JP6946358B2 - β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母菌株及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母菌株及びその使用に関し、工業微生物の技術分野に属する。

β−フェネチルアルコールは、バラ風味を有する芳しいアルコールであり、天然でジャスミン、バラなどの植物精油中に存在し、また重要なフレーバー成分として、化粧品、タバコと日常化学用品においても広く使用される。β−フェネチルアルコールは、発酵食品中の特徴の風味物質として、発酵製品の風味と全体品質を高めることができる。但し現在、化学法でβ−フェネチルアルコールを合成する過程において除去し難い副産物が存在し、発癌性リスクが存在し、製品品質に深刻に影響を与える；天然植物から物理的抽出すれば無毒性で、品質が上等のβ−フェネチルアルコールを取得し、食品またはその他の製品の生産に用いることができるが、生産周期が長く、生産量が低く、価格が高く、市場ニーズを満たし難い。

発酵食品中のβ−フェネチルアルコールは微生物から代謝して生成することができ、微生物発酵によって発酵食品中のβ−フェネチルアルコールの含有量を高めることができ、得られた製品は、自然食品に属する。酒醸造用酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、発酵過程においてエールリッヒ経路およびその他の代謝経路によってβ−フェネチルアルコールを生成し、黄酒などの発酵食品中のβ−フェネチルアルコールの含有量は１００ｍｇ前後に達することができ、濃度が既に高目になるが、β−フェネチルアルコールを更に高めることにより、黄酒風味が著しく増強する。ワイン中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、６０ｍｇ／Ｌに達することができるが、バラ芳香性果実酒の特徴開発に対し、さらにβ−フェネチルアルコールの含有量をさらに高める余地があり、このため優れた性能を有する酵母をスクリーニングする必要がある。

Ｌ−フェニルアラニンなどの前体化合物を外源で添加すれば酒醸造用酵母を促進してβ−フェネチルアルコールを生成させて発酵食品中のβ−フェネチルアルコールを高めることができるが、コストが高く、かつ、食品の従来の生産配合を変更する。さらに、少数の非酒醸造用酵母類の酵母は、例えばピキア・クドリアブゼビ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、マルクス・クルイヴェロマイシス（Ｍａｒｘ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）はＬ−フェニルアラニンを外源で添加することなく、一定の濃度のβ−フェネチルアルコールを生成することができ、発酵食品中のβ−フェネチルアルコール濃度を高めるために用いるが、非酒醸造用酵母のアルコール生成能力が低く、主な菌株として酒類と食酢などの発酵食品の醸造に用いることができない。Ｒａｆａｅｌなど（Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ ｂｙ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｙｅａｓｔｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｏｒｇａｎｏｌｅｐｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂａｋｅｒｓ’ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１４，１８０ （１）：７−１２。）にβ−フェネチルアルコールを多収量に生成するパン酵母が焼成食品における使用が報道されるが、報道された酵母のアルコール生成特性を報道しておらず、その使用範囲は高い濃度アルコールを生成する必要がない焼成食品である。一定の濃度のアルコールを生成する酒醸造用酵母が醸造食品に使用される報道はすでに複数あるが、菌株は、高いアルコール生産能力を有するか否かはまだ分からない。β−フェネチルアルコールが酵母への脅迫能力はアルコールより著しく高く、β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母のアルコール生成能力は、一般的に低下し、このため従来のβ−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母のアルコール生産能力が低く、このため前体化合物を外源で添加することなく、β−フェネチルアルコールとアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母は醸造工業中に高い使用価値を有する。

上記問題を解決するために、本発明は、外源アミノ酸を添加することなくβ−フェネチルアルコールを多収量に生成する特性を有し且つアルコール生成特性が高い酒醸造用酵母菌株、および、黄酒、料理酒、醸造食酢、醤油、白酒、果実酒におけるその使用を提供することである。該菌株は、β−フェネチルアルコールを多収量に生成する能力と風味物質である酢酸−２−フェニルエチルを多収量に生成する能力を有し、かつ、発酵性能が高く、発酵製品中のβ−フェネチルアルコールの含有量を明らかに高め、発酵製品の品質を改善することができ、広範な利用可能性を有する。

本発明の一つ目の目的は、β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母菌株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を提供することであり、それが２０１６年１２月２６日に中国典型培養物保存センターにブダペスト条約に基づく国際寄託として保存され、保存アドレスは、中国武漢の武漢大学であり、保存番号は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５である。

本発明に記載の酒醸造用酵母菌株は、黄酒のマッシュからスクリーニングされた酒醸造用酵母を出発菌株として、紫外線変異を経た後にＰ−フルオロフェニルアラニン抗性スクリーニングを行い、続いて伸び方が良好な菌株をスクリーニングして１０％のアルコールを含むＹＰＤ液体培地に接種し、アルコール耐性スクリーニングおよび黄酒シミュレーション液発酵スクリーニングを行い、得られたβ−フェネチルアルコールの生産量がより高い菌株を常温等圧プラズマ変異出発菌株として、二回変異後の菌株に対してＰ−フルオロフェニルアラニン抗性スクリーニング、および発酵特性スクリーニングを行い、β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母を得る。

本発明の酒醸造用酵母は、以下のような特性を有する：
（１）黄酒発酵体系に使用され、発酵して得られた黄酒中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、４１０ｍｇ／Ｌに達することができ、酢酸−２−エチルベンゼンの含有量は、５６μｇ／Ｌであり、アルコール度は、１７％（ｖ／ｖ）である；
（２）料理酒発酵体系に使用され、発酵して得られた料理酒中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、４５０ｍｇ／Ｌに達することができ、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、５０μｇ／Ｌであり、アルコール度は、１５％（ｖ／ｖ）である；
（３）醸造食酢発酵における使用は、こうじの代わりに本発明の酒醸造用酵母を用い、得られたマッシュは、更に酢酸発酵を経て、醸造された食酢中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、３００ｍｇ／Ｌであり、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、４５μｇ／Ｌである；
（４）醤油における使用は、前記酒醸造用酵母を醤油発酵体系に接種し、発酵して得られた醤油中のβ−フェネチルアルコールの含有量は２００ｍｇ／Ｌである；
（５）白酒における使用は、前記酒醸造用酵母を白酒発酵体系に接種し、蒸留白酒中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、１１０ｍｇ／Ｌであり、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、６４μｇ／Ｌであり、アルコール度は、６５％（ｖ／ｖ）に達することができる；
（６）果実酒（桑の実酒、サンザシ酒、ヤマモモの実酒、チョークベリー酒）発酵体系に使用され、純種発酵して得られた果実酒中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、３５０ｍｇ／Ｌに達することができ、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、５０μｇ／Ｌであり、アルコール度は、１４．５％（ｖ／ｖ）である；
（７）コロニーは、白色であり、円形または楕円形であり、縁部が整然とする。

