CN111534445B - 产β-苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株、其培养方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种产β‑苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株(Pichia kudriavzevii)、其培养方法及其应用。该菌株已于2020年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.19729；该菌株具有较好的糖耐受性、乙醇耐受性和苯乙醇耐受性，生长pH和温度范围宽广；所述菌株能够生物转化L‑苯丙氨酸制备β‑苯乙醇，经检测，该菌株β‑苯乙醇产量可达5.09g/L，有利于该菌株在β‑苯乙醇工业化生产中的应用，具有反应条件温和、不受季节影响、周期较短、成本较低、无污染等优点。

Description

产β-苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株、其培养方法及其 应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及产β-苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株、其培养方法及其应用。

背景技术

白酒是中国历史悠久的饮品，根据喜好不同可 酿制出多种香型的白酒，如清香型、浓香型、酱香型、芝麻香型、药香型等八大香型。近些年来，由于技术的发展及人们对食品安全风味的高要求，越来越多的研究者开始研究白酒中的风味物质。据文献报道，白酒中已检测出1737 种微量风味挥发性物质，醇类200余种。其中，经固相微萃取技术及GC-O技术可测得β-苯乙醇为大曲香味体系中组成成分之一，是白酒中重要的呈味物质。由此可见，β-苯乙醇在白酒中有较高的研究价值。

β-苯乙醇是一种具有玫瑰香味的无色液体，易挥发，溶于乙醇等有机溶剂，存在于多种天然植物精油中，特别是在玫瑰精油中的含量高达60％。香柔甜和的β-苯乙醇是合成香料重要原料的之一，主要用于玫瑰、焦糖、蜂蜜和其他果香型食品香精以及各种酒用香精和烟用香精的配制，同时，β-苯乙醇也可作为抑菌剂使用。因此，吸引了更多的学者对β-苯乙醇的生产进行研究。常见的β-苯乙醇合成方法为化学合成法，比如苯-环氧乙烷法、苯乙烯法、甲苯法等。但是，化学合成法常会伴随副产物的生成，并且很难去除，所以无法得到纯度较高的β-苯乙醇。

由于人们对β-苯乙醇纯度及安全、低成本、短时间的要求，生物转化合成法逐渐开始研究。目前，生物合成β-苯乙醇的途径有利用芳香族氨基酸从头合成的苯丙酮酸途径及利用L-苯丙氨酸合成的艾氏途径。研究表明，酿酒酵母毕赤酵母、马克斯克鲁维酵母等菌可在发酵生长的过程中合成苯乙醇。与化学合成法相比，生物转化法有副产物及有害物质含量低、能够大规模工业生产、生产周期不受季节影响且时间较短、反应条件温和、成本较低等优点。

随着技术和时间的发展，在化学合成β-苯乙醇逐渐成熟下，人们对天然产品要求越来越高，对化学合成物质产生抵触心理，以及植物提取苯乙醇受到区域、气候等因素的影响，微生物代谢过程产生β-苯乙醇成为最佳的发展方法。本文选用天然酿酒酵母合成白酒中的香味及呈味物质β- 苯乙醇为目的进行筛选，从而得到高产β-苯乙醇的酿酒酵母菌株，进行发酵条件优化，为酿造白酒提高β-苯乙醇的浓度提供理论依据。

发明内容

针对天然绿色β-苯乙醇不能满足市场需求的问题，以及提高传统酿造食品白酒中β-苯乙醇含量，提升白酒品质的实际应用，本发明目的在于提供一种从白酒酒曲中新分离的高产β-苯乙醇的菌株，命名为YF1702，并提供YF1702产β-苯乙醇的培养基及培养方法与应用。

本发明涉及的酵母是通过从泸州老窖酒曲筛选获得酵母菌中通过摇瓶发酵产苯乙醇筛选而得，为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，该菌株已于2020年4月26日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19729。

本发明首先提供一株库德里阿兹威毕赤酵母菌株(Pichia kudriavzevii)，其已于2020年4月 26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.19729。

进一步地，本发明提供所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌株在制备β-苯乙醇中的应用。

本发明还提供一种利用所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌株制备β-苯乙醇的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)对所述库德里阿兹威毕赤酵母菌株接种于液体种子活化培养基中，获得种子活化液；

