CN113444653B - 一种诱导提高酵母对果蔬采后病害防治效力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导提高酵母对果蔬采后病害防治效力的方法，包括如下步骤：(1)固体培养基培养；(2)液体培养基培养；(3)抗坏血酸钙培养；(4)悬浮液的制备。本发明的优点是：本发明所使用的抗坏血酸钙来源广泛，成本低，使用方便，性质稳定，安全无害。本发明的调控机制还在于提升了生防酵母营养利用率、增加了代谢能力，同时提升了生防酵母对环境胁迫的适应性，抗氧化酶提升同时抗衰老，从而进一步提升了对病原菌的竞争优势和环境适应性，以提升生防效力。
Description
技术领域
本发明属于果蔬采后病害防治技术领域，特别涉及一种诱导提高酵母对果蔬采后病害防治效力的方法。
背景技术
果蔬采后病害造成严重的经济损失始终是国际关注的重点问题，在美国等发达国家至少有24％的采后果蔬因为病害腐烂而损失，如若将采收加工、贮藏运输、货价销售等过程中的损失也计算在内，其损失更为巨大。在发展中国家，由于卫生和冷藏条件的缺乏，果蔬的采后损失甚至超过了50％。目前防治果实采后病害最有效的方法是使用化学杀菌剂，但是随着化学杀菌剂的长期使用，不仅危害人体健康，还对环境造成了恶劣的影响，并引发病原菌的抗药性。
在食品安全问题受到日益重视的今天，开发安全、高效、无毒、无公害的果蔬采后病害防治新技术己成为研究重点，其中基于物种间原本就存在的相互关系的生物拮抗菌防治水果采后病害被证明是安全有效的新方法之一。其中拮抗酵母具有不产生抗生素、遗传稳定，广谱抗菌性的特点，基于对人体安全性、不使病原菌产生耐受性的原因，生防酵母成为主要研究对象。目前多种酵母已被证明可应用果蔬采后病害的防治中，但在国际上已投入商业化应用的只有Bio-Save(美国)、Shemer(以色列)、Aspire TM(美国)等产品。在实际应用过程当中，拮抗酵母受自身特性和环境多因素影响，拮抗酵母对果蔬采后病害的防治效果达不到杀菌剂的防治效果
影响拮抗酵母对果蔬采后病害防治效力的因素包括两方面：1、酵母对生长环境的耐受性。生物胁迫状态(病原菌侵染)会激发果实及伤口处大量活性氧(ROS)的积累，会对生防酵母产生氧化胁迫，抑制酵母生长及生理状态从而降低生物防治效力。2、酵母自身活力，酵母自身的生长和代谢活力情况与在生物防治过程中和病原菌在果蔬表面中的营养、空间竞争直接相关。酵母自身代谢过程中的ROS积累、氧化衰老、酵母菌的繁殖速度和对果蔬表面及伤口处营养素的利用效率直接影响生防酵母的生防效力。因此，如何提高酵母细胞的增殖率、代谢能力及对环境ROS的抵抗力是提升酵母自身生防效力亟待解决的问题。
目前有在培养基中使用几丁质和β-葡聚糖作为诱导因子，提高酵母的生防效力的，但二者的成本较高。
抗坏血酸钙是抗坏血酸的重要衍生物，易溶于水，其抗氧化作用优于抗坏血酸，而且更加稳定，已作为一种抗氧化剂被广泛应用在食品工业和医药领域。在食品保鲜领域中可以在减少食品(尤其是鲜切水果)的褐变、延缓衰老、延长货架期发挥重要作用，除此之外作为抗氧化剂用于火腿、肉类及荞麦等。可见，抗坏血酸钙具有广阔的市场前景和诸多用途,尤其在食品中具有良好的使用效果。除了抗氧化性能外，Ca2+的加入还增加了抗坏血酸钙的生理功能和营养强化作用，但目前还没有关于抗坏血酸钙提高酵母菌生防效力的相关报道。
发明内容
本发明所提供的防治樱桃番茄采后病害的酵母菌株，现保存于位于中国科学院微生物研究所的生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为：CGMCC NO:M3590，保藏日期为2010年1月20日，建议的分类命名为罗伦隐球酵母。
本发明所提供的防治樱桃番茄采后病害的酵母菌株，现保存于位于中国科学院微生物研究所的生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为：CGMCCNo.19729，保藏日期为2020年4月26日，建议的分类命名为库德里阿兹氏毕赤酵母。
本发明所提供的防治樱桃番茄采后病害的酵母菌株，现保存于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为：CCTCC NO:M 2017270，保藏日期为2017年5月17日，建议的分类命名为季也蒙毕赤酵母Y1。
针对目前生防酵母生防效力存在的不足，本发明旨在解决上述问题(环境ROS耐受性和快速增殖)；选用实验室购买的罗伦酵母(CGMCC No.3590)、库德里阿兹氏毕赤酵母(CGMCC No.19729)和季也蒙毕赤酵母Y1(CTCC No:2017270)以抗坏血酸钙诱导提高拮抗酵母的抗氧化能力和定殖能力，以提高拮抗酵母对樱桃番茄果实采后病害的防治效果，从而达到研究和开发新型高效、无毒、安全的樱桃番茄防腐保鲜剂的目的。
本发明采用的技术方案是：
