CN103502433A - 禾草假单胞菌种的菌株的生物培养物、所述培养物作为用于生物防治病原菌的拮抗物的用途及包括将含所述培养物的制剂施用于水果的步骤的用于处理所述水果的方法 - Google Patents

禾草假单胞菌种的菌株的生物培养物、所述培养物作为用于生物防治病原菌的拮抗物的用途及包括将含所述培养物的制剂施用于水果的步骤的用于处理所述水果的方法 Download PDF

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Abstract

禾草假单胞菌种的菌株的基本纯生物培养物，所述禾草假单胞菌种的菌株以编号CBS124167保藏在保藏机构位于荷兰乌特勒支的荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）。CBS124167培养物作为用于生物防治供人消费的水果中食物传染病原菌的拮抗物的用途。处理水果的方法，所述方法包括将含禾草假单胞菌种的菌株的培养物的制剂施用于所述水果的步骤，所述禾草假单胞菌种的菌株以编号CBS124167保藏在保藏机构位于荷兰乌特勒支的荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）。施用其使得有可能减少产品存放期过程中病原体的生长，尤其是在冷链破坏时。

Description

禾草假单胞菌种的菌株的生物培养物、所述培养物作为用于生物防治病原菌的拮抗物的用途及包括将含所述培养物的制剂施用于水果的步骤的用于处理所述水果的方法
技术领域
本发明涉及禾草假单胞菌（Pseudomonas graminis）种的菌株的生物学培养物，以及所述菌株作为用于生物防治水果中食物传染性病原菌的拮抗物的用途。本发明还涉及一种处理水果的方法，所述方法包括将含所述培养物的制剂施用于所述水果的步骤。 
背景技术
鲜切水果或最少加工水果是最近在市场上出现的产品。对该水果进行最少加工，包含洗涤、去皮、切割、消毒并在被动或主动气调（modified atmosphere）中将其包装，以最终在冷藏条件下储存。 
鲜切水果是对物理、化学和生物改变非常敏感的食品，与完整水果相比，其以更快的速度变质。在鲜切水果中，呼吸作用和代谢过程因操作而加快，因为这个原因，有必要将所述产品储存在气调中并将其储存在冷藏条件下。 
目前的规定对鲜切水果应用了非常严格的微生物标准，目的是将由摄入被细菌例如沙门氏菌属（Salmonella spp.）、李斯特氏菌属（Listeria spp.）或大肠杆菌（Escherichia coli）O157:H7型污染的水果而引起的食物毒性感染或疾病降至最低。 
目前，为了保证最少加工的食品的安全，通常应用涉及用加有次氯酸钠的水洗涤水果的处理。这些处理减少了所述产品的微生物负载，但是存在的缺点是：这些处理可能留下氯残留物，其有利于可能致癌的物质的形成。此外，用次氯酸盐处理不能防止水果储存过程中或产品存放期过程中的微生物的生长。 
在最少加工产品中生物防治食物传染病原菌是以次氯酸钠进行处理的非常合乎需求的替代方案。但是，为了使该替代方案可行，有必要寻找在气调条件下在室温和冷藏时都能有效抗前述三种类型的病原 菌（沙门氏菌属、李斯特氏菌属或大肠杆菌O157:H7）的任一种的拮抗微生物。此外，需要这些拮抗物对人和蔬菜都是无害的，因为否则，其会伤害消费者或所处理的产品。 
在本领域的现有技术中，已经公开了用于生物防治水果中食物传染病原菌的的拮抗物（“Biological control of postharvest decays of apple can prevent growth of Escherichia coli O157:H7in apple wounds”,Janisiewicz,W.et al.JOURNAL OF FOOD PROTECTION 62(12):1372-1375.1999，和“Biocontrol of the food-borne pathogens Listeria monocytogenes and Salmonella enterica serovar Poona on fresh-cut apples with naturally occurring bacterial and yeast antagonists”,Leverentz,B.et al.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY 72(2):1135-1140.2006）。 
但是，所使用的拮抗物不属于禾草假单胞菌种，此外，它们都不能在室温或冷藏条件下有效地抗沙门氏菌属、李斯特氏菌属和大肠杆菌O157:H7中任何一种微生物。 
发明内容
本发明的第一目标是提供禾草假单胞菌种的新菌株的基本纯生物培养物，所述禾草假单胞菌种的新菌株以编号CBS124167保藏在保藏机构——位于荷兰乌特勒支的荷兰微生物菌种保藏中心（Centraalbureau voor Schimmelcultures）（CBS）。 
第二目标是提供以编号CBS124167保藏的禾草假单胞菌种的新菌株的基本纯生物培养物，被用作用于生物防治供人消费的水果中食物传染病原菌的拮抗物。 
本发明的第三目标由前述新菌株的生物培养物作为用于生物防治供人消费的水果中食物传染病原菌的拮抗物的用途组成。 
第四目标涉及一种处理水果的方法，所述方法包括将包含前述新菌株的生物培养物的制剂施用于水果的步骤。 