(2)将步骤(1)获得的种子活化液接种于液体发酵培养基中培养；

(3)从培养液中回收β-苯乙醇。

在一个优选实施方式中，所述步骤(1)中的培养条件是在26-30℃、160-200r/min条件下，活化20-30h。

进一步地，所述步骤(1)中的液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，pH正常，蒸馏水定容。

在一个优选实施方式中，根据交互多因素实验得到的优选方式，其中所述步骤(2)中培养条件为装液量20-30mL/250mL，接种量0.3％-0.5％(v/v)，25-27℃，以180-240r/min培养50-60h，可得到成熟的β-苯乙醇转化液，其中所述步骤(2)中液体发酵培养基如下：葡萄糖45-55g/L，硫酸镁0.15-0.25g/L，磷酸二氢钾4-6g/L，酵母浸粉4-7g/L，L-苯丙氨酸9.5-12g/L，pH 2.0-2.5，吐温-60为28-36g/L，蒸馏水定容。

更优选地，所述步骤(2)中培养条件为装液量24-26mL/250mL，接种量0.35％-0.45％(v/v)， 25-27℃，以200-220r/min培养54-58h，可得到成熟的β-苯乙醇转化液，其中所述步骤(2)中液体发酵培养基如下：葡萄糖48-52g/L，硫酸镁0.18-0.22g/L，磷酸二氢钾4.5-5.5g/L，酵母浸粉5-6g/L，L-苯丙氨酸10-11.5g/L，pH 2.2-2.4，吐温-60为30-35g/L，蒸馏水定容。

在一个具体的实施方式中，所述步骤(2)中培养条件为装液量25.5mL/250mL，接种量0.4％ (v/v)，26℃，以210r/min培养56h，可得到成熟的β-苯乙醇转化液，其中所述步骤(2)中液体发酵培养基如下：葡萄糖50g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5g/L，酵母浸粉6g/L，L-苯丙氨酸10.7g/L，pH 2.3，吐温-60为32g/L，蒸馏水定容。

本发明的有益效果：

本发明筛选出的菌株库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)YF1702来源于白酒酿造环境中，相对于已知的菌株，具有β-苯乙醇产量高的特点，经检测，该菌株β-苯乙醇产量可达到5.09 g/L；所述菌株的β-苯乙醇和乙醇耐受性高，其中其能在9％的乙醇浓度下生长，属于高耐受乙醇菌株；该菌株在固体培养基上的β-苯乙醇耐受浓度为5.0g/L，也属于高耐受β-苯乙醇的菌株。此外，其pH值耐受范围很广(pH2-10范围内都能很好的生长)，有利于该菌株生产β-苯乙醇及其在白酒酿造中的应用。进一步地，本发明通过对库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) YF1702发酵特性的研究，优化了培养基成分及培养条件，提高了该菌β-苯乙醇的产量。

本发明的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)YF1702，于2020年4月26日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19729。

附图说明

图1是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株在YPD培养基上的菌落形态照片。

图2是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株的细胞形态照片(放大400倍)。

图3是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株系统进化发育树。

图4是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株葡萄糖耐受性结果。

图5是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株蔗糖耐受性结果。

图6是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株最适pH测定结果。

图7是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株最适温度测定结果。

图8是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株乙醇耐受性结果。

图9是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株氯化钠耐受性结果。

图10是库德里阿兹威毕赤酵母YF1702菌株苯乙醇耐受性结果。

图11是β-苯乙醇标准品制作的标准曲线。

图12是葡萄糖浓度对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图13是酵母浸粉浓度对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图14是L-苯丙氨酸浓度对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图15是pH对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图16是温度对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图17是转速对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图18是装液量对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响

图19是接种量对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图20是表面活性剂种类对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图21是吐温-60浓度对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图22是L-苯丙氨酸添加时间对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图23是培养时间对库德里阿兹威毕赤酵母YF1702合成β-苯乙醇的影响。

图24各因素两两交互作用对苯乙醇浓度影响的3D曲面图。(a)pH和L-苯丙氨酸浓度对苯乙醇浓度影响的曲面图；(b)pH和装液量对苯乙醇浓度影响的曲面图，(c)L-苯丙氨酸和装液量对苯乙醇浓度影响的曲面图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方式或实施例对本发明作进一步的阐述，以便更好的理解本发明。

下述实施例中对相关的操作或方法若无特别说明，都是本领域常规操作或方法。对试剂和仪器若无特别说明，则是常规可获得或商业途径可以购买得到的。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下述实施例所用培养基基本成分如下：

YPD培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，蒸馏水定容。

实施例中所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)YF1702菌株，2020年4月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19729。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例中所述β-苯乙醇标准品购自美国Sigma公司。

实施例1 YF1702菌株的分离

从不同的白酒生产企业收集大曲(白酒生产的起始原料)、酒糟(白酒蒸馏用的发酵谷物)或土壤中筛选获得酵母菌保藏于甘油管中，取100μl保藏在甘油管中的酵母菌，在无菌操作下加入 50mLYPD培养基中，28℃、180r/min培养24h，进行菌种活化。取活化后酵母菌100μL，在无菌操作下加入液体发酵培养基中，30℃、180r/min培养48h。液体发酵培养基配方为：葡萄糖100g/ L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5g/L，L-苯丙氨酸10g/L，初始pH值为自然pH。筛选能够转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇的菌株，并测定β-苯乙醇含量，最终于泸州老窖酒曲中获得一株编号 YF1702的菌株具有转化能力较好、能积累较高浓度β-苯乙醇的菌株，其来自于泸州老窖酒曲。