一种诱导提高酵母对果蔬采后病害防治效力的方法，包括如下步骤：
(1)固体培养基培养：将实验室冻存的罗伦酵母(CGMCC No.3590)、库德里阿兹氏毕赤酵母(CGMCC No.19729)和季也蒙毕赤酵母Y1(CCTCC No:2017270)分别接种于NYDA培养基中，于28℃培养48h；
(2)液体培养基培养：将固体培养后的不同酵母分别接种一环至装有50mL NYDB培养基的三角瓶中，200rpm、28℃条件下培养24h；
(3)Ca ascorbate培养：将抗坏血酸钙加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸钙的浓度为0μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1mg/ml，然后分别加入1ml浓度为1×108cells/ml的酵母细胞悬浮液，于200rpm、28℃条件下培养24h，得到酵母培养物；
(4)悬浮液的制备：上述酵母培养物在3500rpm条件下离心10min，收集菌体，用无菌水洗涤2次，以去除培养介质和抗坏血酸钙，用无菌水重悬酵母菌，并用血球计数板计数，调节酵母细胞浓度为1×108cells/mL。
优选的，所述NYDA培养基为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至l L，自然pH。
优选的，所述NYDB培养基为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至l000mL，自然pH。
本发明的优点是：
(1)本发明所使用的抗坏血酸钙来源广泛，成本低，使用方便，性质稳定，安全无害。
1kg食品级几丁质售价为240元，1kg食品级抗坏血酸钙售价为80元。与已有的专利和文献研究对比，本发明所使用的抗坏血酸钙成本仅为几丁质的30-150分之一。几丁质仅溶于含8％氯化锂的二甲基乙酰胺或浓盐酸，不溶于水、稀酸、碱、乙醇或其它有机溶剂，配置时步骤繁琐且成本高。本实验所用抗坏血酸钙可直接加入培养基中溶解，使用简单且成本低。
(2)本发明使用的酵母拮抗效力强，可用于水果采后病害的防控，控制由病原菌侵染造成的腐烂损失。
(3)本发明以一定浓度的抗坏血酸钙诱导处理几种拮抗酵母，与未经诱导的酵母比较，抗坏血酸钙可以显著提升酵母的生防效力(与未经诱导的拮抗酵母相比可降低15％-30％的发病率)，其对酵母的诱导能力和病菌的防控能力具有广谱适用性，可通过提升酵母的增殖速度、代谢能力和酵母对环境ROS的耐受力，以控制樱桃番茄的腐烂病害，达到水果防腐保鲜的效果。
(4)本发明使用抗坏血酸钙诱导诱导拮抗酵母控制采后水果病害的方法可以作为化学杀菌剂防控水果采后病害的替代方法，可减少化学杀菌剂的使用残留所造成的食品安全及环境污染问题，具有很高的经济和社会效益。
(5)本发明的调控机制还在于提升了生防酵母营养利用率、增加了代谢能力，同时提升了生防酵母对环境胁迫的适应性，抗氧化酶提升同时抗衰老，从而进一步提升了对病原菌的竞争优势和环境适应性，以提升生防效力。
附图说明
图1：不同浓度抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母(CGMCC No.19729)对樱桃番茄灰霉病的控制效果
图2：不同浓度抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母(CGMCC No.19729)对樱桃番茄黑霉病的控制效果
图3：不同浓度抗坏血酸钙诱导季也蒙毕赤酵母Y1(CCTCC No:2017270)对樱桃番茄灰霉病的控制效果
图4：不同浓度抗坏血酸钙诱导季也蒙毕赤酵母Y1(CCTCC No:2017270)对樱桃番茄黑霉病的控制效果
图5：不同浓度抗坏血酸钙诱导罗伦隐球酵母(CGMCC No.3590)对樱桃番茄灰霉病的控制效果
图6：150μg/mL抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母(CGMCC No.19729)在果实伤口活菌数量
图7：150μg/mL抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母(CGMCC No.19729)细胞中抗氧化酶的活性；处理时间与POD活性的关系
图8：150μg/mL抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母(CGMCC No.19729)细胞中抗氧化酶的活性；处理时间与CAT活性的关系
图9：150μg/mL抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母(CGMCC No.19729)细胞中抗氧化酶的活性；处理时间与SOD活性的关系。