已经观察到，对于宽范围的病原体和水果，所分离的新菌株在室温、在气调和冷藏条件下表现出其作为抗水果中食物传染病原菌的拮抗物的强大效力。应用其使得有可能在产品有效期过程中减少病原体的生长，尤 其是冷链破坏时。 
在本发明中，食物传染病原菌应理解为是指可造成由摄入被污染的食品（例如被病原菌沙门氏菌属、李斯特氏菌属或大肠杆菌O157:H7型污染的水果）引起的食物毒性感染或疾病的病原菌。 
禾草假单胞菌种的新菌株（Behrendt et al.19991）被通过以下步骤从“金冠”（“Golden Delicious”）苹果表面分离：用无菌水洗涤，然后浸没于盐水-胨溶液（胨，1g/l；NaCl,0.85g/l），在超声浴中超声处理10分钟，将所述洗液播种于NYDA培养基（营养肉汤，8g/l；酵母提取物；5g/l；葡萄糖，10g/l；和琼脂，15g/l）中并随后在25℃下孵育3天。 
所述新菌株培养物已由申请人之一根据布达佩斯条约对承认用于专利程序的微生物保藏的规定，保藏于国际保藏机构荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）（总部位于荷兰3584CT乌特勒支Uppsalalaan 8）。指定的保藏号为CBS124167。 
通过对区域16S rRNA:假单胞菌属进行部分测序以及通过对区域16S rRNA:禾草假单胞菌进行全长测序，鉴定了分离的CBS124167（Behrendt et al.,19991）。 
所述新菌株的形态和生化特征
菌株CBS124167是革兰氏阴性、非形成孢子、氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性、运动性、需氧杆菌。在平板中，菌落是黄色的，呈环形和完整边缘。 
菌株CBS124167具有列于表1的生化特征，并且通过示于表2的测试在表型上区别于其他假单胞菌属种。 
生长温度范围为5℃-30℃，最佳范围为25℃-30℃。其在33℃或0℃下不生长。 
在平板上的生长可在NA培养基（营养琼脂：5g/l胰蛋白胨，3g/l肉膏，15g/l琼脂）、TSA（胰酶大豆肉汤：15g/l胰蛋白胨，5.0g/l大豆蛋白胨，5.0g/l氯化钠和15g/l琼脂，pH7.3）或NYDA（营养肉汤：8g/l；酵母提取物，5g/l；葡萄糖，10g/l和琼脂，15g/l）中进行。 
在液体中的生长可在TSB培养基（胰蛋白胨大豆肉汤：17.0g/l酪蛋白的胰酶消化物，3.0g/l大豆粉的酶消化物，5.0g/l氯化钠，2.5g/l磷酸 氢二钾，2.5g/l葡萄糖，pH7.3）中进行。也可使用NB培养基（营养肉汤：10g/l胰蛋白胨，5g/l肉膏，5g/l氯化钠，pH7.2）。 
在厌氧条件下，在搅拌和25℃-30℃温度范围下在TSB或NB培养基中，菌株CBS124167的生长在孵育20-24小时达到最大群大小（通常为1.9×109-2.9×109个菌落形成单位（cfu）/ml），且在两种培养基之间没有大的差别。 
表1API 20 NE生化条——Biomerieux label的细菌鉴定系统——的酶法测试。在30℃下24小时和48小时后的结果。 
Figure BDA00003442426000041
（+：阳性，-：阴性，w：弱，v：不定，nd：未测定） 
表2菌株CBS124167区别于其他假单胞菌种的表型特征。 
Figure BDA00003442426000051
a:参考物种的数据取自Peix et al.（20033,20044）和Behrendt et al.（19991）。b:+：阳性；-：阴性；w：弱；v：相同种的菌株之间反应不定；nd：未获得数据 
产生抗微生物物质
进行实验以确定菌株CBS124167是否产生抗微生物物质。为了这个目的，将所述菌株于30℃下在TSB培养基中培养20-24小时。保留部分所获得的培养物，其还被称为“培养物，CUL”，包含细胞以及培养基和可能存在的生长中产生的代谢产物。将剩余物在10℃下以8000rpm离心10分钟。将上清液的pH调至6.5，并将所述上清液通过过滤（0.22μm）灭菌以获得“中性的无细胞上清液，NCFS”。将离心后获得的细胞部分在无菌的去离子水中重悬，离心并连续洗涤两次，以除去可能的培养基残余，以获得仅“细胞，CEL”。 
在体外条件下，测定了以下三个部分：CUL、NCFS和CEL抗几种指示培养物：大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌属、无害李斯特氏菌（Listeria innocua）和单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的效力。为了这个目的，在37℃下，将沙门氏菌属和大肠杆菌O157:H7在TSB培养基中、将李斯特氏菌属在TYSEB培养基（补充有6g/l酵母提取物的TSB）中培养18-20小时。将所获得的每种培养物的50μl加入含有10ml 的TSB（沙门氏菌属和大肠杆菌O157:H7）或含7.5g/l琼脂的TYSEB培养基（李斯特氏菌属）的管中，并在45℃下使其回暖。 
将每个管（培养基+指示培养物）的内含物置于含20g/l肉膏、20g/l葡萄糖和15g/l琼脂的平板上。一旦它们固化，就将5ml的CUL、NCFS或CEL置于平板上，并将所述平板在30℃下孵育20小时；此后，可指示抑菌圈的存在或不存在。 
当接种所述中性的无细胞上清液时，在这些处理中没有观察到对指示病原体生长的抑制；因此，我们可排除在所述测定条件下由菌株CBS124167产生抗微生物物质。 
