상기 식초는 고체 발효 또는 액체 발효의 방법에 의해 양조된다.
하나의 실시형태에서, 상기 양조 식품은 간장이다.
하나의 실시형태에서, 상기 간장은 고염 액체 발효 또는 저염 고체 발효를 사용하여 제조된다.
하나의 실시형태에서, 상기 고염 액체 발효로 간장을 제조하는 방식은 구체적으로 다음과 같다. 콩깻묵과 밀을 균일하게 혼합하고 찌어 익히며, 누룩곰팡이를 접종시키고 식염수를 첨가하여 간장덧(sauce mash)의 염 함량이 18%, 함수량이 65%이 되도록 하며, 교반하여 균일하게 혼합한 후, 배양한 CCTCC NO: M 2016785 효모를 부분적으로 쪄서 익히고 냉각시킨 콩깻묵과 밀에 접종하고, 맑은 물을 가하고, 배양하여 CCTCC NO: M 2016785 주모로 제조하고, 간장덧에의 첨가에 대비하며, 간장 소스 온도가 발효 과정에서 20℃로 승온될 경우 CCTCC NO: M 2016785 주모에 접종하고, 발효 시간은 5개월이며, 발효 완료 후의 간장덧은 압착, 여과, 정화를 거쳐 간장을 얻는다.
하나의 실시형태에서, 상기 저염 고체 발효로 간장을 제조하는 방식은 구체적으로 다음과 같다. 콩깻묵과 밀을 균일하게 혼합하고 찌어 익히며, 누룩곰팡이를 접종시키고, 식염수를 첨가하여 간장덧의 염 함량이 7%, 함수량이 40%이 되도록 하며, 교반하여 균일하게 혼합한 후, 배양한 CCTCC NO: M 2016785 효모를 부분적으로 쪄서 익히고 냉각시킨 콩깻묵과 밀에 접종하고, 맑은 물을 가하고, 배양하여 CCTCC NO: M 2016785 주모로 제조하고, 간장덧 발효 시스템에 접종하며, 배합물 온도를 40℃로 제어하고, 발효 시간은 15d이며, 발효 완료 후의 간장덧은 불순물과 침전을 제거하고, 여과하고, 정화를 거쳐 간장을 얻는다.
하나의 실시형태에서, 상기 양조 식품은 백주이다.
하나의 실시형태에서, 상기 백주의 양조는 백주를 발효 탱크에 넣어 발효시킬 경우 상기 양조 효모를 별도로 첨가한다.
하나의 실시형태에서, 상기 백주를 양조할 경우 양조 효모의 별도 첨가량은 1%이다.
본 발명의 다섯번째 목적은 과일주의 향을 증가시키는 방법을 제공하는 것으로, 특히 과일주의 장미향을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785를 발효 균주로 사용한다.
하나의 실시형태에서, 상기 양조 효모는 CCTCC NO: M 2016785 균주의 동결 건조 분말이다.
하나의 실시형태에서, 상기 방법은 동결 건조하여 얻은 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785 건조 균체를 2‰의 첨가량으로 쥬스에 첨가한다.
하나의 실시형태에서, 상기 과일주는 오디 쥬스, 산사주, 양매 쥬스, 아로니아 쥬스 중 하나 또는 둘 이상을 일정한 비율로 혼합 발효시켜 얻은 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 과일주는 오디주, 산사주, 양매주, 아로니아주 등이다.
하나의 실시형태에서, 상기 방법은 하기와 같은 단계를 포함한다.
(1) 과일 원료를 세척하고, 파쇄하여 압착하며, 분리시켜 쥬스를 얻고;
(2) 백설탕을 넣고, 균일하게 교반하며;
(3) 메타중아황산칼륨 160mg/L, 펙티나아제 100mg/L을 피딩하고, 탱크에 넣어 균일하게 교반하며;
(4) 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785를 종자액 활성화시키고, YPD 배지(1%의 효모 추출물, 2%의 펩톤, 2%의 포도당)를 사용하여 12h 이상 배양하거나; 또는 2‰의 CCTCC NO: M 2016785 동결 건조 분말을 취하여 38℃ 조건에서 30min-60min 교반하여 건조 균체가 충분히 흡수하도록 하여 균액을 얻으며;
(5) 상기 단계에서 활성화된 종자액 또는 동결 건조 분말의 균액을 발효 탱크에 접종시키고, 사전 발효시키며; 접종시킨 후 온도를 23-25℃로 제어하고, 12-24h 후 발효를 시작하며, 발효 후 온도를 20℃-23℃로 제어하고;
(6) 발효 과정에서 발효 상황에 근거하여 백설탕 및 보충량을 첨가할 필요가 있는 지의 여부를 결정하고, 사전 발효 시간은 8-12d이며;
(7) 사전 발효가 완료된 후, 발효액의 효모를 분리시키고, 발효액에 일정한 농도의 이산화유황을 첨가한 후 발효시키며;
(8) 후 발효 온도를 20℃ 이하로 제어하고, 청정제를 첨가하며, 충분히 혼합하고, 발효 시간은 6~24d이며;
(9) 여과: 발효 탱크의 바닥의 잔류주를 제거하고, 상부 액체를 여과한다.
본 발명의 장점과 효과는 하기와 같다.
(1) 본 발명은 외래 아미노산을 첨가하지 않고 고수율 β-페닐에탄올 특성을 구비하며 알코올 생산 특성이 우수한 양조 효모 균주를 획득한다.
(2) 본 발명의 양조 효모 균주는 황주, 맛술, 식초, 간장, 백주의 양조에 사용될 수 있는데; 이러한 제품의 양조에 적용될 경우, 고농도의 β-페닐에탄올을 생성하여 비교적 높은 알코올 생산 능력을 구비할 뿐만 아니라, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르의 함량과 같은 다른 풍미 성분 또는 유익한 성분의 함량을 효과적으로 향상시킬 수 있다.