具体实施方式
为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
NYDA培养基为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至l000mL，自然pH。
NYDB培养基：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至l000mL，自然pH。
实施例1：抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母对樱桃番茄灰霉病的控制效果
供试的果实挑选大小均匀一致，表面无机械损伤和病虫伤害，于0.1％的次氯酸钠溶液中浸泡3min后用自来水冲洗干净，室温下晾干。将抗坏血酸钙加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸钙的浓度为0μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1mg/ml，然后将1ml浓度为1×108cells/mL的库德里阿兹氏毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：转速200rpm，温度28℃，时间24h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL。
用无菌打孔器在樱桃番茄赤道处创造一个伤口(5mm宽×3mm深)，伤口处分别加入15μL以下溶液：(1)1×108cells/ml库德里阿兹氏毕赤酵母(未经抗坏血酸诱导)；(2)用不同浓度抗坏血酸钙诱导的浓度为1×108cells/mL的库德里阿兹氏毕赤酵母悬浮液；(3)无菌水作为对照。
2h后，分别向樱桃番茄伤口处接种15μL浓度为1×104spores/mL的灰葡萄孢孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于28℃，95％(HD)的恒温恒湿培养箱中培养中贮藏。每个处理重复3次，每次重复30个果实。整个试验重复2次。记录果实发病率，以此评价抗坏血酸钙诱导的库德里阿兹氏毕赤酵母对樱桃番茄灰霉病发病率的控制效果。
试验结果1：
发病率计算公式如下：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
如图1所示，抗坏血酸钙诱导和未诱导的库德里阿兹氏毕赤酵母处理的樱桃番茄灰霉病发病率均显著低于对照组。与未经抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组相比，不同浓度抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理的樱桃番茄灰霉病发病率均降低，表明抗坏血酸钙诱导显著提高了库德里阿兹氏毕赤酵母对樱桃番茄灰霉病的防治效力。尤其是150μg/mL抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组发病率为44.5％，显著低于未经诱导的拮抗酵母处理的发病率(63.9％)。
实施例2：抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母对樱桃番茄黑霉病的控制效果
供试的果实挑选大小均匀一致，表面无机械损伤和病虫伤害，于0.1％的次氯酸钠溶液中浸泡3min后用自来水冲洗干净，室温下晾干。将抗坏血酸钙加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸钙的浓度为0μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1mg/ml，然后将1ml浓度为1×108cells/mL的库德里阿兹氏毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：200rpm，28℃，24h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL。
用无菌打孔器在樱桃番茄赤道处创造一个伤口(5mm直径×3mm深)，伤口处分别加入15μL以下溶液：(1)1×108cells/ml库德里阿兹氏毕赤酵母(未经抗坏血酸诱导)；(2)不同浓度抗坏血酸钙诱导的浓度为1×108cells/ml库德里阿兹氏毕赤酵母悬液；(3)无菌水作为对照。
2h后，分别向樱桃番茄伤口处接种15μL浓度为1×104spores/mL的链格孢孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于28℃，95％(HD)的恒温恒湿培养箱中培养中贮藏。每个处理重复3次，每次重复30个果实。整个试验重复2次。记录果实发病率，以此评价抗坏血酸钙诱导的库德里阿兹氏毕赤酵母对樱桃番茄黑霉病发病率的控制效果。