还测定了苹果切块（cut apple）中所述上清液抗大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌属和无害李斯特氏菌的体内效力，并将其与所述细胞的效力进行比较。观察到，所述无细胞上清液对所述病原体没有效应，甚至在于20℃储存2天后促进其生长。 
植物致病性（Phytopathogenicity）
根据Noval et al.19912中的方法，还确定了菌株CBS124167是否是植物致病的，是否能够在烟草叶中产生超敏反应。为了这个目的，制备了所述菌株的109cfu/ml的悬浮物，并使用胰岛素注射器将其注入烟草叶的叶脉。将水用作阴性对照，菠萝泛菌（Pantoea ananatis）的菌株CPA-3用作阳性对照，因为该菌株是植物致病的。将所述植物保持于室温下，并进行定期检查以确定它们是否表现出坏死、浸润区黄化或叶死亡形式的超敏反应症状。在处理的叶中没有观察到反应，甚至用高剂量的CBS124167（109cfu/ml）也没有观察到反应。因此，菌株CBS124167不是植物致病的。 
直接接触和接种苹果的情况下在胃液中的存活
为了评估在直接接触下的存活，将50ml菌株CBS124167的悬浮物（109cfu/ml）加入模拟的唾液和胃液溶液（6.2g/l NaCl，2.2g/l KCl，0.22g/l CaCl2和1.2g/l NaHCO3，0.3g/l胃蛋白酶；pH调至2.0，在37℃下回暖）中，并在37℃下孵育2小时。1小时和2小时后采集样品。没有检测到本发明菌株的活细胞，甚至在接触10分钟后也没有检测到。 
为了评估苹果上的菌株CBS124167在胃液中的存活，用菌株CBS124167以107cfu/ml的剂量通过浸浴2分钟接种“金冠”苹果。使所述 苹果干燥，包装于聚丙烯容器中，用聚丙烯薄膜密封并在5℃储存，所述聚丙烯薄膜厚度为35μm，23℃下对O2和CO2的渗透率为3500cm3/m2*天*atm，在25℃和75%相对湿度下对水蒸气的渗透率为0.9g/m2*天。在0、4、7和14天后，收集10g并对其进行模拟的胃通过。为了这个目的，将其与10ml人造唾液溶液（6.2g/l NaCl，2.2g/l KCl，0.22g/l CaCl2和1.2g/l NaHCO3）混合，并在37℃下回暖。将其均质化2分钟，转移至含有80ml胃液（0.3g/l胃蛋白酶；pH2.0）的锥形瓶，并在37℃下孵育2小时。随后，通过在NA培养基上培养确定所述菌株的存活群。 
在与所述胃液接触2小时后，在所分析的任何样品中没有观察到活细胞。因此，可以推断本发明的菌株不能在通过胃后存活。这是有益处的，因为即使所述细胞在其储存过程中在水果表面生长，当所处理的水果被摄入时，所述细胞不能造成任何损害，因为它们在通过胃后不会存活。同样值得提及的是，没有发现涉及禾草假单胞菌种的食物毒性感染案例的参考文献。 
在水果上生长
已经观察到，菌株CBS124167能够于不同温度在苹果、桃和甜瓜切块上生长，但由于甜瓜的低酸度（较高的pH）所述生长在甜瓜中要好很多。还已观察到在气调条件和冷藏储存温度下在鲜切苹果中的生长。 
具体实施方式
已经观察到，菌株CBS124167可有效抗水果，优选切成块的水果，中的食物传染病原菌，并有利地抗水果和蔬菜中的主要微生物——沙门氏菌属、李斯特氏菌属和/或大肠杆菌O157:H7。 
因此，菌株CBS124167可用作抗所述微生物中任何一种的拮抗物，这有利于达到为鲜切水果或最少加工水果特别指定的微生物标准，以防止由摄入被属于沙门氏菌属、李斯特氏菌属或大肠杆菌O157:H7属的细菌污染的水果而引起的食物毒性感染或疾病。 
尤其地，对于猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）种已经观察到抗沙门氏菌属的效力，而对于单核细胞增生李斯特氏菌和无害李斯特氏菌种已经观察到抗李斯特氏菌属的效力。 
根据本发明的第一实施方案，本发明的菌株可用于水果，优选切 成块的水果，的生物防治，在高于10℃，优选等于或高于20℃，的温度下储存所述水果。 
在室温下，已经观察到CBS124167可减缓甚至减少前述微生物中任一种的生长，即使这些微生物以等于或大于103cfu/g（非常高的浓度，在实际条件中很难找到）的浓度存在于水果上。 
此用途是尤其有利的，因为它使得有可能控制以下情况中的病原体的生长：水果储存温度不是适当的温度，或在储存或运输过程中所述产品的冷链被破坏，例如由于水果冷藏设备的维护问题。对于所述菌株来说，在室温下有效是非常重要的，因为在该温度时病原微生物生长最多，因此对消费者的风险增加。 
根据第二实施方案，本发明的菌株可用于水果，例如切成块的水果，的生物防治，使所述水果保持在冷藏条件下。冷藏条件应理解为是指使所述水果保持在等于或低于10℃，优选等于或低于5℃，的冷藏温度下。 
令人惊讶的是，还已经证明了菌株CBS124167在冷藏温度下抗沙门氏菌属、李斯特氏菌属和大肠杆菌O157:H7中任一种微生物的效力，所述冷藏温度是由生产者或分配者设定的储存水果的冷藏温度。 
根据第三实施方案，本发明的菌株可用于水果，优选鲜切水果，的生物防治，使所述水果保持在气调中。气调应被理解为是指气体组成不同于空气的气氛，用于改进水果储存条件。 
当水果被包装在气调中用于储存时，本发明的菌株也表现出效力。因此，所述菌株可在惯常的商业化条件下使用；因此，在超市或展示的条件下也可保证食物安全。 
有利地，所述水果是pH为3-7的水果，例如苹果、桃和/或甜瓜。 