本発明の二つ目の目的は、前記酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５菌株を含む前記微生物菌剤を提供することである。

本発明の実施形態において、前記微生物菌剤は酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ ２０１６７８５菌体の活細胞、冷凍乾燥して得られた酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍは、２０１６７８５乾燥菌体、固定化された酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ２０１６７８５細胞、酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ２０１６７８５液体菌剤、酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ２０１６７８５固体菌剤、またはその他の任意の形式で存在する酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ２０１６７８５菌株を含む。

本発明の三つ目の目的は、前記酒醸造用酵母菌株または微生物菌剤の使用を提供することである。

実施形態において、前記使用は、発酵食品の作製に用いられることである。

実施形態において、前記使用は、醸造技術分野に用いられることである。

本発明の四つ目の目的は、発酵食品を提供することであり、前記発酵食品は酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５を発酵剤または主な発酵剤として発酵して得られる。

実施形態において、前記発酵食品は、醸造食品である。

実施形態において、前記醸造食品は、酒類、食酢または醤油である。前記酒類は黄酒、料理酒、白酒などを含むがそれらに限定されない。

実施形態において、前記醸造食品は、黄酒であり、前記酒醸造用酵母をこうじとする。

実施形態において、前記黄酒の醸造は、前記酒醸造用酵母をこうじとして、５％−１０％の添加量で煮てまたは糊化した原料に添加し、発酵、圧搾、煎じ、熟成、濾過、滅菌缶詰めを経て黄酒を得る。

実施形態において、前記黄酒の醸造は、具体的には以下のとおりである：まず前記酒醸造用酵母を培養してこうじを製造し、続いて総体積の４％で麦麹を添加し、総体積の１０％でこうじを高温糊化したもち米に添加し、均一に撹拌し、続いて発酵、圧搾、煎じ、熟成、濾過、滅菌缶詰めを経て黄酒を得る。

実施形態において、前記醸造食品は、料理酒である。

実施形態において、前記料理酒の醸造は、まず前記酒醸造用酵母を利用してこうじとして醸造して黄酒を得て、更に得られた黄酒を利用して料理酒を製造する。

実施形態において、前記醸造食品は、食酢である。

実施形態において、前記食酢の醸造は、まず前記酒醸造用酵母を利用してこうじとして醸造して黄酒を得て、更に得られた黄酒を利用して酢酸発酵原料として食酢を製造する。

実施形態において、前記食酢は、固態発酵または液態発酵の方法を採用して醸造される。

実施形態において、前記醸造食品は、醤油である。

実施形態において、前記醤油の醸造は、高い食塩稀態発酵または低い食塩固態発酵を採用して醤油を製造する。

実施形態において、前記高い食塩稀態発酵で醤油を製造することは、具体的には以下のとおりである：脱脂大豆と小麦を均一にかき混ぜて十分に蒸し、コウジカビを接種し、食塩水を添加して醤油マッシュ中の食塩含有量を１８％にし、含水量を６５％にし、撹拌して均一にかき混ぜる；続いて培養したＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ ２０１６７８５酵母を一部の十分に蒸して冷却した後の脱脂大豆と小麦中に接種し、浄水を添加し、培養してＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ２０１６７８５こうじを製造し、醤油マッシュに添加することを待つ；醤油モロミ温度が発酵過程において２０の℃に上昇する時にＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ ２０１６７８５こうじに接種する；発酵時間は、５カ月である；発酵が終了した後の醤油マッシュは、圧搾、濾過、澄ましを経て、醤油を得る。

実施形態において、前記低い食塩固態発酵で前記醤油を製造することは、具体的には以下のとおりである：脱脂大豆と小麦を均一にかき混ぜて十分に蒸し、コウジカビを接種し、食塩水を添加して醤油マッシュ中の食塩含有量を７％にし、含水量を４０％にし、撹拌して均一にかき混ぜる；続いて培養したＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ ２０１６７８５酵母を一部の十分に蒸して冷却した後の脱脂大豆と小麦中に接種し、浄水を添加し、培養してＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ２０１６７８５こうじを製造し、醤油マッシュ発酵体系に接種し、製品の温度を４０℃に制御する；発酵時間は、１５ｄである；発酵が終了した後の醤油マッシュは、不純物除去と沈殿、濾過と澄ましを経て醤油を得る。

実施形態において、前記醸造食品は、白酒である。

実施形態において、前記白酒の醸造は、白酒が発酵タンクに入って発酵する時に前記酒醸造用酵母を余分に添加する。

実施形態において、前記白酒醸造時に酒醸造用酵母の余分な添加量は、１％である。

本発明の五つ目の目的は、果実酒の芳しさを増強する方法、特に果実酒のバラの芳しさを増強する方法を提供することであり、前記方法は本発明の酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ ２０１６７８５を利用して発酵菌株とする。

実施形態において、前記酒醸造用酵母は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５菌株凍結乾燥粉末である。

実施形態において、前記方法は、冷凍乾燥して得られた酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５乾燥菌体を２‰の添加量でフルーツジュースに添加する。

実施形態において、前記果実酒は、桑の実ジュース、サンザシ酒、ヤマモモジュース、チョークベリージュース中の一つまたは二つ以上を一定の比率で混合して発酵させて得られる。

実施形態において、前記果実酒は、桑の実酒、サンザシ酒、ヤマモモ酒、チョークベリー酒などである。

実施形態において、前記方法は、以下のステップを含む：
（１）果実原料を洗浄し、破砕と圧搾を行い、分離してフルーツジュースを得る；
（２）白砂糖を追加し、均一に撹拌する；
（３）ピロ亜硫酸カリウム１６０ｍｇ／Ｌ、ペクチナーゼ１００ｍｇ／Ｌを流加し、缶に入れて均一に撹拌する；
（４）酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１６７８５に対して培養液活性化を行い、ＹＰＤ培地（１％酵母ペースト、２％蛋白ペプトン、２％ブドウ糖）を採用して１２ｈ以上培養する；または２‰のＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ２０１６７８５凍結乾燥粉末を取り、３８℃で３０ｍｉｎ−６０ｍｉｎ撹拌して乾燥菌体に水を十分に吸入させ、菌液を得る；
（５）上のステップで活性化した培養液または凍結乾燥粉末を発酵缶に接種し、前発酵を行う；接種した後、温度を２３−２５℃に制御し、１２−２４ｈ後に発酵を起動し、発酵を起動した後に温度を２０℃−２３℃に制御する；
（６）発酵過程において、発酵状況に基づいて白砂糖を追加する必要があるか否かおよび追加量を判定する；前発酵時間は、８−１２ｄである；
（７）前発酵が終了した後、発酵液中の酵母を分離し、発酵液に一定の濃度の二酸化硫黄を添加して後発酵に移行する；
（８）後発酵温度を２０℃以下に制御し、澄まし剤を添加し、十分に混合し、発酵時間が１６〜２４ｄである；
（９）濾過する：発酵缶の底部の酒脚を排出し、上部液体を濾過する。