上述所获得的YF1702的菌株通过以下方法进行保存：(1)斜面保存：将纯化后的菌种接种至YPD斜面，放置培养箱中培养48-72h后，在4℃冰箱中保存。(2)甘油管保存：取1mL50％甘油于与1mL活化后菌液混合，于1.5mL无菌PE管中，-80℃下保存。

实施例2 YF1702菌株的鉴定

1、形态学特征：为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下形态学特征观察。

YPD培养基菌落形态和细胞观察：将实施例1中所获得的菌株纯培养体接种于YPD固体培养基上，于48h后观察其形态特征(图1)，结果如表1，将其在光学显微镜下放大400倍后观察，结果如图2，呈梭状，芽殖，无菌丝体。

表1 YF1702菌株形态培养特征

2、生理生化鉴定：对YF1702菌株进行以下生理生化测定：

(1)糖发酵实验：测试的糖类包括以下糖源：D-半乳糖、L-山梨糖、D-阿拉伯糖、D-(+)- 木糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、D-果糖。

糖发酵实验由以下步骤组成：①配制糖发酵培养基，分装于试管中，并加入杜氏小管，121℃灭菌20min；将上述糖浓度配成50mmol/L，经过滤(0.22μm)除菌，并将其与1.6％溴甲酚紫乙醇加入含有杜氏管的培养基中；②将活化好的菌种液接入以上发酵管中，每种糖类做三个平行实验，以不加测试糖、不接菌的发酵管作为空白对照，置于25℃下静置培养，每天观察杜氏小管中气泡量，以及颜色变化，并连续观察两周，以杜氏管中有气泡记为阳性(+)，表示该酵母能利用该糖进行发酵；无气泡记为阴性(-)，表示该酵母不能利用该糖进行发酵；颜色由紫色变黄色时，表示该酵母可利用该糖产酸。

(2)碳同化实验：鉴定所需同化碳源包括丙三醇、乙醇、甘露醇、可溶性淀粉、α-乳糖、 D-山梨糖、纤维二糖、菊糖、D-(+)-核糖、D-(+)-棉子糖。

碳同化实验包括以下步骤：①将上述物质配成20％的溶液，经过滤(0.22μm)除菌后，分别加入到含有杜氏管的碳源同化培养基中，并加入终浓度为0.0024％的溴百里酚蓝；②将活化后的酵母菌分别加入上述培养基中，每种碳源做三个平行，以不含碳源的试管作为空白对照，置于25 ℃培养两周，两周后观察，充分振荡试管，若试管中培养基变浑浊，则记为阳性(+)，反之为阴性(-)。

(3)氮同化实验：鉴定所需氮源同化物质包括尿素、亚硝酸钾、硫酸铵、硝酸钾、L-苯丙氨酸、硝酸铵、硝酸钠、亚硝酸钠和硝酸铝。

氮同化实验包括以下步骤：①将上述物质配成溶液，经过滤(0.22μm)除菌后，分别加入到氮源同化培养基中，使终浓度达到0.1mol/L；②将活化的酵母分别接入到上述试管中，每个氮源做三个平行，以不加氮源的培养基作为空白对照，置于25℃条件下培养一周，一周后观察。若试管中培养基变浑浊则记为阳性(+)，反之记为阴性(-)。