已经观察到，沙门氏菌属、李斯特氏菌属或大肠杆菌O157:H7的生长可发生在很多水果中，尽管某些水果例如苹果有酸性条件。还观察到，前述细菌的生长在酸性较弱的水果例如甜瓜中非常快。但是，由于本发明的菌株，可在多种水果中控制这些病原体的生长。 
如在本发明的说明书中讨论的，本发明的一个目的是提供一种制备水果的方法，所述方法包括将含所述新菌株CBS124167的生物培养物的制剂施用于所述水果的步骤。 
根据所述方法的优选实施方案，将所述水果切成块，然后施用所述制 剂。 
优选地，所述制剂中菌株CBS124167的浓度等于或大于所述水果，优选鲜切水果，中可包含的估计病原体浓度。 
根据一个实施方案，所述制剂中所述菌株的浓度等于或大于105 cfu/ml。 
已经观察到，该浓度可有效抗沙门氏菌属、李斯特氏菌属和/或大肠杆菌O157:H7这三种微生物的任一种，并且为比实际条件中鲜切水果中可发现的所述微生物的浓度高很多的浓度。 
有利地，所述制剂中所述菌株的浓度等于或大于107cfu/ml。 
已经观察到，该浓度保证病原菌减少至少2个对数单位（10为底的对数标度的两单位），不管所述水果中病原菌的浓度如何。 
根据另一实施方案，所述方法包括一旦已施用所述制剂就包装所述水果的步骤。 
有利地，所述方法还包括这样的步骤：向所述水果提供气调和/或向水果提供冷藏温度，例如等于或低于10℃，优选等于或低于5℃的温度。 
所述气调可以被动方式提供，例如使用对气体具有不同渗透性的塑料膜包装所述产品，因所述容器壁的渗透性和诸如产品的呼吸作用和生化改变的因素而被动地形成有利的气调。 
在气调中包装所述产品有助于使鲜切水果的新鲜度品质维持较长的时间，这可延长所述产品的存放期。 
如先前所讨论的，本发明的菌株在气调包装的这些条件下也是有效的。 
有利地，用于制备水果，优选鲜切水果，的所述方法包括向所述水果施用抗氧剂、然后施用含所述菌株的悬浮物的步骤。 
已经观察到，使用一些抗氧剂物质不会改变本发明的菌株，因为这个原因所述抗氧剂物质可用于延缓所述水果的氧化。 
附图说明
为了更好的理解上文提出的内容，附上了一些图，这些图为了非限制性的目的示意性地且严格地代表若干个实施方案的结果。 
在所述图中， 
图1的曲线示意图示出了在20℃下不用拮抗物（对照）和用所选择的10种拮抗物（包括拮抗物CBS124167）接种后（初始浓度）和接种2天后苹果柱中大肠杆菌O157:H7的群。数值代表6个值（两次测定，每次有3个重复）的平均值，条（bar）表示标准误差。括号中的数字表示所获得的平均减少。 
图2的曲线示意图示出了在20℃下不用拮抗物（对照）和用所选择的10种拮抗物（包括菌株CBS124167）接种后（初始浓度）和接种2天后苹果柱中猪霍乱沙门氏菌BAA-709的群。数值代表6个值（两次测定，每次有3个重复）的平均值，条表示标准误差。括号中的数字表示所获得的平均减少。 
图3的曲线示意图示出了在20℃下不用拮抗物（对照）和用所选择的10种拮抗物（包括菌株CBS124167）接种后（初始浓度）和接种2天后苹果柱中无害李斯特氏菌CECT-910的群。数值代表6个值（两次测定，每次有3个重复）的平均值，条表示标准误差。括号中的数字表示所获得的平均减少。 
图4的曲线示意图示出了在20℃下不用拮抗物（对照）和用所选择的10种拮抗物（包括菌株CBS124167）接种后（初始浓度）和接种2天后桃柱中大肠杆菌O157:H7的群。数值代表6个值（两次测定，每次有3个重复）的平均值，条表示标准误差。括号中的数字表示所获得的平均减少。 
图5的曲线示意图示出了在20℃下不用拮抗物（对照）和用所选择的10种拮抗物（包括菌株CBS124167）接种后（初始浓度）和接种2天后桃柱中猪霍乱沙门氏菌BAA-709的群。数值代表6个值（两次测定，每次有3个重复）的平均值，条表示标准误差。括号中的数字表示所获得的平均减少。 
图6的曲线示意图示出了在20℃下不用拮抗物（对照）和用所选择的10种拮抗物（包括菌株CBS124167）接种后（初始浓度）和接种2天后桃柱中无害李斯特氏菌CECT-910的群。数值代表6个值（两次测定，每次有3个重复）的平均值，条表示标准误差。括号中的数字表示所获得的平均减少。 
图7的曲线示意图示出了在20℃下不用拮抗物（对照）和用所选择的12种拮抗物（包括菌株CBS124167）接种后（初始浓度）和接种2天后甜瓜柱中猪霍乱沙门氏菌BAA-709的群。数值代表6个值（两次测定，每次有3个重复）的平均值，条表示标准误差。括号中的数字表示所获得的平均减少。 
图8的曲线示意图示出了在20℃下不用拮抗物（对照）和用所选择的12种拮抗物（包括菌株CBS124167）接种后（初始浓度）和接种2天后甜瓜柱中单核细胞增生李斯特氏菌LM230/3的群。数值代表6个值（两次测定，每次有3个重复）的平均值，条表示标准误差。括号中的数字表示所获得的平均减少。 
图9的曲线示意图示出了用或不用菌株CBS124167的悬浮物（108 cfu/ml）共接种且储存于5℃的苹果柱中大肠杆菌O157:H7的群。 
图10的曲线示意图示出了用或不用菌株CBS124167的悬浮物（108 cfu/ml）共接种且储存于5℃和10℃的桃柱中大肠杆菌O157:H7的群。 
图11的曲线示意图示出了用或不用菌株CBS124167的悬浮物（108 cfu/ml）共接种且储存于5℃的桃柱中猪霍乱沙门氏菌BAA-709的群。 
图12的曲线示意图示出了用或不用菌株CBS124167的悬浮物（108 cfu/ml）共接种且储存于5℃和10℃的甜瓜柱中猪霍乱沙门氏菌BAA-709的群体数。 