本発明の利点と効果は、以下のとおりである：
（１）本発明は、外源アミノ酸を添加することなくβ−フェネチルアルコールを多収量に生成する特性を有し且つアルコール生成特性が高い酒醸造用酵母菌株を提供する。
（２）本発明の酒醸造用酵母菌株は、黄酒、料理酒、食酢、醤油、白酒の醸造に用いることができる；これらの製品の醸造に使用する時、高い濃度のβ−フェネチルアルコールを生成し、高いアルコール生産能力を有するだけでなく、更に他の風味成分または有益成分の含有量、例えば酢酸−２−フェニルエチルの含有量を効果的に高めることができる。
（３）ＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ ２０１６７８５を利用して果実酒を製造し、完成品である果実酒中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、３５０ｍｇ／Ｌに達し、普通の酵母菌種が醸造した果実酒より５７１％を高め、果実酒の芳しさを著しく増強し、かつ、アルコール生成特性が高く、アルコール度は、１４．５％（ｖ／ｖ）に達することができる。

生物材料の保存
酒醸造用酵母菌株であって、分類学的に酒醸造用酵母のＢＹＣ ３ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹＣ ３と命名し、２０１６年１２月２６日に中国典型培養物保存センターにブダペスト条約に基づく国際寄託として保存され、保存アドレスは、中国武漢の武漢大学であり、保存番号は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５である。

図１は実施例１中の出発酵母菌株の成長曲線である； 図２は実施例１中の出発酵母菌株の紫外線照射致死率曲線である； 図３は実施例１中の出発菌株のＰ−フルオロフェニルアラニン致死率曲線である； 図４は実施例２中の黄酒発酵アルコール度の変化曲線である； 図５は実施例２中の黄酒発酵酸度の変化曲線である； 図６は実施例２中の黄酒発酵ｐＨの変化曲線である； 図７は実施例２中のＢＹＣ３酒醸造用酵母コロニー形態である； 図８は実施例２中の酒醸造用酵母菌株がＹＰＤ中のβ−フェネチルアルコール生産量である。

以下に本発明を具体的に記述する。
実施例１：紫外線変異とスクリーニング
ＹＰＤ液体培地：酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、魚粉蛋白ペプトン２０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ。
ＹＰＤ固体培地：酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、魚粉蛋白ペプトン２０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、栄養寒天２０ｇ／Ｌ。

１．変異出発菌株の取得
（１）グリセリン保存管から黄酒生産用の酒醸造用酵母（以下に野生菌株と呼ばれる）の菌液２００ｕｌを取り、ＹＰＤ平板に塗布し、３０℃で２４ｈ培養する。
（２）接種用ループで単一コロニーを選び出して１００ｍｌのＹＰＤ液体培地を含む振とうフラスコに入れ、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで２４ｈ培養する。
（３）得られた菌液を５ｍｌ取り、１００ｍｌのＹＰＤ液体培地を含む振とうフラスコに接種し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで培養し、１ｈをおくごとに菌液のＯＤ６００を測定し、酵母指数の増長期が終了した後に３ｈをおくごとにＯＤ６００を測定し、毎回３個のサンプルを取る。成長曲線を製図し、出発菌株指数の増長中期時間は、即ち紫外線変異開始時間であり、この時の菌株は、即ち変異出発菌株であると決定する。
実験結果は図１に示すとおりである：３−５ｈ培養する時に酵母ＯＤ６００の増長が著しく、この時の酵母成長は、指数成長期にあり、振とう機で４ｈ培養する時に野生菌株は、指数成長中期にある。このため振とう機で４ｈ培養する酵母を選択して変異出発菌株とする。

２．紫外線変異時間の決定
（１）ステップ１のように、変異出発酵母菌株の菌液を得る。
（２）１０ｍｌの変異出発菌株懸濁液を取り、６０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心した後に上澄み液を除去し、５０ｍｌの生理食塩水を添加して振とうして均一にかき混ぜ、６０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心した後に上澄み液を除去し、５０ｍｌの生理食塩水を添加して振とうして均一にかき混ぜて懸濁液を得る。
（３）紫外線照射：まず紫外線灯を開いて２０ｍｉｎ予熱し、光波を安定する。５ｍＬの無菌ピペットで上記懸濁液４．５ｍＬを無菌の直径が９ｃｍのペトリ皿に移し、ペトリ皿に無菌ピンを添加する。懸濁液が入っているペトリ皿を磁力撹拌器に放置し、紫外線灯の下に垂直に放置し、２０ｓ照射し、暗い条件下で皿蓋を開き（紫外線灯の照射が均一であるように確保する）、紫外光の下に露出して照射し（１５Ｗの紫外線灯、距離が３０ｃｍである）、時間は、４０ｓ、６０ｓ、８０ｓ、１００ｓ、１２０ｓである。
（４）照射が完了した後、赤色光灯の下または暗い条件下で、変異後の酵母懸濁液を１０倍の希釈法で４個の勾配１０^−１、１０^−２、１０^−３、１０^−４に希釈し、各勾配はそれぞれ２００μＬを取ってＹＰＤ平板に塗布し、銀紙で包んで遮光する。各照射時間下で３個が平行で、３０℃で４８ｈ培養する。
（５）未変異の酵母懸濁液を１０倍の希釈法で５個の勾配１０^−１、１０^−２、１０^−３、１０^−４、１０^−５に希釈し、各勾配はそれぞれ２００μＬを取ってＹＰＤ平板に塗布し、対照とする。対照群は３個が平行で、３０℃で４８ｈ培養する。
（６）平板を計数し、テーブルを記録し、致死率を計算し、致死率曲線を製図する。それぞれ紫外線致死率が７０％−８０％、８０％−９０％、９０％−１００％の時の紫外線照射時間を決定する。致死率＝（対照群コロニー数−変異群コロニー数）／対照群コロニー数である。

実験結果：変異出発菌株に対して紫外線変異を行い、異なる濃度勾配の懸濁液をＹＰＤ平板に塗布し、成長コロニー数に基づき、致死率曲線を製図し、結果は図２に示すとおりである。致死率曲線図に基づき、致死率が７０−８０％、８０−９０％、９０−１００％の時の照射時間は、それぞれ１１０ｓ、１３０ｓ、１５０ｓである。