(1)菌种生理生化实验：①硫化氢实验培养基(g/L)：pH 7.0、NaCl 5、胰蛋白胨25、明胶120、牛肉膏7.5。115℃灭菌20min。加5mL10％FeSO₄·7H2O(0.22μ过膜除菌)，种子液穿刺接入，37℃，培养48h。②吲哚试验培养基(g/L)[17]：pH 7.8、NaCl 5、胰蛋白胨10。 121℃灭菌20min。接入50μL种子液放入37℃恒温培养箱中，两天后取出，往培养基中加入3～4 滴乙醚，用力摇匀，静置几分钟后，沿管壁加入3～4滴吲哚试剂。③甲基红试验培养基(g/L)：K₂HPO₄ 2、葡萄糖5、胰蛋白胨5，pH 7.0～7.2。灭菌30min，112℃。接入50μL种子液，放入 37℃恒温培养箱中，两天后取出，往培养基中加入2～3滴甲基红试剂，然后观察。④伏-普实验培养基(g/L)：NaCl 5、胰蛋白胨10，pH 7.8，灭菌20min，121℃。接50μL种子液，37℃培养48h。加7～8滴40％KOH溶液，再加5％的α-萘酚。摇匀，静置后看现象。⑤柠檬酸盐实验培养基(g/L)：NH₄H₂PO₄ 1、NaCl 5、K₂HPO₄ 1、柠檬酸钠2、琼脂20、MgSO4 0.2，pH 6.8。 121℃灭菌20min。加10mL1％溴百里酚蓝乙醇溶液。接种子液，于37℃培养箱，48h后观察。⑥淀粉水解实验培养基(g/L)：NaCl 5、牛肉膏5、琼脂20、胰蛋白胨10、可溶性淀粉2。121℃灭菌20min。平板划线接入种子液，放入37℃恒温培养箱中，24h后取出，往平板表面滴上碘液，轻轻旋转平板，使碘液完全接触培养基表面，观察。⑦尿素试验培养基(g/L)：尿素培养基斜面：胰蛋白胨1、琼脂15、NaCl 5、KH₂PO₄ 2，121℃灭菌20min。趁培养基还呈现液状时，加20g尿素(过膜除菌)，再加0.012g酚红。种子液斜面划线接入，35℃培养48h。⑧明胶水解实验培养基(g/L)：NaCl 5、胰蛋白胨10、明胶120、牛肉膏3，pH 7.2～7.4，121℃灭菌30min。将种子液穿刺接入，20℃，2～5天后观察。⑨石蕊牛乳试验培养基：100mL水加热溶解10.167g石蕊牛乳培养基。灭菌15min，在121℃下。接入50μL种子液，放入37℃恒温培养箱中，两天后取出观察。

上述YF1702菌株的生理生化实验结果如表2-5，可发酵葡萄糖和麦芽糖，利用琥珀酸、乙醇、乳酸、核糖、甘油和葡萄糖酸，能利用硫酸铵、乙胺和L-赖氨酸。

表2 YF1702菌株的糖发酵实验结果

表3 YF1702菌株的碳源同化实验结果

表4 YF1702菌株的氮源同化实验结果

表5 YF1702菌株的生理生化实验结果

3、分子生物学鉴定：对YF1702菌株的进行分子生物学测定，包括以下步骤：

(1)菌体培养：按照以下步骤进行培养：将实施例1中酵母菌株在YPD固体培养基中进行活化，在28℃条件下培养48h后接种于YPD液体培养基中，置于28℃、180r/min摇床中，培养24h。

(2)PCR扩增

菌株基因组DNA提取方法按照真菌DNA提取试剂盒方法。鉴定所用的扩增引物为酵母26S rDNA基因D1/D2区序列扩增引物，由以下引物组成：①正向引物，NL1： 5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′；②反向引物，NL4： 5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。鉴定的PCR条件包括以下：①PCR反应体系：LA PCR Buffer 2.5μL、正反引物各1μL、dNTP 2μL、LAtaq酶0.2μL、DNA 2μL、ddH₂O补至25μL；②PCR 扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30次循环，最后72℃延伸10min；③PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验。

(3)序列测定及系统发育树的构建

将(2)中的PCR扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，得到菌株PCR扩增片段的原始序列(SEQ ID NO.3)。采用序列图谱软件BioEdit，参照正向序列图谱，对序列人工校对。用校对后的26S rDNA D1/D2区序列，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索 (BLAST search)，与其它多株库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)的26S rDNA D1/D2 区序列有99％的相似性；为进一步显示供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及系统地位，根据同源性搜索结果，使用MEGA6.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及 neighbour-joining方法构建系统发育树；所构建的系统进化发育树如图3所示。

结合前述的生理生化特性和形态特征，将该菌鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。该菌株已于2020年4月26日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.19729。

实施例3 YF1702菌株的生长特性

YF1702菌株的生长特性，包括下述实验：

1、糖耐受性：以YPD培养基为基础，配制葡萄糖、蔗糖浓度为30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％，分装于250mL锥形瓶中，做三个平行，以2％的接种量，于28℃、180r/min 条件下培养24h，以测定OD₆₀₀作为高糖耐受性结果，结果如图4、5所示；由图4可以看出该菌株葡萄糖耐受能力超过70％以上，由图5可以看出该菌株蔗糖耐受能力超过80％，以上具有较好的糖耐受性。

2、生长pH：以YPD培养基为基础，配制pH为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 和13的液体培养基，接种已活化的待测菌株，于28℃、180r/min条件下培养24h，测定OD₆₀₀，结果如图6所示，由图可以看出本发明所涉及菌株生长pH范围比较宽广，为pH 2-10，其最适生长pH为6。