图13的曲线示意图示出了用或不用不同浓度的菌株CBS124167共接种且储存于10℃的甜瓜柱中单核细胞增生李斯特氏菌菌株（CECT-4031、CECT-4032、CECT-933、CECT-940和LM230/3）的混合物的群。 
图14的曲线示意图示出了用或不用不同浓度的菌株CBS124167共接种且储存于10℃的甜瓜柱中猪霍乱沙门氏菌菌株（BAA-707、BAA-709、BAA-710和BAA-711）的混合物的群。 
图15的曲线示意图示出了经抗氧剂处理并通过浸没2分钟用107 cfu/ml的菌株CBS124167接种或不用其接种且在5℃和10℃下储存于气调包装（MAP）中的苹果切块中猪霍乱沙门氏菌菌株（BAA-707、BAA-709、BAA-710和BAA-711）的混合物的群。 
图16的曲线示意图示出了经抗氧剂处理并通过浸没2分钟用107 cfu/ml的菌株CBS124167接种或不用其接种且在5℃和10℃下储存于气调包装（MAP）中的苹果切块中单核细胞增生李斯特氏菌菌株（CECT-4031、CECT-4032、CECT-933、CECT-940和LM230/3）的混合物的群。 
实施例描述 
在下文，我们给出了不同的测定，其应被解释为用于更好理解本发明的辅助而不应被理解为是对其的限制。 
测定了沙门氏菌属和李斯特氏菌属中的不同菌株以及大肠杆菌O157:H7菌株的拮抗效应。这些病原体是水果和蔬菜中的主要病原体。所附的表3示出所述测定中使用的食物传染病原微生物的菌株。 
首先，我们描述了这样的实施例，即进行所述实施例以证明在实验条件下的效力。其次，我们描述了这样的实施例，即进行所实施例以证明在模拟商业化生产条件下的效力。 
设计了用于证明实验室条件下菌株CBS124167抗鲜切水果中主要食物传染病原体的效力的测定
在下文，我们描述了在实验室条件下进行的测定的多个实施例，所述实施例证明了在室温和冷藏条件下在不同水果中施用的不同剂量的菌株CBS124167的效力。 
在这些测定中使用的病原微生物的菌株为：无害李斯特氏菌（CECT-910）、大肠杆菌O157:H7（NCTC-12900）和猪霍乱沙门氏菌（BAA-709、BAA-707、BAA-709、BAA-710和BAA-711）以及某些情况下的单核细胞增生李斯特氏菌（CECT-4031、CECT-4032、CECT-933、CECT-940和LM230/3）（参见表3）。 
将所述水果通过喷洒70%乙醇事先进行消毒。随后，通过尺度为直径1.2cm、高度1cm的打孔器制备用于测定的水果的圆柱块，其近似等价于1g水果。将这些块置于无菌试管中，用含有两种微生物（病原体和拮抗物）的15μl悬浮物接种，这是称为共接种的过程。在对照处理中，将所述病原体加入含有10ml无菌水的管（没有拮抗微生物）。共接种后，在室温下干燥所述水果。随后，收集3个管，并通过在特定培养基中播种测量初始病原体浓度。将其他管储存在20℃、10℃或 5℃，这取决于所述测定。在2天（20℃下的测定），或2-3天、5-7天和10天（5℃或10℃下的测定）后，再一次测定有拮抗物的样品（用拮抗物处理的）和没有拮抗物的（对照处理）的样品中每块水果的病原体浓度。所述浓度数据被转化为Log10cfc。 
为了计算所述病原体的生长减少值，使用了以下公式： 
Log10cfc减少=log10Ct-对照–log10Ct+拮抗物，其中： 
Ct-对照是储存“t”天后对照处理中的病原体浓度，Ct+拮抗物是储存“t”天后拮抗物处理中的病原体浓度。 
正的减少值表明在拮抗物的存在下所测定的水果上所述病原体的生长低于没有用拮抗物的相同情况。所述值越高，抗所研究的病原体的效力越强。 
在室温（20℃）下的测定中，为了获得菌株CBS124167和其他所测定菌株的悬浮物，使用了于25℃下孵育48小时的NYDA培养基中的产物。取得分离的克隆，将其悬浮在无菌去离子水中，并从所述悬浮物制备另一悬浮物，并将其通过分光光度计调节至与不同浓度的测定拮抗物（105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml和108cfu/ml）相对应的不同透光度（λ=420nm）。 
在冷藏条件（5℃或10℃）下的测定中，为了获得菌株CBS124167的悬浮物，使用了液体培养基中的产物。为了该目的，接种含有50ml TSB的锥形瓶并将其在30℃下孵育20-24小时。以10000rpm离心10分钟，并用25ml的无菌去离子水重悬细胞。 
将病原体接种于含有10ml TSB培养基（猪霍乱沙门氏菌BAA-707、BAA-709、BAA-710和BAA-711，以及大肠杆菌O157:H7）或TYSEB培养基（无害李斯特氏菌CECT-910和单核细胞增生李斯特氏菌CECT-4031、CECT-4032、CECT-933、CECT-940和LM230/3）的管中，将所述管在37℃下孵育20-24小时。随后，将其以8000rpm离心10分钟，用5ml盐水溶液（0.85g/l NaCl）重悬细胞。通过测量420nm下的透光度和实验室中先前获得的每种病原体的曲线，确定了估计的病原体浓度。 
表3.测定中使用的食物传染病原微生物的菌株的列表。 
Figure BDA00003442426000141
*:从在发明人实验室制备的鲜切莴苣中分离的（Abadias et al.20085） 
CECT:西班牙典型培养物保藏中心（Spanish Type Culture Collection）；ATTC：美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）；NCTC：国家典型培养物保藏中心（National Collection of Type Cultures） 