３．Ｐ−フルオロフェニルアラニンの最低のすべての致死濃度の確定
ＹＮＢＰの固体培地：６．７％のＹＮＢ、２０ｇ／Ｌのブドウ糖、１０ｇ／Ｌのプロリンを添加し、さらにＰ−フルオロフェニルアラニンを余分に添加し、濃度は、それぞれ０（対照群）、０．０４ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０６ｇ／Ｌ、０．０７ｇ／Ｌ、０．０８ｇ／Ｌ、０．０９ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌである。
（１）指数成長中期の懸濁液を、１０倍の希釈法で４個の勾配１０^−１、１０^−２、１０^−３、１０^−４に希釈し、１０^−４勾配の懸濁液２００μＬを取ってＹＰＤ平板に塗布する。
（２）３０℃で４８−７２ｈ培養する。コロニーを記録し、Ｐ−フルオロフェニルアラニン致死率曲線を製図する。
致死率＝（対照群コロニー数−変異群コロニー数）／対照群コロニー数である。
実験結果：Ｐ−フルオロフェニルアラニン致死率曲線は図３に示すとおり、ＹＮＢＰ平板上のＰ−フルオロフェニルアラニン濃度の増加につれ、酵母致死率は、絶えず増加し、Ｐ−フルオロフェニルアラニンの濃度が０．０９ｇ／Ｌに増加する時に酵母がすべて致死し、このためＰ−フルオロフェニルアラニンの最低のすべての致死濃度を０．０９ｇ／Ｌに決定する。

４．紫外線変異
ステップ２のように紫外線変異出発菌株を取得し、かつ、それに対して紫外線照射を行い、紫外線変異の総時間は、それぞれ１１０ｓ、１３０ｓ、１５０ｓである。

５．Ｐ−フルオロフェニルアラニン抗性スクリーニングとアルコール耐性スクリーニング
（１）Ｐ−フルオロフェニルアラニン抗性スクリーニング
Ｐ−フルオロフェニルアラニン抗性スクリーニング培地の配合：６．７％ＹＮＢ、２０ｇ／Ｌブドウ糖、１０ｇ／Ｌプロリン、Ｐ−フルオロフェニルアラニン０．０９ｇ／Ｌ、栄養寒天２０ｇ／Ｌ。
それぞれ紫外線変異菌懸濁液２００μＬを取ってＰ−フルオロフェニルアラニン抗性スクリーニング平板に塗布し、銀紙で包んで遮光する。各致死率下で３個の平板を作って、３０℃で７２ｈ培養する。
（２）アルコール耐性スクリーニング
アルコールスクリーニング培地の配合：酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、魚粉蛋白ペプトンの２０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、無菌アルコール１０％。
１）９６孔口オリフィスプレートリフィスプレートに孔口孔口あたり２０μＬのＹＰＤ液体培地を添加し、Ｐ−フルオロフェニルアラニン抗性スクリーニング後の突然変異菌株を孔口に接種し、３０℃で２４ｈ培養する。
２）９６孔口オリフィスプレートに孔口あたり２００μＬのアルコールスクリーニング培地を添加し、上のステップの各孔口の培養液を５％でこの孔口オリフィスプレートに接種し、３０℃で静止培養する。それぞれ１２ｈと２４ｈにマイクロプレートリーダーでＯＤ６００を測定する。
３）ＯＤ６００_１２ｈ、ＯＤ６００_２４ｈおよびＯＤ６００_２４ｈ−ＯＤ６００_１２ｈの値を計算し、数値がより高い変異酵母菌合計２２株を選び出す。

６．黄酒シミュレーション液発酵スクリーニング
黄酒シミュレーション液の製造：１ｋｇの蒸したライス（含水率が７０％である）に水１Ｌ、麦麹０．０５ｋｇを添加し、均一に撹拌し、６０℃で８ｈ保温し、４５００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心し、上澄み液を１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌する。
（１）２２株の突然変異菌株を、それぞれＹＰＤ平板に画線し、３０℃で２４ｈ培養する。
（２）それぞれ単一コロニーを選び出し、１０ｍｌのＹＰＤを含む５０ｍｌの遠心管に接種し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養する。
（３）５％の菌液を取って移し、２０ｍｌの黄酒シミュレーション液を含む５０遠心管に接種し、３０℃で、７ｄ静止発酵し、各群は、３個が平行する。
（４）高速液体クロマトグラフィー法で黄酒シミュレーション液中のβ−フェネチルアルコールの含有量を測定し、β−フェネチルアルコールの含有量が高い菌株をスクリーニングする。

高速液体クロマトグラフィー分析：
１）２ｍＬのサンプルを２ｍＬの遠心管に入れて遠心して菌体を除去し、遠心条件は、１２０００ｒｐｍ、１ｍｉｎである。
２）上澄み液１ｍＬを取り、０．２２μｍの水系膜を経過し、液相バイアル瓶に移して使用に備える。
３）Ｘ−ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラムを選択し、移動相は、メタノール：純水＝１：１であり、３０の℃条件下で１ｍＬ／ｍｉｎの流速でサンプリングし、サンプリング量が１０ｕｌである。

高速液体クロマトグラフィーは、黄酒シミュレーション発酵液中のβ−フェネチルアルコールの含有量を測定し、１−ｅ４の突然変異菌株のβ−フェネチルアルコールの平均含有量は、高目には１８５．０３２ｍｇ／Ｌであり（表１に示すとおり）、アルコール生産能力が高く、このためこの菌株を次のラウンドの常温等圧プラズマ変異の出発菌株とする。

表１．紫外線変異後の黄酒シミュレーション発酵液中のβ−フェネチルアルコールの含有量

実施例２：常温等圧プラズマ変異とスクリーニング
１．常温等圧プラズマ変異と黄酒シミュレーション液発酵スクリーニング
第一ラウンドの紫外線変異後に菌株１−ｅ４を選択して常温等圧プラズマ変異出発菌株とする。１−ｅ４菌株をＹＰＤ振とうフラスコで３０℃で２４ｈ培養し、生理食塩水でＯＤ６００が０．６−０．８の懸濁液を作製し、常温等圧プラズマ変異を行い、変異時間が６０ｓであり、パワーが１００ｗであり、変異後の菌株を菌液に再懸濁し、ＹＰＤ平板に希釈して塗布し、３０℃で４８ｈ培養し、単一コロニーをＹＮＢＰ平板に画線し（Ｐ−フルオロフェニルアラニンの濃度が０．５ｇ／Ｌである）、ＹＮＢＰ平板の伸び方が良好な菌株に対して黄酒シミュレーション液発酵スクリーニングを行う。高速液体クロマトグラフィー法で黄酒シミュレーション液中のβ−フェネチルアルコールの含有量を測定し、β−フェネチルアルコールの含有量が高い菌株をスクリーニングする。