试验结果2：
发病率计算公式如下：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
如图2所示，抗坏血酸钙诱导和未诱导的库德里阿兹氏毕赤酵母处理的樱桃番茄黑霉病的发病率均显著低于对照组。与未经抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组相比，不同浓度抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理的樱桃番茄黑霉病发病率均降低，表明抗坏血酸钙诱导显著提高了库德里阿兹氏毕赤酵母对樱桃番茄黑霉病的防治效力。当对照组发病率达到100％时，250μg/mL抗坏血酸钙诱导的处理组发病率为35％，显著低于未经诱导的拮抗酵母处理的发病率(63.3％)。
实施例3：抗坏血酸钙诱导季也蒙毕赤酵母Y1对樱桃番茄灰霉病的控制效果
供试的果实挑选大小均匀一致,表面无机械损伤和病虫伤害，于0.1％的次氯酸钠溶液中浸泡3min后用自来水冲洗干净，室温下晾干。将抗坏血酸钙加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸钙的浓度为0μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1mg/ml，然后将1ml浓度为1×108cells/mL的季也蒙毕赤酵母Y1接种到培养基中进行培养，培养的条件为：200rpm,28℃培养24h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL。
用无菌打孔器在樱桃番茄赤道处创造一个伤口(5mm宽×3mm深)，伤口处分别加入15μL以下溶液：(1)1×108cells/ml季也蒙毕赤酵母Y1(未经抗坏血酸诱导)；(2)用不同浓度抗坏血酸钙诱导的浓度为1×108cells/ml季也蒙毕赤酵母Y1；(3)无菌水做为对照。
2h后，再分别向樱桃番茄伤口处接种15μL浓度为1×104spores/mL的灰葡萄孢孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于28℃，95％(HD)的恒温恒湿培养箱中培养中贮藏。每个处理重复3次，每次重复30个果实。整个试验重复2次。记录果实发病率，以此评价抗坏血酸钙诱导的季也蒙毕赤酵母Y1对樱桃番茄灰霉病发病率的控制效果。
试验结果3：
发病率计算公式如下：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
如图3所示，抗坏血酸钙诱导和未诱导的季也蒙毕赤酵母Y1处理的樱桃番茄灰霉病发病率均显著低于对照组。与未经抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组相比，不同浓度抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理的樱桃番茄灰霉病发病率均降低，表明抗坏血酸钙诱导显著提高了季也蒙毕赤酵母Y1对樱桃番茄灰霉病的防治效力。尤其是1mg/ml抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组发病率为54.7％，显著低于未经诱导的拮抗酵母处理的发病率(69％)。
实施例4：抗坏血酸钙诱导季也蒙毕赤酵母Y1对樱桃番茄黑霉病的控制效果
供试的果实挑选大小均匀一致,表面无机械损伤和病虫伤害，于0.1％的次氯酸钠溶液中浸泡3min后用自来水冲洗干净，室温下晾干。将抗坏血酸钙加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸钙的浓度为0μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1mg/ml，然后将1ml浓度为1×108cells/mL的季也蒙毕赤酵母Y1接种到培养基中进行培养，200rpm，28℃，培养24h后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL。
用无菌打孔器在樱桃番茄赤道处创造一个伤口(5mm直径×3mm深)，伤口处分别加入15μL以下溶液：(1)1×108cells/ml季也蒙毕赤酵母Y1(未经抗坏血酸诱导)；(2)用不同浓度抗坏血酸钙诱导的浓度为1×108cells/ml季也蒙毕赤酵母Y1；(3)无菌水。
2h后，再分别向樱桃番茄伤口处接种15μL浓度为1×104spores/mL的链格孢孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于28℃，95％(HD)的恒温恒湿培养箱中培养中贮藏。每个处理重复3次，每次重复30个果实。整个试验重复2次。记录果实发病率，以此评价抗坏血酸钙诱导的季也蒙毕赤酵母Y1对樱桃番茄黑霉病发病率的控制效果。