测定的病原体浓度为105cfu/ml-107cfu/ml。但是，在实际条件下，据估计105cfu/ml病原体浓度（在进行的测定中对应于103cfu/g产品） 是非常高的病原体浓度（Salleh et al.,20036；Nguz et al.,20057）；因为这个原因，所获得的结果是在对菌株CBS124167不利/有害的条件下给出的。 
实施例1：在20℃下菌株CBS124167抗“金冠”苹果上不同食物传染病原体的效力
图1-3示出的实施例是抗“金冠”苹果中大肠杆菌O157:H7、猪霍乱沙门氏菌BAA-709和无害李斯特氏菌CECT-910菌株获得的结果，对比菌株CBS124167与实验室中分离的多个其他菌株的效力，这些菌株在相同条件下测定。 
以约108cfu/ml的浓度接种菌株CBS124167的悬浮物，所述病原体以107cfu/ml的浓度接种。苹果的pH为3.8±0.2，酸度为1.6-2.9g苹果酸/l。 
如图1所示，大肠杆菌O157:H7的初始浓度为5.1 log10cfu/g，其在对照处理（无拮抗物）中增加至6.8 log10cfu/g。相反地，在用不同拮抗物共接种的块中，存在较低的生长，减少了1.0-1.6log单位。在菌株CBS124167的情况下，于20℃储存2天后的病原体群甚至低于初始浓度（2.4log10cfu/g），这表明有效减少了4.5个对数单位。 
当测试不同菌株抗沙门氏菌BAA-709的效力时获得了相似的结果（图2），在其他拮抗物的情况中减少了0.3-1.0log单位，在菌株CBS124167的情况中，减少了4.7log单位。 
未经拮抗物处理的苹果上于20℃储存2天后无害李斯特氏菌群的增加为2.5log10cfu/g。在实验室中分离的某些拮抗物的情况下，有1.1-2.2log单位的显著减少，但是菌株CBS124167表现出更好的结果，储存后减少5.9log单位，这表明经菌株CBS124167处理的苹果上无害李斯特氏菌群低于2log10cfu/g（图3）。 
实施例2：在20℃下菌株CBS124167抗不同桃品种上不同食物传染病原体的效力
图4-6示出的实施例是抗桃中大肠杆菌O157:H7、猪霍乱沙门氏菌BAA-709和无害李斯特氏菌CECT-910获得的结果，对比菌株CBS124167与实验室中分离的多个其他菌株的效力，这些菌株在相同条件下测定。 
使用了“Merry O’Henry”、“Tardibelle”、“Roig d’Albesa”、“Placido”,“Royal Glory”和“Elegant Lady”品种的桃。接种的菌株CBS124167的悬浮物的浓度为约108cfu/ml，所述病原体以107cfu/ml的浓度接种。所使用的桃的pH为3.6-5.3，酸度为2.8-7.8g苹果酸/l。 
如图4所示，桃上大肠杆菌O157:H7的初始浓度为4.9log10cfu/g，于20℃储存2天后其在未经拮抗物处理的块中增加了约3log单位。在用某些分离的拮抗物接种的块中，大肠杆菌O157:H7的浓度降低了1.8-3.0log单位，而以菌株CBS124167减少了4.3个对数单位，在2天时所述浓度甚至低于初始浓度，这证明了其高效力。 
图5示出相同测定的结果，但以沙门氏菌BAA-709进行。在该情况下，于20℃储存2天后群的增加低于大肠杆菌O157:H7，增加了约2.5log。大体上，以其他拮抗物的减少较低，为0.4-1.8个对数单位，但是以菌株CBS124167处理的苹果块中沙门氏菌BAA-709的减少最大，为2.8log单位。 
图6示出在桃上关于无害李斯特氏菌的数据。在图6中，可观察到，在对照处理（无拮抗物）中每块桃中无害李斯特氏菌群也增加了约3log单位，而在那些以实验室中分离的不同拮抗物接种的块中，群较少，观察到减少了0.7-2.1log单位。同样，以菌株CBS124167获得的减少更多，为4对数单位，同样是最终群甚至少于初始群。 
实施例3：在20℃下菌株CPA-7抗甜瓜上不同食物传染病原体的效力
图7和8示出的实施例是抗甜瓜上猪霍乱沙门氏菌BAA-709和单核细胞增生李斯特氏菌LM230/3菌株获得的结果，对比菌株CBS124167与实验室中分离的多个其他菌株的效力，这些菌株在相同条件下测定。 
甜瓜是一种与苹果和桃相比具有较中性的pH和较低酸度的水果（通常，pH为5.7-6.5，酸度为0.7-1.9g柠檬酸/l）。在该情况下，病原体的问题更加显著，因为所述pH不能作为食物传染病原体生长的屏障。以约108cfu/ml的浓度接种菌株CBS124167的悬浮物，以107 cfu/ml的浓度接种所述病原体。 
图7示出了拮抗微生物的不同菌株（包括CBS124167）抗“Toad  Skin”甜瓜块上沙门氏菌的结果。在该情况下，减少值为1.5-3.2log单位，以菌株CBS124167获得了最大的减少，总计为3.5log单位。可观察到，于20℃储存2天后甜瓜上沙门氏菌的增长在对照处理（无拮抗物）中非常高，为4.2对数单位，最终群高于108cfu/g产品。 
图8示出在于20℃储存2天后的甜瓜中菌株CBS124167抗单核细胞增生李斯特氏菌LM230/3的效力。如可观察到的，在该情况下，对于未经处理的对照而言，也有病原体减少。 
实施例4：在冷藏条件下菌株CBS124167抗“金冠”苹果上大肠杆菌O157:H7的效力