3、生长温度：将已活化的待测菌株接种于YPD培养基中，分别置于15、20、25、30、35、 40、45和50℃条件下180r/min培养24h，测定OD₆₀₀，结果如图7所示，由图可以看出，本发明所涉及菌株的温度生长范围为15-45℃，其最适生长温度为30℃。

4、乙醇耐受性：以YPD培养基为基础，按3％、6％、9％、12％、15％、18％、21％(v/v)的乙醇浓度加入至250mL锥形瓶中，做三个平行，以2％的接种量，于30℃、180r/min条件下培养24h，以测定OD₆₀₀表示其乙醇耐受性，结果如图8所示，由图可知该酵母能在9％的乙醇浓度下生长，属于高耐受乙醇菌株。

5、NaCl耐受性：以YPD培养基为基础，按0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％的NaCl 加入至250mL锥形瓶中，做三个平行，以2％的接种量，于30℃、180r/min条件下培养24h，以测定OD₆₀₀表示其NaCl耐受性，结果如图9所示，由图可知该酵母能在10％的NaCl浓度下生长，属于较高耐受盐菌株。

6、苯乙醇耐受性：将活化后的菌株Y1511接种于含有苯乙醇浓度为0.0-6.0g/L的YPD培养基中，于30℃、180r/min条件下培养24h，观察其生长情况，以YF1702接种于不含苯乙醇的培养基的生长情况为空白对照，其结果如图10所示，由图可知该菌株在固体培养基上的β-苯乙醇耐受浓度为5.0g/L。

实施例4 YF1702菌株制备β-苯乙醇

利用YF1702菌株制备β-苯乙醇步骤如下：

(1)从斜面上挑取1环库德里阿兹威毕赤酵母YF1702接入液体种子培养基中，在28℃、 180r/min条件下，活化24h，获得种子活化液；

(2)将(1)获得的种子活化液以0.2％(v/v)的接种量接种于液体发酵培养基，在30℃、 180r/min条件下培养48h，即得。

所述步骤(1)中的液体种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L， pH自然，蒸馏水定容。

所述步骤(2)中的液体发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5 g/L，L-苯丙氨酸10g/L，初始pH值为自然pH，蒸馏水定容。

产物和产物浓度的确定：采用高效液相色谱法确定和测定β-苯乙醇浓度，高效液相色谱 (Agilent 1260infinity)仪器参数为：C-18反相色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C-18，4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇：水＝1：1(v/v)，流速0.75mL/min，检测波长260nm，柱温30℃，进样量10μL。

(1)β-苯乙醇标准曲线的绘制

精确吸取0.2mLβ-苯乙醇标准品，用色谱纯甲醇定容至10mL，配制浓度为20g/L的贮备液，分别吸取贮备液0.0、0.25、0.5、0.75、0.8、1.5、1.75和2mL，再以色谱纯甲醇定容至10mL，得到0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0g/L的β-苯乙醇标准溶液。

将上述不同浓度梯度的β-苯乙醇标准溶液在上述条件下进行测定，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y作标准曲线。β-苯乙醇标准品出峰时间在13-14min之间，每一浓度重复测定3次，求均值绘制β-苯乙醇标准曲线，如图11所示，根据该曲线获得的方程式为y＝10^6x-1462.5 (R²＝0.9995)。

(2)样品的制备

取2mL发酵液于2mL离心管中，经10000r/min离心10min，取上清液1.5mL，经0.22μm水系滤膜过滤得到样品。

高效液相色谱(Agilent 1260 infinity)仪器参数为：C-18反相色谱柱(ZORBAXEclipse Plus C-18，4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇：水＝1：1(v/v)，流速0.75mL/min，检测波长260 nm，柱温30℃，进样量10μL。外标法测定β-苯乙醇。

高效液相色谱测定样品的峰面积带入标准曲线方程y＝10^6x-1462.5(R²＝0.9995)中，峰面积为y值，求出β-苯乙醇浓度x。

实施例5葡萄糖浓度优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，液体发酵培养基中葡萄糖浓度分别为2.5％(25g/L)、5.0％(50g/L)、10％(100g/L)、15％(150g/L)、20％(200g/L)和25％(250g/L)，以0.2％的接种量，在30℃、180r/min的条件下培养48h。用高效液相色谱法检测β-苯乙醇，通过图12可以看出，当葡萄糖浓度5％(50g/L)时，酵母YF1702利用葡萄糖合成苯乙醇含量最高，为2.83g/L。

实施例6酵母浸粉浓度的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例5基础上，选择酵母浸粉浓度为0-10g/L。以0.2％的接种量，在30℃、180r/min的条件下培养48h。由图13可以看出，在其浓度达到6g/L时，生成的苯乙醇含量最高为2.77g/L，故选择酵母浸粉的浓度为6g/L。