(3) CCTCC NO: M 2016785를 사용하여 과일주를 제조할 경우, 완성품 과일주의 β-페닐에탄올의 함량은 350mg/L으로서, 일반적인 효모 균종으로 양조한 과일주보다 571% 정도 향상되어 과일주의 향을 현저히 증가시키며, 알코올 생산 특성이 우수하고, 알코올 도수는 14.5%(v/v)에 도달할 수 있다.
생물 재료 기탁
하나의 양조 효모 균주를, 분류학적으로 양조 효모 BYC3 Saccharomyces cerevisiae BYC3으로 명명하고, 중국 무한 무한대학 소재의 중국 전형적 배양물 기탁 센터(CCTCC)에 2016년 12월 26일자로 기탁 번호 M 2016785로서 기탁하였다.
도 1은 실시예 1의 출발 효모 균주의 성장 곡선이고;
도 2는 실시예 1의 출발 효모 균주의 자외선 조사 치사율 그래프이며;
도 3은 실시예 1의 출발 균주 p-플루오로페닐알라닌의 치사율 그래프이고;
도 4는 실시예 2의 황주 발효의 알코올 도수 변화 그래프이며;
도 5는 실시예 2의 황주 발효의 산도 변화 그래프이고;
도 6은 실시예 2의 황주 발효의 pH 변화 그래프이며;
도 7은 실시예 2의 BYC3 양조 효모의 균락 형태이고;
도 8은 실시예 2의 양조 효모 균주의 YPD에서의 β-페닐에탄올 생산량이다.
도 2는 실시예 1의 출발 효모 균주의 자외선 조사 치사율 그래프이며;
도 3은 실시예 1의 출발 균주 p-플루오로페닐알라닌의 치사율 그래프이고;
도 4는 실시예 2의 황주 발효의 알코올 도수 변화 그래프이며;
도 5는 실시예 2의 황주 발효의 산도 변화 그래프이고;
도 6은 실시예 2의 황주 발효의 pH 변화 그래프이며;
도 7은 실시예 2의 BYC3 양조 효모의 균락 형태이고;
도 8은 실시예 2의 양조 효모 균주의 YPD에서의 β-페닐에탄올 생산량이다.
이하 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 자외선 돌연변이 유발 및 선별
YPD 액체 배지: 효모 추출물 10g/L, 어분 펩톤 20g/L, 포도당 20g/L.
YPD 고체 배지: 효모 추출물 10g/L, 어분 펩톤 20g/L, 포도당 20g/L, 영양 한천 20g/L.
1. 돌연변이 유발 출발 균주의 획득
(1) 글리세린 수납관으로부터 황주 생산용 양조 효모(이하 야생 균주라고 함)의 균액 200ul를 취하여 YPD 플레이트에 도포하고, 30℃에서 24h 동안 배양하였다.
(2) 접종 루프를 사용하여 단일 균락을 선택하고, 100ml의 YPD 액체 배지를 함유하는 진탕 플라스크에 넣고, 30℃, 200r/min에서 24h 동안 배양하였다.
(3) 5ml의 얻어진 균액을 취하여 100ml의 YPD 액체 배지를 함유하는 진탕 플라스크에 넣고, 30℃, 200r/min에서 배양하며, 1h마다 균액의 OD600을 측정하고, 효모 지수 성장 기간이 완료된 후 3h마다 OD600을 측정하며, 매번 세 개의 샘플을 취하였다. 성장 그래프를 플롯팅하여 출발 균주 지수 성장 중기 시간, 즉 자외선 돌연변이 유발 시작 시간을 결정하였고, 이때의 균주는 즉 돌연변이 유발 출발 균주이다.
실험 결과는 도 1에 도시된 바와 같다. 3-5h 동안 배양한 경우 효모의 OD600값의 증가가 현저하였고, 이때 효모의 성장은 지수 성장기에 있었으며, 진탕기에서 4h 동안 배양한 경우 야생 균주는 지수 성장기 중기에 있었다. 따라서 진탕기에서 4h 동안 배양한 효모를 돌연변이 유발 출발 균주로 선택하였다.
2. 자외선 돌연변이 유발 시간의 결정
(1) 단계 1에서와 같이 돌연변이 유발 출발 효모 균주 균액을 획득하였다.
(2) 10ml의 돌연변이 유발 출발 균주 박테리아 현탁액을 취하여, 6000r/min으로 5min 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거하고, 50ml의 생리 식염수를 넣어 진탕하며 균일하게 혼합하고, 6000r/min으로 5min 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거하고, 50ml의 생리 식염수를 넣어 진탕하며 균일하게 혼합하여 박테리아 현탁액을 얻었다.
(3) 자외선 조사: 먼저 자외선 램프를 20min 동안 예열하여 광파를 안정시켰다. 5mL의 무균 피펫을 사용하여 상기 박테리아 현탁액 4.5mL를 직경이 9cm인 배양 접시에 옮기고, 배양 접시에 무균 핀을 넣었다. 박테리아 현탁액이 있는 배양 접시를 자기력 교반기에 놓고, 자외선 램프 수직 아래에 놓아 20s 동안 조사하고, 어두운 조건 하에서 접시 뚜껑을 열며(자외선 램프 조사가 균일하도록 확보함), 자외선 조건에서 조사하도록 노출시키고(15W의 자외선 램프, 거리는 30cm임), 시간은 40s, 60s, 80s, 100s, 120s이었다.
(4) 조사 완료 후, 적색 램프 조건 또는 어두운 조건에서 돌연변이 유발 후의 효모 박테리아 현탁액을 10배 희석법으로 10-1, 10-2, 10-3, 10-4인 4개의 구배로 희석하고, 각 구배에서 각각 200μL를 취하여 YPD 플레이트에 도포하며, 주석 호일로 포장하여 빛을 회피하였다. 각 조사 시간당 세 개의 평행을 설정하고, 30℃에서 48h 동안 배양하였다.