图9示出菌株CBS124167抗在5℃储存的“金冠”苹果上大肠杆菌O157:H7的效力的结果。所述测定通过共接种15μl含菌株大肠杆菌O157:H7（107cfu/ml）和CBS124167（30%透光度，约108cfu/ml）的悬浮物来进行。 
如从图中可见的，在5℃下没有观察到大肠杆菌O157:H7在对照处理的苹果切块上的生长；相反地，在共接种所述拮抗物的样品中，群从储存第二天起减少，7天后减少至低于10cfu/g。 
实施例5：在冷藏条件下菌株CBS124167抗桃上不同食物传染病原体的效力
图10和11示出了菌株CBS124167在5℃和10℃下抗桃（“Elegant Lady”和“Placido”品种）上大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌BAA-709的效力。接种的悬浮物中菌株CBS124167的浓度为约108cfu/ml，病原微生物的浓度为107cfu/ml。 
如图10所示，菌株CBS124167减少了病原体浓度，在5℃下比在10℃下减少的多，在储存6天后，甚至维持在低于检出限的浓度。 
当菌株CBS124167被用于抗“Placido”品种的桃上的沙门氏菌时，获得了相似的结果（图11）。在该情况下，于5℃储存6天后，没有在桃切块中检测到沙门氏菌，而在没有拮抗物的处理（对照）中群得到维持。 
实施例6：在冷藏条件下菌株CBS124167抗甜瓜上猪霍乱沙门氏菌BAA-709的效力
图12示出菌株CBS124167抗在10℃储存的甜瓜上沙门氏菌 BAA-709的效力。接种的悬浮物中菌株CBS124167的浓度为约108 cfu/ml，病原微生物的浓度为107cfu/ml。 
如图所示，在10℃下，在对照处理（无拮抗物）中，所述病原体生长，而在施用CBS124167的处理中，群仍然较低，从储存第6天起减少了多于1.5个对数单位。在5℃和测定条件下，沙门氏菌不能够生长，对于对照处理而言，加入菌株CBS124167没有造成任何的改变。 
实施例7：在20℃下以不同剂量施用菌株CBS124167抗金冠苹果上不同食物传染病原体的效力
表4、5和6示出了以不同剂量施用菌株CBS124167抗不同浓度的病原体大肠杆菌O157:H7、猪霍乱沙门氏菌BAA-709和无害李斯特氏菌CECT-910的效力。根据上文所述公式，以生长减少的Log10单位测量该效力。 
如在附表中可观察到的，所述结果示出等于或大于接种的病原体浓度的菌株CBS124167浓度的病原体生长减少。 
表4.在20℃储存2天的“金冠”苹果上，以作为菌株CBS124167剂量的函数的不同浓度施用的大肠杆菌O157：H7的减少值（Log10单位）。 
Figure BDA00003442426000181
表5在20℃储存2天的“金冠”苹果上，以作为菌株CBS124167剂量的函数的不同浓度施用的猪霍乱沙门氏菌BAA-709的减少值（Log10单位）。 
Figure BDA00003442426000182
Figure BDA00003442426000191
表6在20℃储存2天的“金冠”苹果上，以作为菌株CBS124167剂量的函数的不同浓度施用的无害李斯特氏菌的减少值（Log10单位）。 
Figure BDA00003442426000192
在于苹果中接种沙门氏菌和无害李斯特氏菌的情况下，1:1（病原体：拮抗物）的比例足以观察到大于1.9个对数单位的减少。 
在所测定的剂量中，对三种病原体来说108cfu/ml的剂量是表现出最好的结果（减少了大于3.5个对数单位）的剂量。但是，107cfu/ml剂量的菌株CBS124167被认为是最适于商业化应用的剂量，因为不管水果上病原菌的浓度如何，其保证了使所研究的三种病原体最少减少2个对数单位。 
实施例8：在20℃和10℃下以不同剂量施用的菌株CBS124167抗甜瓜上不同食物传染病原体的效力
在该实施例中，使用了猪霍乱沙门氏菌菌株（BAA-707、BAA-709、BAA-710和BAA-711）或单核细胞增生李斯特氏菌菌株（CECT-4031、CECT-4032、CECT-933、CECT-940和LM230/3）的混合物。 
表7和8示出在储存于20℃的甜瓜上以不同剂量施用的菌株CBS124167抗不同浓度的沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌属的病原体的混合物的效力。根据上文所述公式，以生长减少的Log10单位测量该效力。 
表7.在20℃储存2天的“蟾皮（Toad Skin）”甜瓜上，以作为菌株CBS124167剂量的函数的不同浓度施用的猪霍乱沙门氏菌的减少值（Log10单位）。 
Figure BDA00003442426000201
表8在20℃储存2天的“蟾皮”甜瓜上，以作为菌株CBS124167剂量的函数的不同浓度施用的单核细胞增生李斯特氏菌的减少值（Log10单位）。 
Figure BDA00003442426000202
如表中可以看出的，在甜瓜中，107cfu/ml的菌株CBS124167剂量显示出，以约等价于103cfu/g甜瓜的105cfu/ml甜瓜的浓度施用的沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌的生长减少值等于或大于3.7个对数单位。 
图13和14示出在于10℃储存的甜瓜上不同浓度的菌株CBS124167抗前述以105cfu/ml浓度施用的猪霍乱沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌的混合物的效力。 