试验结果4：
发病率计算公式如下：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
如图4所示，抗坏血酸钙诱导和未诱导的季也蒙毕赤酵母Y1处理的樱桃番茄黑霉病发病率均显著低于对照组。与未经抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组相比，不同浓度抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理的樱桃番茄黑霉病发病率均降低，表明抗坏血酸钙诱导显著提高了季也蒙毕赤酵母Y1对樱桃番茄黑霉病的防治效力。尤其是3mg/ml抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组发病率为37.9％，显著低于未经诱导的拮抗酵母处理的发病率(68.2％)。
实施例5：抗坏血酸钙诱导罗伦隐球酵母对樱桃番茄灰霉病的控制效果
供试的果实挑选大小均匀一致,表面无机械损伤和病虫伤害，于0.1％的次氯酸钠溶液中浸泡3min后用自来水冲洗干净，室温下晾干。将抗坏血酸钙加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸钙的浓度为0μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1mg/ml，然后将1ml浓度为1×108cells/mL的罗伦隐球酵母接种到培养基中进行培养，200rpm，28℃，培养24h后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL。
用无菌打孔器在樱桃番茄赤道处创造一个伤口(5mm直径×3mm深)，伤口处分别加入15μL以下溶液：(1)1×108cells/ml罗伦隐球酵母(未经抗坏血酸诱导)；(2)用不同浓度抗坏血酸钙诱导的浓度为1×108cells/ml罗伦隐球酵母悬液；(3)无菌水。
2h后，再分别向樱桃番茄伤口处接种15μL浓度为1×104spores/mL的灰葡萄孢孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于28℃，95％(HD)的恒温恒湿培养箱中培养中贮藏。每个处理重复3次，每次重复30个果实。整个试验重复2次。记录果实发病率，以此评价抗坏血酸钙诱导的罗伦隐球酵母对樱桃番茄灰霉病发病率的控制效果。
试验结果5：
发病率计算公式如下：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
如图5所示，抗坏血酸钙诱导和未诱导的罗伦隐球酵母处理的樱桃番茄灰霉病发病率均显著低于对照组。与未经抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组相比，不同浓度抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理的樱桃番茄灰霉病发病率均降低，表明抗坏血酸钙诱导显著提高了罗伦隐球酵母对樱桃番茄灰霉病的防治效力。尤其是100μg/mL抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组发病率为6.5％，显著低于未经诱导的拮抗酵母处理的发病率(22.9％)。
实施例6：150μg/mL抗坏血酸钙诱导库德里阿兹氏毕赤酵母在樱桃番茄果实伤口活菌数
供试的果实挑选大小均匀一致,表面无机械损伤和病虫伤害，于0.1％的次氯酸钠溶液中浸泡3min后用自来水冲洗干净，室温下晾干。将抗坏血酸钙和氯化钙分别加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸钙和氯化钙的浓度均为150μg/mL然后将1ml浓度为1×108cells/mL的库德里阿兹氏毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：200rpm，28℃，培养24h后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL。
用无菌打孔器在樱桃番茄赤道处创造一个伤口(5mm直径×3mm深)，伤口处分别加入15μL以下溶液：(1)1×108cells/ml库德里阿兹氏毕赤酵母(未经抗坏血酸诱导)；(2)150μg/mL抗坏血酸钙诱导的浓度为1×108cells/ml库德里阿兹氏毕赤酵母悬液；(3)150μg/mL氯化钙诱导的浓度为1×108cells/ml库德里阿兹氏毕赤酵母悬液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于28℃，95％(HD)的恒温恒湿培养箱中培养中贮藏。分别于24,48,72和96h从伤口处取样研磨，无菌水梯度稀释，凃板培养，记录不同处理活酵母数量。每个处理重复3次，每次重复30个果实。整个试验重复2次。