(5) 돌연변이 유발을 거치지 않은 효모 박테리아 현탁액을 10배 희석법으로 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5인 5개의 구배로 희석하고, 각 구배에서 각각 200μL를 취하여 YPD 플레이트에 도포하여 대조군으로 하였다. 대조군을 세 개의 평행을 설정하고, 30℃에서 48h 동안 배양하였다.
(6) 플레이트를 카운팅하고, 표를 기록하며, 치사율을 계산하고, 치사율 그래프를 플롯팅하였다. 자외선 치사율이 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%일 경우의 자외선 조사 시간을 각각 결정하였다. 치사율=(대조군의 균락 개수-돌연변이 유발군 균락 개수)/대조군 균락 개수.
실험 결과: 돌연변이 유발 출발 균주를 자외선 돌연변이 유발시키고, 상이한 농도 구배의 박테리아 현탁액을 YPD 플레이트에 도포하며, 성장 균락 개수에 근거하여 치사율 그래프를 플롯팅하였고, 결과는 도 2에 도시된 바와 같다. 치사율 그래프에 근거하여, 치사율 70-80%, 80-90%, 90-100%일 경우의 조사 시간은 각각 110s, 130s, 150s이었다.
3. p-플루오로페닐알라닌의 최저 전부 치사 농도의 결정
YNBP고체 배지: 6.7% YNB, 20g/L포도당, 10g/L프롤린, 농도가 각각 0(대조군), 0.04g/L, 0.05g/L, 0.06g/L, 0.07g/L, 0.08g/L, 0.09g/L, 0.1g/L인 p-플루오로페닐알라닌을 별도로 넣었다.
(1) 지수 성장 중기 박테리아 현탁액을 10배 희석법으로 10-1, 10-2, 10-3, 10-4인 4개의 구배로 희석하고, 10-4 구배의 박테리아 현탁액 200 μL을 취하여 YNBP 플레이트에 도포하였다.
(2) 30℃에서 48-72h 동안 배양하였다. 균락 개수를 기록하고 p-플루오로페닐알라닌 치사율 그래프를 플롯팅하였다.
치사율=(대조군 균락 개수-돌연변이 유발군 균락 개수)/대조군 균락 개수
실험 결과: p-플루오로페닐알라닌 치사율 그래프는 도 3에 도시된 바와 같고, YNBP 플레이트의 p-플루오로페닐알라닌 농도의 증가에 따라 효모 치사율은 끊임없이 증가하며, p-플루오로페닐알라닌 농도가 0.09g/L로 증가될 경우 효모는 전부 치사되므로, p-플루오로페닐알라닌의 최저 전부 치사 농도는 0.09g/L로 결정되었다.
4. 자외선 돌연변이 유발
단계 2에서와 같이 자외선 돌연변이 유발 출발 균주를 획득하였고, 자외선 돌연변이 유발 전체 시간은 각각 110s, 130s, 150s이었다.
5. p-플루오로페닐알라닌 저항성 선별 및 알코올 내성 선별
(1) p-플루오로페닐알라닌 저항성 선별
p-플루오로페닐알라닌 저항성 선별 배지의 조성: 6.7% YNB, 20g/L 포도당, 10g/L 프롤린, p-플루오로페닐알라닌 0.09g/L, 영양 한천 20g/L.
자외선 돌연변이 유발 박테리아 현탁액 200μL를 취하여 p-플루오로페닐알라닌 저항성 선별 플레이트에 도포하고, 주석 호일로 포장하여 빛을 피하였다. 각 치사율 하에서 3개의 플레이트를 설정하고, 30℃에서 72h 동안 배양하였다.
(2) 알코올 내성 선별
알코올 선별 배지 조성: 효모 추출물 10g/L, 어분 펩톤 20g/L, 포도당 20g/L, 무균 에탄올 10%.
1) 96웰 플레이트에 웰당 20μL의 YPD 액체 배지를 넣고, p-플루오로페닐알라닌 저항성 선별 후의 돌연변이 균주를 각각 웰에 접종시키며, 30℃에서 24h 동안 배양하였다.
2) 96웰 플레이트에 웰당 200μL의 알코올 선별 배지를 넣고, 상기 단계의 각 웰의 종자액을 5%로 이 웰 플레이트에 접종시키고, 30℃에서 정지시켜 배양하였다. 각각 12h과 24h에서 미크로 플레이트 레더로 OD600을 측정하였다.
3) OD60012h, OD60024h 및 OD60024h-OD60012h값을 계산하고, 수치가 상대적으로 높은 돌연변이 유발 효모균 22개를 선택하였다.
6. 황주 시뮬레이션 액체의 발효 선별
황주 시뮬레이션 액체의 제조: 1kg의 익은 쌀밥(함수율은 70%임)에 물 1L, 누룩 0.05kg을 넣고 균일하게 교반하며, 60℃에서 8h 동안 보온시키고, 4500r/min에서 5min 동안 분리하며, 상등액을 취하여 115℃에서 15 min 동안 멸균하였다.
(1) 22개의 돌연변이 균주를 각각 YPD 플레이트에 스트리킹시키고, 30℃에서 24h 동안 배양하였다.
(2) 단일 균락을 각각 채취하여 10ml의 YPD를 함유하는 50ml의 원심 분리관에 접종시키고, 30℃, 200r/min에서 12h 동안 배양하였다.
(3) 5%의 균액을 옮겨 20ml의 황주 시뮬레이션 액체를 함유하는 50 원심 분리관에 접종시키고, 30℃에서 7d 동안 정지 발효시키며, 각 군은 세 개의 평행을 설정하였다.
(4) 고성능 액체 크로마토그래피법으로 황주 시뮬레이션 액체의 β-페닐에탄올 함량을 측정하고, β-페닐에탄올 함량이 상대적으로 높은 균주를 선별하였다.