实施例7 L-苯丙氨酸浓度的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例6基础上，添加不同浓度 (0-30g/L)的L-苯丙氨酸，以0.2％的接种量，在30℃、180r/min的条件下培养48h。结果如图14。由图可知，当L-苯丙氨酸加入量为10g/L时，菌株YF1702合成β-苯乙醇产量为2.81g/L。

实施例8 pH优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例7基础上，调整初始培养基pH分布为1、2、3、4、5、6、7和自然(4.98)，以0.2％的接种量，在30℃、180r/min条件下培养48h。由图15可以看出，当pH为2时时，菌株YF1702合成β-苯乙醇的产量为2.84g/L。因此，YF1702合成苯乙醇培养基pH优选为2。

实施例9温度的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例8基础上，选择温度范围为20-32℃之间，以2℃为一个梯度，以0.2％的接种量培养48h。结果如图16。当温度为26℃时，菌株YF1702合成β-苯乙醇产量为3.20g/L。因此，YF1702合成苯乙醇的最适温度为26℃。

实施例10转速的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例9基础上，在不同转速(90、 120、150、180、210、240和270r/min)条件下培养，以0.2％的接种量培养48h。由图17可以看出，随着转速的升高，产生苯乙醇的含量出现先升高后下降的趋势，证明该菌为好氧菌。在转速为240r/min时，出现最高值，为3.28g/L。

实施例11装液量的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例10基础上，将0.2％的YF1702 种子活化液接种于25、50、75、100和125mL转化培养基中培养48h。由图18可以看出，当装液量为25mL时，菌株YF1702合成β-苯乙醇产量为3.29g/L。因此，YF170合成苯乙醇的优选装液量为25mL。

实施例12接种量的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例11基础上，分别以0.1％、 0.2％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％、6.4％和12.8％的接种量将YF1702种子活化液接种于转化培养基中培养48h。由图19可以看出，当接种量为0.4％时，菌株YF1702合成β-苯乙醇产量为3.32g/L。因此，YF1702合成苯乙醇的优选接种量为0.4％。

实施例13表面活性剂的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例12基础上，选择甘油、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、Triton X-100和Triton X-114以0.2％的添加量加入至液体发酵培养基培养48h，同时设置空白对照。由图20可以看出，当表面活性剂种类为吐温-60时，菌株YF1702合成β-苯乙醇产量为3.25g/L。因此，YF1702合成苯乙醇的优选表面活性剂种类为吐温-60。

实施例14吐温-60浓度的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例13基础上，选择吐温-60 浓度为0.2％-6.4％。以0.1％的接种量，在26℃、240r/min的条件下培养48h。由图21可以看出，在其浓度达到3.2％时，生成的苯乙醇含量最高为4.41g/L，故选择吐温-60的浓度为3.2％。

实施例15 L-苯丙氨酸添加时间的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例12基础上，在0、12、24、 36、48、60h时添加L-苯丙氨酸。由图22可以看出，在L-苯丙氨酸添加时间为0h时，生成的苯乙醇含量最高为3.43g/L，故选择0h时添加L-苯丙氨酸。

实施例16培养时间的优选

采用实施例4的方法培养酵母YF1702，不同之处在于，在实施例15基础上，以0.1％的接种量，在26℃、240r/min的条件下培养0、12、24、36、48、60及72h。由图23可以看出，在培养时间为60h时，生成的苯乙醇含量最高为3.12g/L，故选择培养时间为60h。

实施例17 Plackett-Burman实验

根据单因素实验结果，选取8个因素进行Plackett-Burman(PB)实验设计，包括初始酵母浸粉浓度(X₁)、L-苯丙氨酸浓度(X₂)、pH(X₃)、培养温度(X₄)、摇瓶转速(X₅)、装液量(X₆)、吐温-60浓度(X₇)和培养时间(X₈)。对每个因素分别选取高水平(1)和低水平(-1)，如表6所示，以苯乙醇浓度作为响应值。PB实验由Minitab软件17.1(Minitab,Inc.StateCollege, PA,USA)设计，并根据实验数据建立回归模型。

利用Minitab软件17.1(Minitab,Inc.State College,PA,USA)对该8个因素进行Plackett-Burman(PB)实验设计并进行实验，结果见表7。苯乙醇浓度的变化范围为0.63g/L～4.73 g/L。回归方程为

Y＝-1.236-0.0051×X₁+0.1264×X₂+0.7112×X₃+0.0512×X₄-0.00068×X₅-0.04547× X₆+0.0909×X₇+0.02314×X₈ (1)