高速液体クロマトグラフィー法で８ｄ後の黄酒シミュレーション発酵液中のβ−フェネチルアルコールの含有量を測定する。３−ｃ１０、４−ｃ７、５−ｆ５突然変異菌株β−フェネチルアルコールの平均含有量は、高目であり、それぞれ、２１７．１９２ｍｇ／Ｌ、２５７．３８８ｍｇ／Ｌ、３３７．１６８ｍｇ／Ｌであり、該３株の菌株をそれぞれＢＹＣ１、ＢＹＣ２、ＢＹＣ３と命名する。酒醸造用酵母β−フェネチルアルコールの生産量が増加し、変異後の酒醸造用酵母のアルコール生産量がやや下がっても、得られた酒醸造用酵母は、依然としてアルコール発酵を行うことができる。

表２．常温等圧プラズマ変異黄酒シミュレーション発酵液中のβ−フェネチルアルコールの含有量

２．黄酒発酵スクリーニング
こうじ製造：５０ｍＬのＹＰＤ振とうフラスコで酵母菌株を接種し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで２４ｈ培養する。１ｋｇの蒸したライス（含水率が７０％である）に水１Ｌ、麦麹０．０５ｋｇを添加し、均一に撹拌し、６０℃で４ｈ保温し、冷却した後に５％で酵母菌液を接種し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで１６ｈ培養する。
（１）配合
蒸した米（含水率が７０％である）に等重量の浄水、２％の麦麹、５％のこうじを添加し、均一に撹拌する。
（２）発酵と撹拌
発酵温度が２８℃であり、配合が完了した後に１８ｈ、２４ｈ、３０ｈ、４２ｈ、５４ｈ、７８ｈ、１２６ｈ撹拌し、かつ、サンプリングする。５０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心して上澄み液サンプルを得て、指標検査に用いる。
（３）指標検査
１８ｈ、２４ｈ、３０ｈ、４２ｈ、５４ｈ、７８ｈ、１２６ｈの時に得られたサンプルに対し、その総酸（乳酸で計量する）、アルコール度、ｐＨを測定し、３項目の指標変化情況を観察し、かつ、高速液体クロマトグラフィー法で１２６ｈ時のサンプル中のβ−フェネチルアルコールの含有量を測定する。

本ラウンドの変異出発菌株と３株のスクリーニングした後の突然変異酵母菌株を用いて黄酒を発酵させ、アルコール生産能力は図４に示すとおりである：３株の正突然変異菌株は出発菌株と比べ、アルコール生産性能の差別が小さく、アルコール度は、いずれも１３％（ｖ／ｖ）以上に達し、アルコール発酵が良好である。３株の酵母は、前の６０ｈ時にアルコール発酵が急速で、６０ｈ後にアルコール含有量が基本的に安定する。酸度変化結果は図５に示すとおりである：３株の突然変異酵母発酵黄酒の酸度は、３−４ｇ／Ｌの間にあり、発酵につれて酸度は、やや上がり、かつ平坦に傾向する。ｐＨの変化は、図６に示すとおりである：ｐＨが３−４．５の間にあり、酒醸造用酵母は、アルコール発酵を良好に行うことができる。

黄酒発酵液中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、表３に示すとおり、ＢＹＣ１、ＢＹＣ２、ＢＹＣ３菌株を用いて黄酒を発酵させ、β−フェネチルアルコールの含有量は２１９．０８、２５４．９１、３６５．７０ｍｇ／Ｌであり、出発菌株発酵黄酒のβ−フェネチルアルコールの生産量は、１８８．０７ｍｇ／Ｌのみであり、３株の菌株β−フェネチルアルコールの生産量はそれぞれ出発菌株の１．１６倍、１．３５倍、１．９４倍であり、高いβ−フェネチルアルコールを多収量に生成する能力を有する。

表３．常温等圧プラズマ変異黄酒発酵液中のβ−フェネチルアルコールの含有量

黄酒発酵液中のイソブチルアルコール、イソアミルアルコール、酢酸−２−フェニルエチル、グリセリンは、風味物質とすることができ、黄酒全体の品質を高めることができ、その含有量は、表４に示すとおり、比較によって、ＢＹＣ３菌株の酢酸−２−フェニルエチルおよびグリセリンの含有量は、出発菌株およびＢＹＣ１とＢＹＣ２より明らかに高い。

表４．黄酒発酵液中のイソブチルアルコール、イソアミルアルコール、酢酸−２−エチル、グリセリンの含有量表

以上の比較結果を纏めると、ＢＹＣ３のβ−フェネチルアルコールの生産量が高く、かつ、イソブチルアルコール、イソアミルアルコール、酢酸−２−フェニルエチルの含有量も高目である。ＢＹＣ３菌株をＹＰＤ固体培地平板に画線し、３０℃で２４ｈ培養し、コロニー形態は図７に示すとおりである。ＢＹＣ３菌株を中国典型培養物保存センターに保存し、保存番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５である。ＢＹＣ３菌株を黄酒発酵体系に接種し、アルコール発酵性能が良好で、得られた黄酒中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、３６５．７０ｍｇ／Ｌである。

３．ＹＰＤ培地中のβ−フェネチルアルコールを多収量に生成する菌株の対照実験
ＢＹＣ３菌株（即ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５）、野生菌株、商業活性乾燥酵母、酒醸造用酵母パターン菌株Ｗ３０３（遺伝子型Ｍａｔａ／ａ、ｕｒａ３−１、ｌｅｕ２−３，１１２、ｔｒｐ１−１、ｈｉｓ３−１１、１５、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００）、酒醸造用酵母パターン菌株Ｓ２８８ｃ（遺伝子型ＭＡＴα ＳＵＣ２ ｇａｌ２ ｍａｌ２ ｍｅｌｆｌｏ１ ｆｌｏ８−１ ｈａｐ１ ｈｏ ｂｉｏ１ ｂｉｏ６）を用いて比較発酵実験を行う。５株の菌株をＹＰＤ平板活性化後にＹＰＤ振とうフラスコに接種し、更にそれぞれ５％で順次ＹＰＤ振とうフラスコとＹＰＤ振とうフラスコに接種する（１ｇ／Ｌのフェニルアラニンを添加する）。

実験結果は図８に示すとおり、酒醸造用酵母菌株ＢＹＣ３のβ−フェネチルアルコールの生産量は、野生菌株、商業活性乾燥酵母、Ｗ３０３とＳ２８８ｃより明らかに高く、ＢＹＣ３酵母がＹＰＤ培地中のβ−フェネチルアルコールの生産量は、３１．６ｍｇ／Ｌに達し、１ｇ／Ｌのフェニルアラニンを添加する時の５０．９％であり（野生酵母が２１％であり、商業酵母が２７％であり、Ｗ３０３が２２％であり、Ｓ２８８ｃが２０％である）、酵母のＢＹＣ３のβ−フェネチルアルコールを多収量に生成する性能が著しく、従来の酒醸造用酵母菌株より明らかに高い。