고성능 액체 크로마토그래피 분석:
1) 2mL의 샘플을 2mL의 원심 분리관에 넣고 균체를 원심 분리하여 제거하되 원심 분리의 조건은 12000rpm, 1min이었다.
2) 상등액 1mL를 취하여 0.22μm의 수용성 막을 통과시키고, 액상 주입병에 옮겨 사용하였다.
3) X-bridge C18 컬럼을 사용하고, 이동상은 메탄올:순수한 물=1:1이며, 30℃의 조건 하에서 1mL/min의 유속으로 주입하고, 주입량은 10ul이었다.
고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 황주 시뮬레이션 발효액의 β-페닐에탄올 함량을 측정하였는데, 1-e4돌연변의 균주의 β-페닐에탄올 평균 함량이 185.032mg/L(표 1에 도시된 바와 같음)으로 상대적으로 높으며 알코올 생산 능력이 우수하므로, 이 균주를 다음 단계의 상온, 동일한 압력, 동일한 이온 돌연변이 유발의 출발 균주로 하였다.
[표 1]
실시예 2: 상온, 동일한 압력, 동일한 이온 돌연변이 유발 및 선별
1. 상온, 동일한 압력, 동일한 이온 돌연변이 유발과 황주 시뮬레이션 액체의 발효 선별
제1 라운드에서 자외선 돌연변이 유발 후 선택된 균주 1-e4를 상온, 동일한 압력, 동일한 이온 돌연변이 유발 출발 균주로 하였다. 1-e4 균주를 YPD 진탕 플라스크에서 30℃ 조건 하에 24h 동안 배양하고, 생리 식염수로 OD600가 0.6-0.8인 박테리아 현탁액을 제조하며, 상온, 동일한 압력, 동일한 이온 돌연변이 유발을 진행하고, 돌연변이 유발 시간은 60s이며, 출력은 100w이고, 돌연변이 유발 후 균주는 균액으로 재현탁하며, YPD 플레이트에 희석하여 도포하고, 30℃에서 48h 동안 배양하며, 단일 균락을 YNBP 플레이트(p-플루오로페닐알라닌 농도는 0.5g/L임)에 스트리킹시키고, YNBP 플레이트에서 성장이 우수한 균주를 황주 시뮬레이션 액체 발효 선별하였다. 고성능 액체 크로마토그래피법으로 황주 시뮬레이션 액체의 β-페닐에탄올 함량을 측정하고, β-페닐에탄올 함량이 상대적으로 높은 균주를 선별하였다.
고성능 액체 크로마토그래피법으로 발효 8d 후의 황주 시뮬레이션 발효액의 β-페닐에탄올 함량을 측정하였다. 3-c10, 4-c7, 5-f5 돌연변이 균주의 β-페닐에탄올 평균 함량은 상대적으로 높은 바, 각각 217.192mg/L, 257.388mg/L, 337.168mg/L이었으며, 상기 세 개의 균주를 각각 BYC1, BYC2, BYC3으로 명명하였다. 양조 효모의 β-페닐에탄올 생산량이 증가하였고, 돌연변이 유발 후 양조 효모의 에탄올 생산량은 약간 감소하였지만, 수득한 양조 효모는 여전히 알코올 발효를 우수하게 진행할 수 있었다.
[표 2]
2. 황주 발효 선별
주모 제조: 50mL의 YPD 진탕 플라스크에 효모 균주를 접종시키고, 30℃, 200r/min에서 24h 동안 배양하였다. 1kg의 익은 쌀밥(함수율은 70%임)에 물 1L, 누룩 0.05kg을 넣고 균일하게 교반하며, 60℃에서 4h 동안 보온시키고, 냉각 후 5%로 효모 균액을 접종시키며, 30℃, 200r/min에서 16h 동안 배양하였다.
(1) 배합 원료
익은 쌀밥(함수율은 70%임)에 동일한 중량의 맑은 물, 2%의 누룩, 5%의 주모를 넣고 균일하게 교반하였다.
(2) 발효 및 교반
발효 온도는 28℃이고, 배합 원료가 완성된 후 18h, 24h, 30h, 42h, 54h, 78h, 126h 동안 교반하고 샘플링하였다. 5000r/min으로 10min 동안 원심 분리하여 상등액 샘플을 얻어, 지표 검출에 사용하였다.
(3) 지표 검출
18h, 24h, 30h, 42h, 54h, 78h, 126h에서 채취한 샘플로 이의 전체 산(젖산 기준), 알코올 도수, pH를 측정하고, 세 가지 지표 변화 상황을 관찰하며, 고성능 액체 크로마토그래피법으로 126h에서의 샘플의 β-페닐에탄올 함량을 측정하였다.
이번 라운드의 돌연변이 유발 출발 균주와 세 개의 선별 후 돌연변이 효모 균주로 황주를 발효시켰는데, 알코올 생산 능력 결과는 도 4에 도시된 바와 같다. 세 개의 돌연변이 균주를 출발 균주와 비교하면, 알코올 생산 성능의 차이는 아주 작고, 알코올 도수는 모두 13%(v/v) 이상 도달하여 알코올 발효가 우수하였다. 세 개의 효모는 처음 60h에 알코올 발효가 신속하고, 60h 후 알코올 도수는 기본적으로 안정적이었다. 산도 변화 결과는 도 5에 도시된 바와 같다. 세 개의 돌연변이 효모의 발효 황주의 산도는 3-4g/L 사이이고, 발효의 진행에 따라 산도가 약간 상승하며, 완만해지는 경향이 있었다. pH 변화는 도 6에 도시된 바와 같다. pH는 3-4.5 사이이고, 양조 효모는 양호하게 알코올 발효를 진행할 수 있었다.