其中Y值为响应值(苯乙醇浓度)。模型的充分性采用方差分析(ANOVA)检验。方差分析表明，该模型具有显著性。模型p值显著(0.000)，一般P值小于0.05为宜。由表8可知，对苯乙醇浓度具有显著影响的因素有L-苯丙氨酸浓度、pH、装液量、培养时间和培养温度，而其他因素对苯乙醇浓度无显著影响。因此，在后续实验中应对上述5个显著性因素进行进一步研究。

表6 Plackett-Burman设计各因素与水平

表7 Plackett-Burman实验设计与结果

表8 Plackett-Burman实验设计的因素水平及统计分析

注：“*”表示在5％水平显著(P<0.05)；“**”表示在1％水平显著(P<0.01)

实施例18最陡爬坡实验

根据Plackett-Burman实验的回归模型筛选出5个显著性因素，并根据这5个因素效应的大小比例设定其变化方向及其变化步长，进而设计最陡爬坡实验。通过最陡爬坡设计苯乙醇浓度最高的点将接近最优点，因此将苯乙醇浓度最高点作为RSM的中心点进行后续实验。

为了确定以上5个显著性因素的最佳区域，采用了最陡爬坡实验设计。根据Plackett-Burman 实验结果的回归分析(方程(1))，确定了各个因素的变化方向。其中pH、L-苯丙氨酸浓度、培养时间、培养温度四个变量对苯乙醇的产生呈现正效应，装液量呈现负效应。结果如表9所示，第三组实验中苯乙醇浓度最高，达到4.97g/L。因此，将第三组实验用作后续响应面实验的中心点，其他因素不变。

表9最陡爬坡实验各因素水平及结果

实施例19响应面分析法

通过最陡爬坡实验找到苯乙醇浓度最高区域后，采用响应面分析方法中的Box-Behnken实验设计(BBD,Design expert software 11.0,StatEase Inc.,Minneapolis,MN,USA)，根据PB实验和最陡爬坡实验分析确定的三个关键因素(pH(A)、L-苯丙氨酸浓度(B)和装液量(C))和中心点进行进一步研究，以增强苯乙醇浓度。每个因素取三个水平，分别以-1、0和1编码。

根据Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验结果，采用Box-Behnke实验设计三因素(pH、L- 苯丙氨酸浓度和装液量)三水平的响应面分析实验苯乙醇浓度Y作为响应值。每个因素取三个水平，分别编码-1、0、1，共运行17组实验，表10为实验设计及结果。由表可以看出，苯乙醇浓度的跨度变化很大，这种变化取决于不同的培养条件。在第5组实验中苯乙醇浓度达到最大值，为5.08g/L，第1组实验中苯乙醇浓度达到最小值，为3.88g/L。中心点重复五次实验，以减小误差。

通过对17组实验数据进行多元回归分析，经过回归方程拟合，各个因素对响应值的影响可用以下函数表示

Y＝4.96+0.2663×A+0.2500×B-0.1587×C-.0.525×AB-0.0650×AC+0.0475×BC-0.2210×A²-0.3 735×B²-0.2260×C² (2)

回归方程的方差分析和模型可信度分析见表11。由表11可知，该实验有较低的变异系数 (CV)，CV值越低，表明实验的可靠性越高，本实验中CV＝2.77％，说明实验结果可信。该方程的决定系数R²＝0.9555，说明苯乙醇产量的95.55％的样本变异是来自自变量，4.5％的变异量不能通过模型解释。式(2)的相关系数(R＝0.9775)接近1，表明实验结果与理论值有很强的相关性，线性项和二次项在1％水平上显著，外积在5％水平上显著。

根据表中的F-value和相应的P-value可得知，A(pH)、B(L-苯丙氨酸浓度)和C(装液量)对苯乙醇浓度具有显著性影响，因素的二次项不具有显著性影响。但各因素之间的相互作用对苯乙醇浓度具有显著性影响。

各因素两两交互作用对苯乙醇浓度的影响可由3D响应面图呈现(图24)。图24a的结果表明，当A(pH)在1.9-2.5范围内，B(L-苯丙氨酸浓度)在9.5-12.5g/L范围内时，苯乙醇的浓度高于4.5g/L。A(pH)和C(装液量)对该菌苯乙醇产量的影响表明，pH比装液量更重要(图 24b)。当pH升高时，苯乙醇浓度范围为3.90～5.08g/L，但苯乙醇的浓度并没有随着装液量积的变化而发生显著变化。图24c为B(L-苯丙氨酸浓度)和C(装液量)对苯乙醇浓度影响的3D图。L-苯丙氨酸浓度对苯乙醇浓度的影响大于装液量，当L-苯丙氨酸浓度增加时，苯乙醇的浓度在3.88～ 5.08g/L之间，而随着装液量的变化，苯乙醇的浓度变化不大。