実施例３：β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母が黄酒における使用
１．黄酒の醸造プロセス１
（１）こうじ作製：５０ｍＬのＹＰＤ振とうフラスコで酵母菌株を接種し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで、２４ｈ培養する。１ｋｇの蒸した米（含水率が７０％である）に水１Ｌ、麦麹０．０５ｋｇを添加し、均一に撹拌し、６０℃で４ｈ保温し、冷却した後に５％で酵母菌液を接種し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで１６ｈ培養する；酵母は、β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母ＢＹＣ３（即ちＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５）を選択する。
（２）蒸した米（含水率が４０％である）に、等重量の浄水、１５％の麦麹、５％のこうじを添加し、均一に撹拌する。
（３）発酵と撹拌：
発酵温度が２８℃であり、ブランキングが完了後にタイミンし始め、８ｈをおくごとに撹拌し、４８ｈに至る時に合計で６回撹拌する。５−７日間発酵し、アルコール度指標を検査してそれが上昇しない時に発酵を終了する。
（４）圧搾：発酵が終了した後、発酵マッシュをプレート・フレーム式フィルターを経過して圧搾して清酒を得る。
（５）煎じ：清酒を煎じ滅菌器を経過して８５℃で３０ｍｉｎ滅菌する。
（６）熟成：煎じた後に清酒を熟成缶に入れて６カ月熟成させる。
（７）濾過：熟成した後に清酒を珪藻土フィルターと膜フィルターで雑菌と不純物を除去する。
（８）滅菌と缶詰め：滅菌器を経過し、８５℃で３０ｍｉｎ滅菌し、熱く缶詰めする。

得られた製品を高速液体クロマトグラフィー法で検出してβ−フェネチルアルコールの含有量は、４１０ｍｇ／Ｌに達し、アルコール度は、１７％（ｖ／ｖ）であり、酢酸エチルの含有量は、２４ｍｇ／Ｌであり、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、５６μｇ／Ｌである。

２．黄酒の醸造プロセス２
（１）こうじ作製：本実施例の上記プロセス１に示すとおりである。
（２）もち米を粉砕し、もち米の質量の２．５倍の浄水を添加し、高温澱粉酵素を１１０℃で４０ｍｉｎ高温糊化し、３５℃に温度を下げて砂糖化酵を添加して４０ｍｉｎ砂糖化させ、２８℃に温度を下げ、総全体の４％で麦麹を添加し、総体積の１０％でこうじを添加し、均一に撹拌する。
（３）他のステップは本実施例のプロセス１に示すとおりである。
得られた製品を高速液体クロマトグラフィー法で検出してβ−フェネチルアルコールの含有量は、１８５ｍｇ／Ｌに達し、アルコール度は、１４％（ｖ／ｖ）であり、酢酸エチルの含有量は、１４ｍｇ／Ｌであり、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、２４μｇ／Ｌである。

３．黄酒発酵マッシュ中のβ−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母菌株の対照実験
ＢＹＣ３菌株、野生菌株、商業活性乾燥酵母、酒醸造用酵母パターン菌株Ｗ３０３（遺伝子型Ｍａｔａ／ａ、ｕｒａ３−１、ｌｅｕ２−３，１１２、ｔｒｐ１−１、ｈｉｓ３−１１、１５、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００）、酒醸造用酵母パターン菌株Ｓ２８８ｃ（遺伝子型ＭＡＴα ＳＵＣ２ ｇａｌ２ ｍａｌ２ ｍｅｌｆｌｏ１ ｆｌｏ８−１ ｈａｐ１ ｈｏ ｂｉｏ１ ｂｉｏ６）を用いて比較発酵実験を行う。５株の菌株の黄酒の醸造方法は本実施例の上記黄酒の醸造プロセス１に示すとおりである。

結果は以下のとおりである：酒醸造用酵母菌株ＢＹＣ３のβ−フェネチルアルコールの生産量（４１０ｍｇ／Ｌ）は、野生菌株、商業活性乾燥酵母（８７ｍｇ／Ｌ）、Ｗ３０３（８１ｍｇ／Ｌ）とＳ２８８ｃ（７３ｍｇ／Ｌ）より明らかに高い。酒醸造用酵母菌株ＢＹＣ３のアルコール度は、１７％（ｖ／ｖ）に達し、商業活性乾燥酵母ＢＹＣ３、Ｗ３０３、Ｓ２８８ｃのアルコール度は、それぞれ１６．５％（ｖ／ｖ）、１２．４％（ｖ／ｖ）、１３．１％（ｖ／ｖ）である。菌株ＢＹＣ３のβ−フェネチルアルコールを多収量に生成する性能が著しく、従来の酒醸造用酵母菌株より明らかに高く、また高いアルコール生産能力を有すると意味する。酵母菌株ＢＹＣ３が生成した酢酸−２−フェニルエチルの濃度は、５６μｇ／Ｌに達し、野生菌株の４．５倍であり、商業活性乾燥酵母の４．３倍であり、Ｗ３０３の５倍であり、Ｓ２８８ｃの５．７倍である。酵母菌株ＢＹＣ３が生成したイソアミルアルコールの濃度は、野生菌株の１．７倍であり、商業活性乾燥酵母の１．８倍であり、Ｗ３０３の２．１倍であり、Ｓ２８８ｃの２．４倍である。

実施例４：β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母が料理酒における使用
１．料理酒の醸造プロセス１
実施例３中の黄酒の醸造プロセス１に従って黄酒を取得し、食塩１０％を添加し、煎じ滅菌器を経過して８５℃で３０ｍｉｎ滅菌して熱く缶詰めする。
得られた製品を高速液体クロマトグラフィー法で検出してβ−フェネチルアルコールの含有量は、４５０ｍｇ／Ｌに達し、アルコール度は、１５％（ｖ／ｖ）であり、酢酸エチルの含有量は、２０ｍｇ／Ｌであり、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、５０μｇ／Ｌである。
２．黄酒の醸造プロセス２
実施例３中の黄酒の醸造プロセス２に従って黄酒を取得し、食塩１０％を添加し、滅菌器を経過して８５℃で３０ｍｉｎ滅菌して熱く缶詰めする。β−フェネチルアルコールの含有量は、１４０ｍｇ／Ｌに達し、アルコール度は、１２％（ｖ／ｖ）であり、酢酸エチルの含有量は、１０ｍｇ／Ｌであり、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、２０μｇ／Ｌである。