황주 발효액의 β-페닐에탄올 함량은 하기 표 3에 도시된 바와 같은데, BYC1, BYC2, BYC3 균주로 황주를 발효시키면, β-페닐에탄올 함량이 219.08, 254.91, 365.70mg/L이었으며, 출발 균주로 황주를 발효시키면 β-페닐에탄올 생산량은 단지 188.07mg/L이었고, 세 개의 균주의 β-페닐에탄올 생산량은 각각 출발 균주의 1.16배, 1.35배, 1.94배로서 우수한 고수율 β-페닐에탄올 능력을 구비한다.
[표 3]
황주 발효액에서 이소부틸알코올, 이소아밀알코올, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르, 글리세린을 풍미 물질로 사용하여 황주의 전체 품질을 향상시킬 수 있는데, 이의 함량은 표 4를 참조하면 되고, 비교하였을 때, BYC3 균주의 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 및 글리세린 함량은 출발 균주 및 BYC1 및 BYC2보다 현저히 높았다.
[표 4]
비교 결과를 요약하면, BYC3은 β-페닐에탄올 생산량이 높고, 이소부틸알코올, 이소아밀알코올, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량도 비교적 높다. BYC3 균주를 YPD고체 배지 플레이트에 스트리킹시키고, 30℃에서 24h 동안 배양하였으며, 균락 형태는 도 7에 도시된 바와 같다. BYC3 균주는 중국 전형적 배양물 기탁 센터(CCTCC)에 기탁 번호 M 2016785로서 기탁되었다. BYC3 균주를 황주 발효 시스템에 접종시키면 알코올 발효 성능이 우수하며 얻은 황주의 β-페닐에탄올 함량이 365.70mg/L이었다.
3. YPD 배지의 고수율 β-페닐에탄올 효모 균주 대조 실험
BYC3 균주(즉 CCTCC NO: M 2016785), 야생 균주, 상업용 활성 건조 효모, 양조 효모 모드 균주 W303(유전자형 Mat a/a, ura3-1, leu2-3,112, trp1-1, his3-11,15, ade2-1, can1-100), 양조 효모 모드 균주 S288c(유전자형 MATα SUC2 gal2 mal2 mel flo1 flo8-1 hap1 ho bio1 bio6)를 사용하여 비교 발효 실험을 진행하였다. 다섯 개의 균주를 YPD 플레이트로 활성화시킨 후 YPD 진탕 플라스크에 넣고, 다시 5%로 순차적으로 YPD 진탕 플라스크 및 YPD 진탕 플라스크(1g/L의 페닐알라닌을 넣음)에 넣었다.
실험 결과는 도 8에 도시된 바와 같이, 양조 효모 균주 BYC3의 β-페닐에탄올 생산량이 야생 균주, 상업용 활성 건조 효모, W303 및 S288c보다 현저하게 높았고, BYC3 효모의 YPD 배지에서의 β-페닐에탄올 생산량은 31.6mg/L에 도달하였으며, 1g/L의 페닐알라닌을 첨가할 경우의 50.9%(야생 효모는 21%, 상업용 효모는 27%, W303은 22%, S288c는 20%)이었고, 효모 BYC3 고수율 β-페닐에탄올 성능이 현저하여 기존의 양조 효모 균주보다 현저히 높았다.
실시예 3: 고수율 β-페닐에탄올 효모의 황주에서의 응용
1. 황주 양조 공법 1
(1) 주모 제조: 50mL YPD 진탕 플라스크에 효모 균주를 접종시키고, 30℃, 200r/min에서 24h 동안 배양하였다. 1kg의 익은 쌀밥(함수율은 70%임)에 물 1L, 누룩 0.05kg을 넣고 균일하게 교반하며 60℃에서 4h 동안 보온시키고, 냉각시킨 후 5%로 효모 균액을 접종시키며, 30℃, 200r/min에서 16h 동안 배양하였고, 효모는 고수율 β-페닐에탄올 양조 효모 BYC3(즉 CCTCC NO: M 2016785)을 사용하였다.
(2) 익은 쌀밥(함수율은 40%임)에 동일한 중량의 맑은 물, 15%의 누룩, 5%의 주모를 넣고 균일하게 교반하였다.
(3) 발효 및 교반: 발효 온도는 28℃이었고, 원료 투입 완성 후 시간을 기록하며, 매 8h마다 교반하고, 48h일 때까지 모두 6번 교반하였다. 5-7일 동안 발효시키고, 알코올 도수 지표가 더이상 증가하지 않았을 때 발효를 종료시켰다.
(4) 압착: 발효 완료 후 발효 진액은 플레이트 필터로 압착하여 청주를 얻었다.
(5) 달임: 청주는 달임 멸균기를 통해 85℃에서 30min 동안 멸균하였다.
(6) 양조: 달임 후 청주는 양조 탱크에서 6개월 동안 양조하였다.
(7) 여과: 양조 후 청주를 규조토 여과기와 막 여과기로 여과하여 불순균 및 불순물을 제거하였다.
(8) 멸균 및 주입포장: 멸균기를 통해 85℃에서 30min 동안 멸균하고, 고온에서 주입포장하였다.
얻은 제품을 고성능 액체 크로마토그래피법으로 검측하면, β-페닐에탄올 함량은 410mg/L이고, 알코올 도수는 17%(v/v)이며, 에틸아세테이트 함량은 24 mg/L이고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 56μg/L이었다.
2. 황주 양조 공법 2
(1) 주모 제조: 본 실시예의 상기 공법 1과 동일하였다.
(2) 찹쌀 파쇄: 찹쌀 중량의 2.5배인 맑은 물, 고온 아밀라아제를 넣고 110℃에서 40min 동안 고온 젤라틴화시키며, 35℃까지 냉각시킨 후 당화 효소를 넣어 40min 동안 당화시키고, 28℃까지 냉각시키며, 전체 체적의 4%에 따라 누룩을 넣고, 전체 체적의 10%로 주모를 넣어 균일하게 교반하였다.