试验结果6：
如图6所示，与未经抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组相比，抗坏血酸钙诱导和氯化钙诱导处理均能显著提升库德里阿兹氏毕赤酵母在果实伤口的快速定殖；其中在整个试验期间，抗坏血酸钙诱导处理的酵母活菌数都高于对照和氯化钙处理组。氯化钙处理组的酵母在试验前期也表现出了与抗坏血酸钙诱导处理组相同的生长动态趋势，在实验期间前期能够快速增殖。
结果表明抗坏血酸钙诱导显著提高了酵母对樱桃番茄灰霉病的防治效力与其能够诱导酵母在果实伤口快速增殖定殖，增加其与病原菌营养空间竞争能力有关，而Ca2+也具有一定增加酵母增殖生理活力的作用，因此抗坏血酸钙除了抗氧化能力强增加酵母环境ROS耐受性之外，Ca2+的引入也增加了其增殖定殖的生理能力，具有更好的酵母生防效力提升效果。
以上所述仅为本发明创造的较好的实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
实施例7：抗坏血酸钙诱导对库德里阿兹氏毕赤酵母细胞中抗氧化酶活性(CAT、POD、SOD)的影响
将抗坏血酸钙加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸钙的浓度为0μg/mL和150μg/mL，然后将1ml浓度为1×108cells/mL的库德里阿兹氏毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：转速200rpm，温度28℃，时间24h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗。
根据试剂盒(Solarbio,Beijing,China)的方法进行酶活测定，酶活单位表示为每mg蛋白。
试验结果7：
如图7，图8，图9所示，与未经抗坏血酸钙诱导的拮抗酵母处理组相比，在整个试验期间，抗坏血酸钙诱导处理能显著提升库德里阿兹氏毕赤酵母细胞中抗氧化酶的活性。
Claims (3)
1.一种诱导提高酵母对果蔬采后病害防治效力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固体培养基培养：将实验室购买的罗伦酵母、库德里阿兹氏毕赤酵母和季也蒙毕赤酵母Y1分别接种于NYDA培养基中，于28℃培养48h；所述罗伦酵母目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No .3590；所述库德里阿兹氏毕赤酵母目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.19729；所述季也蒙毕赤酵母Y1目前保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO:M 2017270；
(2)液体培养基培养：将固体培养后的不同酵母分别接种一环至装有50mL NYDB培养基的三角瓶中，于200rpm、28℃条件下培养24h后离心调至浓度为1×108cells/ml的酵母悬浮液；
(3)抗坏血酸钙培养：将抗坏血酸钙加入NYDB培养基中，库德里阿兹氏毕赤酵母培养基中抗坏血酸钙的浓度为150μg/mL或250μg/mL，季也蒙毕赤酵母Y1培养基中抗坏血酸钙的浓度为1mg/mL，罗伦酵母培养基中抗坏血酸钙的浓度为100μg/mL，然后分别加入1ml浓度为1×108cells/ml酵母悬浮液，于200rpm、28℃条件下培养24h，得到酵母培养物；
(4)悬浮液的制备：上述酵母培养物在3500rpm条件下离心10min，收集菌体，用无菌水洗涤2次，以去除培养介质和抗坏血酸钙，用无菌水重新悬浮酵母细胞，并用血球计数板计数，调节酵母细胞浓度为1×108cells/mL。
2.根据权利要求1所述一种诱导提高酵母对果蔬采后病害防治效力的方法，其特征在于，所述NYDA培养基为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至lL，自然pH。
3.根据权利要求1所述一种诱导提高酵母对果蔬采后病害防治效力的方法，其特征在于为，所述NYDB培养基：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至l000mL，自然pH。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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