実施例５：β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母が醸造食酢固態発酵における使用
実施例３中のプロセス１で黄酒を発酵させ、酢酸発酵原料とする。
酢酸発酵は、固態発酵プロセスを採用する：ぬか、ふすまの皮、黄酒はを１：４：１０の比率で均等にかき混ぜ、５％の酢モロミに接種し、接種した後１−２日間内に、毎日材料の表面からモロミをひっくり返し、温度が３５−４０℃である。６−８日間に材料の底部までひっくり返す。８−１２日間に、毎日底部からモロミをひっくり返し、温度は、自然に下がる。酢モロミの中から分離して生酢を得て、８５℃で３０ｍｉｎ滅菌した後に１２カ月熟成する。缶詰めする前に高温滅菌を経た後に熱く缶詰めする。
得られた固態発酵醸造食酢中の酢酸の含有量は、６０ｇ／Ｌであり、β−フェネチルアルコールの含有量は、３００ｍｇ／Ｌに達し、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、４５μｇ／Ｌである。

実施例６：β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母が醸造食酢液態発酵における使用
実施例３中のプロセス１で黄酒を発酵させ、酢酸発酵原料とする。

酢酸発酵は、液態発酵プロセスを採用する：黄酒を浄水で４倍希釈した後に、５％の培養した酢酸菌の菌液を接種し、１Ｌ／ｍｉｎ酸素を供給し、かつ、撹拌し、発酵体系中のアルコール含有量が１％未満になる時、ロットを分けて黄酒を添加し、酢酸発酵体系中のアルコールの含有量が１％−４％に制御され、発酵体系中の酢酸含有量が約８０ｇ／Ｌである時に遠心分離し、液態食酢を得る。高温滅菌を経た後に熱く缶詰めする。得られた液態発酵醸造食酢中のβ−フェネチルアルコールの含有量は、１００ｍｇ／Ｌに達し、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、３６μｇ／Ｌである。

実施例７：β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母が醸造醤油の高い食塩稀態発酵における使用
醸造醤油は高い食塩稀態法発酵を選択し、脱脂大豆と小麦を１：１の比率で均等にかき混ぜて十分に蒸す。コウジカビの接種量は、１０％であり、温度を３０℃に制御し、２倍の材料質量の食塩水を添加し、醤油マッシュの食塩含有量が１８％であり、含水量が６５％であり、均一に撹拌する。ＢＹＣ３酵母をＹＰＤ振とうフラスコで培養し、５％の接種量で一部の十分に蒸して冷却した後の脱脂大豆と小麦中に接種し、２倍の体積の浄水を添加し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで２４ｈ培養してＢＹＣ３こうじを作製し、醤油マッシュに添加することを待つ；醤油モロミの初期発酵温度が１５℃であり、発酵につれて温度が１５−３５℃に上昇し、温度が２０℃に上昇する時にＢＹＣ３こうじに接種する。発酵時間が５カ月である。

発酵が終了した後の醤油マッシュをプレート・フレーム式フィルターを経過して圧搾し、醤油モロミ酒を除去する。圧搾が終了した後に珪藻土濾過と膜濾過を行い、沈澱を除去する。濾過して澄ました醤油を８５℃で３０ｍｉｎ滅菌して熱く缶詰する。β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母は高い食塩稀態法発酵に用いられ、得られた醤油製品には、β−フェネチルアルコール２００ｍｇ／Ｌを含む。

実施例８：β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母が醸造醤油の低い食塩固態発酵における使用
醸造醤油は低い食塩固態法発酵を選択し、脱脂大豆と小麦を１：１の比率で均等にかき混ぜて十分に蒸す。コウジカビの接種量は、１０％であり、温度を３０℃に制御し、２倍の材料質量の食塩水を添加し、醤油マッシュの食塩含有量が７％であり、含水量が４０％であり、均一に撹拌する。ＢＹＣ３酵母をＹＰＤ振とうフラスコで培養し、５％の接種量で一部の十分に蒸して冷却した後の脱脂大豆と小麦中に接種し、１倍の体積の浄水を添加し、３０℃、２００ｒ／ｍｉｎで２４ｈ培養し、ＢＹＣ３こうじを作製して醤油マッシュ発酵体系に接種し、製品の温度を４０℃に制御する。発酵時間が１５ｄである。

発酵が終了した後の醤油マッシュの不純物と沈殿を除去する。濾過して澄ました醤油を８５℃で３０ｍｉｎ滅菌して熱く缶詰する。β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母は低い食塩稀態法発酵に用いられ、得られた醤油製品には、β−フェネチルアルコール５０ｍｇ／Ｌを含む。

実施例９：β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酵母が白酒における使用
１．白酒の醸造プロセス１
二ラウンド発酵法を採用し、第一ラウンドに発酵時にコーリャンを十分に蒸した後、２８℃に空冷して温度を下げ、４％のコウジカビを添加し、２８℃で、２４ｈ培養する。籾１０％、麦麹１５％、ふすまの皮８％、１％でＹＰＤ振とうフラスコに接種して培養するＢＹＣ３酵母を添加し、３０日間密閉発酵した後に酒を蒸す。二回発酵する時に中温小麦麹１０％、１％でＹＰＤ振とうフラスコに接種して培養するＢＹＣ３酵母を添加し１５日間発酵した後に酒を蒸す。二種類の酒を混和してアルコール度を６５％（ｖ／ｖ）にし、β−フェネチルアルコールの含有量は、１１０ｍｇ／Ｌであり、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、６４μｇ／Ｌである。
２．白酒の醸造プロセス２
コーリャン４０％、小麦１０％、トウモロコシ５％、米２５％、もち米２０％を十分に蒸した後、空冷した後に温度が２５℃であり、使用量はぬか２０％で、麦麹２０％で、水分３０％で、１％でＹＰＤ振とうフラスコに培養されたＢＹＣ３酵母を接種した。温度が２０℃で、湿度が７０％で、６０日間発酵し、蒸留して３８％の白酒を得る。β−フェネチルアルコールの含有量は、５０ｍｇ／Ｌであり、酢酸−２−フェニルエチルの含有量は、２６μｇ／Ｌである。