利用Design-expert 11，以A(pH)＝2.31、B(L-苯丙氨酸浓度)＝10.66g/L和C(装液量)＝25.43mL/250mL。Y的最大预期值为5.11g/L。根据统计的结果设计实验,优化的工艺参数是:50g/L葡萄糖,pH值2.3,6.0g/L酵母浸粉,10.7g/L L-苯丙氨酸,26℃,摇瓶转速210r/min,装液量25.5mL/250mL,接种量0.4％(v/v),L-苯丙氨酸添加时间0h,培养时间56h和32g/L Tween-60。为了检验该模型预测最优响应的可靠性，并根据RSM得到的优化结果与期望函数，在最优水平上进行了验证实验。在选定的最佳工艺条件下，苯乙醇浓度为5.09g/L，比优化前的产量(2.33g/L) 提高了118.5％，实验产量接近预测值(5.11g/L)。预测结果与优化条件下的实验结果吻合较好，验证了RSM模型的正确性。

表10 Box-Behnken Design试验设计方案及结果分析

表11响应面实验结果中的回归系数分析及显著性分析

注:“*”表示在5％水平显著(P<0.05)；“**”表示在1％水平显著(P<0.01)。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 产β-苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株、其培养方法及其应用

<160> 3

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gcatatcaat aagcggagga aaag 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ggtccgtgtt tcaagacgg 19

<210>3

<211> 594

<212> DNA

<213> Pichia kudriavzevii

<220>

<223>

<400> 3

aggaaaagaa accaacaggg attgcctcag tagcggcgag tgaagcggca agagctcaga 60

tttgaaatcg tgctttgcgg cacgagttgt agattgcagg ttggagtctg tgtggaaggc 120

ggtgtccaag tcccttggaa cagggcgccc aggagggtga gagccccgtg ggatgccggc 180

ggaagcagtg aggcccttct gacgagtcga gttgtttggg aatgcagctc caagcgggtg 240

gtaaattcca tctaaggcta aatactggcg agagaccgat agcgaacaag tactgtgaag 300

gaaagatgaa aagcactttg aaaagagagt gaaacagcac gtgaaattgt tgaaagggaa 360

gggtattgcg cccgacatgg ggattgcgca ccgctgcctc tcgtgggcgg cgctctgggc 420

tttccctggg ccagcatcgg ttcttgctgc aggagaaggg gttctggaac gtggctcttc 480

ggagtgttat agccagggcc agatgctgcg tgcggggacc gaggactgcg gccgtgtagg 540

tcacggatgc tggcagaacg gcgcaacacc gcccgacatg aaaccaccgg acca 594

Claims (8)

1.一株库德里阿兹威毕赤酵母菌株(Pichia kudriavzevii)，其已于2020年4月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.19729。

2.如权利要求1所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌株在制备β-苯乙醇中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌株制备β-苯乙醇的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)对所述库德里阿兹威毕赤酵母菌株接种于液体种子活化培养基中，获得种子活化液；

(2)将步骤(1)获得的种子活化液接种于液体发酵培养基中培养；

(3)从培养液中回收β-苯乙醇。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养条件是在28℃、180r/min条件下，活化24h。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，pH正常，蒸馏水定容。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养条件为装液量20-30mL/250mL，接种量0.3％-0.5％(v/v)，25-27℃，以180-240r/min培养50-60h，可得到成熟的β-苯乙醇转化液，其中所述步骤(2)中液体发酵培养基如下：葡萄糖45-55g/L，硫酸镁0.15-0.25g/L，磷酸二氢钾4-6g/L，酵母浸粉4-7g/L，L-苯丙氨酸9.5-12g/L，pH 2.0-2.5，吐温-60为28-36g/L，蒸馏水定容。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养条件为装液量24-26mL/250mL，接种量0.35％-0.45％(v/v)，25-27℃，以200-220r/min培养54-58h，可得到成熟的β-苯乙醇转化液，其中所述步骤(2)中液体发酵培养基如下：葡萄糖48-52g/L，硫酸镁0.18-0.22g/L，磷酸二氢钾4.5-5.5g/L，酵母浸粉5-6g/L，L-苯丙氨酸10-11.5g/L，pH2.2-2.4，吐温-60为30-35g/L，蒸馏水定容。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养条件为装液量25.5mL/250mL，接种量0.4％(v/v)，26℃，以210r/min培养56h，可得到成熟的β-苯乙醇转化液，其中所述步骤(2)中液体发酵培养基如下：葡萄糖50g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5g/L，酵母浸粉6g/L，L-苯丙氨酸10.7g/L，pH 2.3，吐温-60为32g/L，蒸馏水定容。

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