(3) 나머지 단계는 본 실시예의 공법 1에서 설명한 바와 동일하였다.
얻은 제품은 고성능 액체 크로마토그래피법으로 검측하면, β-페닐에탄올 함량은 185mg/L이고, 알코올 도수는 14%(v/v)이며, 에틸아세테이트 함량은 14mg/L이고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 24μg/L이었다.
3. 황주 발효 진액에서 고수율 β-페닐에탄올 효모 균주 대조 실험
BYC3 균주, 야생 균주, 상업용 활성 건조 효모, 양조 효모 모드 균주 W303(유전자형 Mat a/a, ura3-1, leu2-3,112, trp1-1,his3-11,15, ade2-1, can1-100), 양조 효모 모드 균주 S288c(유전자형 MATα SUC2gal2 mal2 mel flo1 flo8-1 hap1 ho bio1 bio6)를 사용하여 비교 발효 실험을 진행하였다. 다섯 개의 균주의 황주 양조 방법은 본 실시예에서 설명한 황주 양조 공법 1과 동일하였다.
결과는 하기와 같다. 양조 효모 균주 BYC3의 β-페닐에탄올 생산량(410mg/L)은 야생 균주(82mg/L), 상업용 활성 건조 효모(87mg/L), W303(81mg/L) 및 S288c(73mg/L)보다 현저히 높았다. 양조 효모 균주 BYC3의 알코올 도수는 17%(v/v)에 도달하였고, 상업용 활성 건조 효모 BYC3, W303, S288c의 알코올 도수는 각각 16.5%(v/v), 12.4%(v/v), 13.1%(v/v)이었다. 균주 BYC3의 고수율 β-페닐에탄올 성능은 현저한 바, 기존의 양조 효모 균주보다 현저히 높은 동시에 비교적 강한 알코올 생산 능력을 구비한다. 효모 균주 BYC3이 생성한 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 농도는 56μg/L에 도달하였는데, 이는 야생 균주의 4.5배, 상업용 활성 건조 효모의 4.3배, W303의 5배, S288c의 5.7배이었다. 효모 균주 BYC3이 생성한 이소아밀알코올 농도는 야생 균주의 1.7배, 상업용 활성 건조 효모의 1.8배, W303의 2.1배, S288c의 2.4배이었다.
실시예 4: 고수율 β-페닐에탄올 효모의 맛술에서의 응용
1. 맛술 양조 공법 1
실시예 3의 황주 양조 공법 1에 따라 황주를 획득하고, 10%의 식염을 넣으며 달임 멸균기를 통해 85℃에서 30min 동안 멸균하고, 고온에서 주입포장하였다.
얻은 제품을 고성능 액체 크로마토그래피법으로 검측하면, β-페닐에탄올 함량은 450mg/L이고, 알코올 도수는 15%(v/v)이며, 에틸아세테이트 함량은 20mg/L이고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 50μg/L이었다.
2. 황주 양조 공법 2
실시예 3의 황주 양조 공법 2에 따라 황주를 획득하고, 10%의 식염을 넣으며 멸균기를 통해 85℃에서 30min 동안 멸균하고, 고온에서 주입포장하였다. β-페닐에탄올 함량은 140mg/L이고, 알코올 도수는 12%(v/v)이며, 에틸아세테이트 함량은 10mg/L이고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 20μg/L이었다.
실시예 5: 고수율 β-페닐에탄올 효모의 양조 식초 고체 발효에서의 응용
실시예 3의 공법 1에 의해 황주를 발효시켜 초산 발효 원료로 사용하였다.
초산 발효는 다음과 같이 고체 발효 공법을 사용하였다. 벼겨, 밀기울, 황주를 1:4:10의 비율로 균일하게 혼합하고, 5%의 초배를 넣어 접종시킨 후, 1-2일 동안 매일 재료 표면을 뒤집고, 온도는 35-40℃이었다. 6-8일에 재료의 바닥을 뒤집었다. 8-12일에는 매일 바닥으로부터 뒤집고, 온도는 자연적으로 낮아졌다. 초배로부터 분리하여 식초를 얻고, 85℃에서 30min 동안 멸균한 후 12개월 양조하였다. 주입포장 전 고온 멸균을 거친 후 고온에서 주입포장하였다.
얻은 고체 발효 양조 식초의 초산 함량은 60g/L이었고, β-페닐에탄올 함량은 300mg/L에 도달하였으며, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 45μg/L이었다.
실시예 6: 고수율 β-페닐에탄올 효모의 양조 식초 액체 발효에서의 응용
실시예 3의 공법 1에 의해 황주를 발효시켜 초산 발효 원료로 사용하였다.
초산 발효는 액체 발효 공법을 사용하였다. 황주를 맑은 물로 4배 희석한 후, 5%의 배양된 초산 박테리아 균액을 넣고, 산소를 1L/min으로 통과시키면서 교반하고, 발효 시스템의 알코올 도수가 1% 미만일 경우 횟수를 나누어 황주를 넣으며 초산 발효 시스템의 알코올 도수를 1%-4%로 제어하고, 발효 시스템의 초산 함량이 약 80g/L일 경우 원심 분리하여 액체 식초를 얻었다. 고온 멸균을 거친 후 고온에서 주입포장하였다. 얻은 액체 발효 양조 식초의 β-페닐에탄올 함량은 100mg/L에 도달하였고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 36μg/L이었다.