実施例１０：チョークベリー酒の芳しさを増強する醸造方法
（１）チョークベリー果実を洗浄し、破砕と圧搾を行い、ラミネーションで分離してチョークベリージュースを得る；
（２）チョークベリージュースの砂糖含有量に基づいて砂糖を追加し、１７ｇ／Ｌの砂糖が１度のアルコールに転化する換算関係に従い、発酵状況に基づいて追加する白砂糖の量を決定し、均一に撹拌する；
（３）ピロ亜硫酸カリウム１６０ｍｇ／Ｌ、ペクチナーゼ１００ｍｇ／Ｌを流加し、缶に入れて均一に撹拌する；
（４）培養液活性化：ＹＰＤ培地中にＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ２０１６７８５を２８℃で１２〜２４ｈ静止培養し、５％の接種量で５０ｇ／Ｌの砂糖を含むフルーツジュース中に接種して２８℃で１６ｈ以上静止培養する。
（５）活性化した培養液を発酵缶に接種し、前発酵を行う。接種した後、温度を２３−２５℃に制御し、１２−２４ｈ後に発酵を起動し、発酵を起動した後に温度を２０℃−２３℃に制御する；２４ｈをおくごとにアルコール度、残砂糖、酸度、ｐＨを測定する。
（６）残砂糖が６０ｇ／Ｌ未満になる時、フルーツジュースの発酵アルコール度を要求に達させるために、１７ｇ／Ｌの砂糖が１度のアルコールに転化する換算関係に従い、発酵状況に基づいて白砂糖を追加するする必要があるか否かおよび追加量を判定する；残砂糖が４ｇ／Ｌになる時、酒体の表面が沈静化し、気泡が少なく、上層の酒液が澄みきっている時、前発酵が終了し、前発酵時間は、１０ｄ左右である。
（７）前発酵が終了した後、発酵液を珪藻土で濾過し、発酵液中に０．０４ｇ／Ｌの二酸化硫黄を添加して後発酵に移行する；
（８）後発酵温度を２０℃以下に制御し、２‰のベントナイト澄まし剤を添加し、十分に混合し、２０ｄ前後である；
（９）濾過する：静置して澄まして終わった時、発酵缶の底部の酒脚を排出し、上部液体を珪藻土で濾過し、珪藻土で濾過した後に膜フィルターで精密濾過する。
発酵が完了後に液体クロマトグラフィー法を採用してβ−フェネチルアルコールの含有量を測定し、ここでエンジェル商業酒醸造用酵母発酵β−フェネチルアルコールの含有量は、６１ｍｇ／Ｌであり、酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１６７８５を利用して発酵したチョークベリー酒β−フェネチルアルコールの含有量は３５０ｍｇ／Ｌに達することができる。

実施例１１：酒醸造用酵母ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５凍結乾燥粉末を用いて果実酒の芳しさを増強する醸造方法
実施例１０中に活性化したＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ ２０１６７８５培養液を採用する；本実施例中には２‰のＣＣＴＣＣ ＮＯ Ｍ２０１６７８５凍結乾燥粉末を添加し、３８℃で３０ｍｉｎ−６０ｍｉｎ撹拌して乾燥菌体に水を十分に吸入させ、また消泡の目的を達成し、他のステップは実施例１０と同様である。得られた果実酒β−フェネチルアルコールの含有量は、３２５ｍｇ／Ｌである。
ここで、実施例１０と異なる菌株発酵を採用するチョークベリー果実酒の結果は、表５に示すとおりである。
表５．異なる菌株発酵のチョークベリー果実酒の結果比較

実施例１２：サンザシ酒の芳しさを増強する醸造方法
サンザシ果実のペクチン含有量は、３％〜７％に達し、果実を破砕した後に膠着状態を呈し、このため実施例１０中のステップ（１）破砕時に４０〜５０℃の温水を添加することができ、水量をサンザシの量の１倍以内に制御する；５ｍｉｎ加熱して沸騰させた後、ジュースを浸出して取得する。沸騰過程において製品酒のアルコール度要件に応じてジェリーの砂糖度、酸度を調整することができる。ジュースの浸出取得が終了した後にジェリーの温度を４０℃前後に下げ、ペクチナーゼとＳＯ_２を添加し、均一に撹拌して放置し、発酵用のフルーツジュースとして、他のステップは、実施例１０と同様である。得られたサンザシ酒β−フェネチルアルコールの含有量は、２４３ｍｇ／Ｌであり、アルコール度は、１３％（ｖ／ｖ）に達する。

実施例１３：桑の実酒の芳しさを増強する醸造方法
実施例１０中に原料を桑の実に変え、他のステップと実施例１０と同様である。得られた桑の実酒β−フェネチルアルコールの含有量は、３０５ｍｇ／Ｌであり、アルコール度は、１３％（ｖ／ｖ）に達することができる。

実施例１４：ヤマモモ酒の芳しさを増強する醸造方法
実施例１０中に原料をヤマモモに変え、他のステップと実施例１０と同様である。得られたヤマモモ酒β−フェネチルアルコールの含有量は、２１２ｍｇ／Ｌであり、アルコール度は、１４．５％（ｖ／ｖ）に達することができる。

Claims (11)

1. β−フェネチルアルコールを高収量に生成する酒醸造用酵母菌株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であって、２０１６年１２月２６日に中国典型培養物保存センターに保存され、保存アドレスは、中国武漢の武漢大学であり、保存番号は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０１６７８５である酒醸造用酵母菌株。
2. 請求項１に記載の酒醸造用酵母菌株を含む微生物菌剤。
3. 発酵食品の製造における、請求項１に記載の酒醸造用酵母菌株または請求項２に記載の微生物菌剤の使用。
4. 請求項１に記載の酒醸造用酵母菌株または請求項２に記載の微生物菌剤を発酵剤または主な発酵剤として発酵させることを含む、発酵食品の製造方法。
5. 前記発酵食品は、酒類、食酢または醤油である、請求項４に記載の製造方法。
6. 前記酒類は、黄酒、料理酒、白酒または果実酒である、請求項５に記載の製造方法。
7. 前記発酵食品は、黄酒であり、請求項１に記載の酒醸造用酵母をこうじとすることを含む、請求項４または５に記載の製造方法。
8. 前記発酵食品は、料理酒であり、まず請求項１に記載の酒醸造用酵母を利用してこうじとして黄酒を得て、更に得られた黄酒を利用して料理酒を製造して得られることを含む、請求項４または５に記載の製造方法。
9. 前記発酵食品は、食酢であり、まず請求項１に記載の酒醸造用酵母を利用してこうじとして黄酒を得て、更に得られた黄酒を利用して酢酸発酵原料として醸造して得られることを含む、請求項４または５に記載の製造方法。
10. 前記発酵食品は、白酒であり、白酒が発酵タンクに入って発酵する時に請求項１に記載の酒醸造用酵母を余分に添加して得られることを含む、請求項４または５に記載の製造方法。
11. 前記発酵食品は、果実酒であり、前記果実酒は、桑の実のジュース、サンザシ酒、ヤマモモの実のジュース、チョークベリージュース中の一つまたは二つ以上を一定の比率で混合して発酵させて得られることを含む、請求項４または５に記載の製造方法。

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