실시예 7: 고수율 β-페닐에탄올 효모의 양조 간장 고염 액체 발효에서의 응용
양조 간장은 고염 액체법 발효를 사용하였고, 콩깻묵과 밀을 1:1 비율로 균일하게 혼합하고 찌어 익혔다. 누룩곰팡이의 접종량은 10%이고, 제어 온도는 30℃이며, 재료 중량의 2배의 식염수를 넣는데, 간장덧 염 함량은 18%이고, 함수량은 65%이며, 교반하여 균일하게 혼합하였다. BYC3 효모를 YPD 진탕 플라스크로 배양하고, 5%의 접종량에 따라 부분적으로 쪄서 익히고 냉각시킨 후의 콩깻묵과 밀에 접종시키며, 2배의 체적의 맑은 물을 넣고, 30℃, 200r/min에서 24h 동안 배양하여 BYC3 주모를 제조하며, 간장덧에 첨가할 때까지 대기하였다. 간장 소스 초기 발효 온도는 15℃이고, 발효의 진행에 따라 온도를 15-35℃로 승온시키며, 온도가 20℃까지 승온될 경우 BYC3 주모를 넣었다. 발효 시간은 5개월이었다.
발효 완료 후의 간장덧은 플레이트 압착을 거쳐 간장 소스를 제거하였다. 압착이 완료된 후 규조토 여과 및 막 여과를 진행하여 침전을 제거하였다. 여과하여 정화된 간장은 85℃에서 30min 동안 멸균을 거쳐 고온에서 주입포장하였다. 고수율 β-페닐에탄올 효모를 고염 액체법 발효에 사용하여 얻은 간장 제품은 200mg/L의 β-페닐에탄올을 함유하였다.
실시예 8: 고수율 β-페닐에탄올 효모의 양조 간장 저염 고체 발효에서의 응용
양조 간장은 저염 고체 발효를 사용하였고, 콩깻묵과 밀을 1:1 비율로 균일하게 혼합하고 찌어 익혔다. 누룩곰팡이의 접종량은 10%이고, 제어 온도는 30℃이며, 재료 중량의 2배의 식염수를 넣는데, 간장덧 염 함량은 7%이고, 함수량은 40%이며, 교반하여 균일하게 혼합하였다. BYC3 효모를 YPD 진탕 플라스크로 배양하고, 5%의 접종량에 따라 부분적으로 쪄서 익히고 냉각시킨 후의 콩깻묵과 밀에 접종시키며, 1배의 체적의 맑은 물을 넣고, 30℃, 200r/min에서 24h 동안 배양하여 BYC3 주모를 제조하며, 간장덧 발효 시스템에 넣고, 제품 온도를 40℃로 제어하였다. 발효 시간은 15d이었다.
발효 완료 후의 간장덧은 불순물과 침전을 제거하였다. 여과하여 정화된 간장은 85℃에서 30min 동안 멸균을 거쳐 고온에서 주입포장하였다. 고수율 β-페닐에탄올 효모를 고염 액체법 발효에 사용하여 얻은 간장 제품은 50mg/L의 β-페닐에탄올을 함유하였다.
실시예 9: 고수율 β-페닐에탄올 효모의 백주에서의 응용
1. 백주 양조 공법 1
2차 발효법을 사용하여, 1차 발효 시 수수를 찌어 익힌 후 28℃로 공기 냉각시키고, 4%의 누룩곰팡이를 첨가하며 28℃에서 24h 동안 배양하였다. 벼겨 10%, 누룩 15%, 밀기울 8%를 첨가하되, 1%로 YPD 진탕 플라스크에서 배양한 BYC3 효모를 넣고, 30일 밀폐 발효시킨 후 증류하였다. 2차 발효 시 중온 누룩 10%, 1%로 YPD 진탕 플라스크에서 배양한 BYC3 효모를 넣고, 15일 동안 발효시킨 후 증류하였다. 두 가지 술을 알코올 도수가 65%(v/v)이고, β-페닐에탄올 함량이 110mg/L이며, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량이 64μg/L가 되도록 혼합하였다.
2. 백주 양조 공법 2
수수 40%, 밀 10%, 옥수수 5%, 입쌀 25%, 찹쌀 20%를 찌어 익힌 후, 공기 냉각시켜 온도는 25℃가 되도록 하고, 벼겨 사용량은 20%, 누룩 20%, 수분 30%이며, 1%로 YPD 진탕 플라스크에서 배양한 BYC3 효모를 넣었다. 온도는 20℃이고, 습도는 70%이며, 60일 동안 발효시키고, 증류하여 38%의 백주를 획득하였다. β-페닐에탄올 함량은 50mg/L이고, 아세테이트-2-페닐에틸에스테르 함량은 26μg/L이었다.
실시예 10: 아로니아주 향을 증가시키는 양조 방법
(1) 야생 아로니아 과일을 세척하고, 파쇄 압착하며, 분리시켜 아로니아 쥬스를 얻었다.
(2) 아로니아 쥬스의 당 함량에 근거하여 당을 보충하고, 17g/L의 당과 1도의 알코올의 전환 관계에 따라, 발효 상황에 근거하여 백설탕의 양을 결정하고 균일하게 교반하였다.
(3) 메타중아황산칼륨 160mg/L, 펙티나아제 100mg/L를 피딩하고 탱크에 넣어 균일하게 교반하였다.
(4) 종자액 활성화: YPD 배지에서 28℃로 CCTCC NO: M 2016785를 12~24h 동안 정지 배양하고, 5%의 접종량으로 50g/L의 당을 함유하는 쥬스에서 28℃로 16h 이상 정지 배양하였다.
(5) 활성화된 종자액을 발효 탱크에 넣고 사전 발효를 진행하였다. 접종시킨 후 온도를 23-25℃로 제어하고, 12-24h 후 발효를 시작하며, 발효 후 온도를 20℃-23℃로 제어하였다. 매 24h마다 알코올 도수, 잔류당, 산도, pH를 측정하였다.
(6) 잔류당이 60g/L 미만일 경우 쥬스 발효 알코올 도수가 요구에 도달하도록 하기 위하여, 17g/L의 당과 1도의 알코올의 전환 관계에 따라, 발효 상황에 근거하여 백설탕 보충이 필요한 지의 여부 및 보충량을 결정하고, 잔류당이 4g/L정도이며, 술 표면이 평온하고, 기포가 비교적 적으며, 상층액이 맑을 경우, 사전 발효를 완료시켰고, 사전 발효 시간은 10d 정도이었다.
(7) 사전 발효가 완료된 후, 발효액을 규조토 여과하고, 발효액에 0.04g/L의 이산화유황을 첨가한 후 발효시켰다.
(8) 후 발효 온도를 20℃ 이하로 제어하고, 2‰의 벤토나이트 청정제를 첨가하여 20d 정도 충분히 혼합하였다.
(9) 여과: 가만히 두어 정화가 완료된 후, 발효 탱크 바닥의 잔류주를 제거하고, 상부 액체를 규조토 여과하며, 규조토 여과 후 막 여과기를 사용하여 마이크로 여과를 진행하였다.
발효 완료 후 고성능 액체 크로마토그래피법으로 β-페닐에탄올 함량을 측정하였는되, 여기서 안치(Anqi) 상업용 양조 효모로 발효된 β-페닐에탄올 함량은 61mg/L이었고, 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785로 발효된 아로니아주 β-페닐에탄올 함량은 350mg/L이었다.
실시예 11: 양조 효모 CCTCC NO: M 2016785 동결 건조 분말을 사용하여 과일주 향을 증가시키는 양조 방법
실시예 10에서는 활성화된 CCTCC NO: M 2016785 종자액을 사용하였는데, 본 실시예에서는 2‰의 CCTCC NO: M 2016785 동결 건조 분말을 첨가하고, 38℃에서 30min-60min 동안 교반하여 건조 균체가 충분히 흡수하도록 하는 동시에, 소포 목적을 달성하였고, 기타 단계는 실시예 10과 동일하였다. 얻은 과일주 β-페닐에탄올 함량은 325mg/L이었다.
여기서 실시예 10과 상이한 균주 발효를 사용한 아로니아 과일주의 결과는 표 5에 도시된 바와 같다.
[표 5]
실시예 12: 산사주 향을 증가시키는 양조 방법
산사 과일 펙틴 함량은 3%~7%이고, 과일은 파쇄된 후 겔 상태를 이루므로, 실시예 10의 단계 (1)에서 파쇄할 때 40~50℃의 온수를 넣을 수 있으며, 물의 양은 산사량의 1배 이내로 제어하고, 5min 동안 가열 비등시킨 후, 쥬스를 추출하며, 끓는 과정에서 완성된 술의 알코올 도수 요구에 따라, 펄프의 당 함량, 산도를 조절할 수 있다. 추출이 완료된 후 펄프 온도를 40℃ 정도로 낮추고, 펙티나아제와 SO2를 넣으며 균일하게 교반하여 발효용 쥬스로 사용하되, 기타 단계는 실시예 10과 동일하였다. 얻은 산사주의 β-페닐에탄올 함량은 243mg/L이고, 알코올 도수는 13%(v/v)이었다.
실시예 13: 오디주 향을 증가시키는 양조 방법
실시예 10에서 원료를 오디로 대체하되, 기타 단계는 실시예 10과 동일하였다. 얻은 오디주의 β-페닐에탄올 함량은 305mg/L이고, 알코올 도수는 13.5%(v/v)에 도달할 수 있었다.
실시예 14: 양매주 향을 증가시키는 양조 방법
실시예 10에서 원료를 양매로 대체하되, 기타 단계는 실시예 10과 동일하였다. 얻은 양매주의 β-페닐에탄올 함량은 212mg/L이고, 알코올 도수는 14.5%(v/v)에 도달할 수 있었다.
Claims (12)
- 중국 무한 무한대학 소재의 중국 전형적 배양물 기탁 센터(CCTCC)에 2016년 12월 26일자로 기탁 번호 M 2016785로서 기탁된 고수율 β-페닐에탄올의 양조 효모 균주(Saccharomyces cerevisiae).
- 제1항에 따른 양조 효모 균주를 함유하는 미생물균제.
- 제1항에 있어서,
발효 식품의 제조에 사용되는 양조 효모 균주. - 제2항에 있어서,
발효 식품의 제조에 사용되는 미생물균제. - 제1항에 따른 양조 효모 균주 또는 제2항에 따른 미생물균제를 발효제 또는 주요 발효제로 하여 발효시켜 수득한 것임을 특징으로 하는 발효 식품.
- 제5항에 있어서,
상기 발효 식품은 주류, 식초 또는 간장인 것을 특징으로 하는 발효 식품. - 제6항에 있어서,
상기 주류는 황주, 맛술, 백주 또는 과일주인 것을 특징으로 하는 발효 식품. - 제5항에 있어서,
상기 발효 식품은 황주이고, 상기 양조 효모 균주를 주모(seed mash)로 사용하는 것을 특징으로 하는 발효 식품. - 제5항에 있어서,
상기 발효 식품은 맛술이고, 상기 양조 효모 균주를 주모로 사용하여 황주를 양조하여 수득한 다음, 수득한 황주를 사용하여 맛술을 제조하는 것을 특징으로 하는 발효 식품. - 제5항에 있어서,
상기 발효 식품은 식초이고, 상기 양조 효모 균주를 주모로 사용하여 황주를 양조하여 수득한 다음, 수득한 황주를 초산 발효 원료로 사용하여 식초를 양조하는 것을 특징으로 하는 발효 식품. - 제5항에 있어서,
상기 발효 식품은 백주이고, 백주 발효 탱크에서 발효시킬 때 상기 양조 효모 균주를 별도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 발효 식품. - 제5항에 있어서,
상기 발효 식품은 과일주이고, 상기 과일주는 오디 쥬스, 산사주, 양매 쥬스, 아로니아 쥬스에서의 하나 또는 둘 이상을 일정한 비율로 혼합 발효시켜 수득한 것임을 특징으로 하는 발효 식품.
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