如图所示，菌株CBS124167的浓度越高，单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌的减少越大。 
设计用于证明拮抗菌株CBS124167在模拟商业化生产的条件下抗鲜切水果中主要食物传染病原体的效力的测定
下文我们描述了在模拟商业化生产的条件下，在“金冠”苹果上的测定的实施例。 
在该实施例中，使用了猪霍乱沙门氏菌菌株（BAA-707、BAA-709、BAA-710和BAA-711）的混合物和单核细胞增生李斯特氏菌菌株（CECT-4031、CECT-4032、CECT-933、CECT-940和LM230/3）的混 合物。 
将整个苹果消毒，去核并将其切成10片。随后，在搅拌下将其在含有抗氧剂
Figure BDA00003442426000211
AS1（6%,Agricoat Ltd.,Great Shefford,UK）的池中浸没2分钟，然后使其干燥。 
一旦将所述苹果片以所述抗氧剂处理，就将其在搅拌下于含有所述病原体的混合物和拮抗物菌株的悬浮物中浸没1分钟，模拟在水果处理流水线槽中会发生的应用。在对照处理中，将所述苹果片浸没于含有病原体菌株的混合物、不含拮抗菌株的悬浮物中。 
随后，使所述苹果片滴干水，包装（200g）于500ml容量的聚丙烯容器中，用惯常使用类型的聚丙烯薄膜密封，所述聚丙烯薄膜的厚度为35μm，23℃下O2和CO2渗透率为3500cm3/m2*天*atm，25℃和75%相对湿度下蒸汽渗透率为0.9g/m2*天。由于水果的呼吸作用和所述薄膜对O2和CO2的渗透率特性，在所述容器内形成了被动气调（PMA）。拮抗菌株CBS124167可受该气氛影响，因为这个原因也应证明其在这种气调条件下的效力。 
将所述苹果片于5℃和10℃储存15天（这种类型产品的估计存放期）。定期进行微生物计数并测定不同的性质参数（颜色、质地、pH、酸度、可溶性固形物含量和视觉性质）。 
为了获得菌株CBS124167的悬浮物，使用了在TSB液体培养基中的生产，并为107cfu/ml的菌株浓度调节了透光度百分数（λ=420nm）。 
将所述病原体接种至含有10ml TSB培养基（猪霍乱沙门氏菌BAA-707、BAA-709、BAA-710和BAA-711）或TYSEB培养基（单核细胞增生李斯特氏菌CECT-4031、CECT-4032、CECT-933、CECT-940和LM230/3）的管中，于37℃孵育20-24小时。随后，将其以8000rpm离心10分钟，用5ml盐水溶液（0.85g/l NaCl）重新溶解所述细胞沉淀。通过测量420nm下的透光度和先前在实验室获得的各个病原体的曲线，确定了估计的病原体浓度，其在所描述的测定中是浓度为105cfu/ml的悬浮物。 
实施例9：在模拟商业化条件的条件下菌株CBS124167抗在不同温度下包装的“金冠”苹果切块上不同食物传染病原体的效力
图15和16示出了在5℃和10℃下在“金冠”苹果上抗前述沙门氏菌和 单核细胞增生李斯特氏菌菌株的混合物的结果。 
通过浸没苹果片接种的所述悬浮物含有浓度为107cfu/ml的CBS124167菌株和浓度为105 cfu/ml的所述两种病原微生物。 
如可从图中观察到的，菌株CBS124167可在观察到生长的地方有效抗沙门氏菌，尤其是在10℃下。在单核细胞增生李斯特氏菌的情况下，在5℃和10℃都观察到生长减少。 
因此，可得出结论，菌株CBS124167可在模拟商业化条件(冷藏和被动气调，PMA)的条件下有效抗不同食物传染病原体。 
此外，值得注意的是，施用菌株CBS124167不影响苹果的颜色、质地、可溶性固形物或酸度。 
虽然已经描述并说明了本发明的具体实施例，但是很明显的是，本领域的技术人员可引入变化和修改，或者用技术上的等同物替代其部分，而不超出所附权利要求书限定的保护范围。 
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Claims (25)

1.禾草假单胞菌种的菌株的基本纯生物培养物，禾草假单胞菌种的菌株以编号CBS124167保藏在保藏机构位于荷兰乌特勒支的荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）。
2.权利要求1的CBS124167培养物作为用于生物防治供人消费的水果中食物传染病原菌的拮抗物的用途。
3.权利要求2的用途，其中所述水果是切成块的水果或最少加工的水果。
4.权利要求2-3任一项的用途，其中所述病原菌是沙门氏菌属（Salmonella spp.）微生物。
5.权利要求2-4任一项的用途，其中所述病原菌是李斯特氏菌属（Listeria spp.）微生物。
6.权利要求2-5任一项的用途，其中所述病原菌是大肠杆菌（Escherichia coli）O157:H7微生物。
7.权利要求4的用途，其中所述沙门氏菌属为猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）种。
8.权利要求5的用途，其中所述李斯特氏菌属为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）种或无害李斯特氏菌（Listeria innocua）种中的任何一种。
9.权利要求2-8任一项的用途，其中所述生物防治通过将所述水果保持于高于10℃的温度下进行。
10.权利要求9的用途，其中所述生物防治通过将所述水果保持于等于或高于20℃的温度下进行。
11.权利要求2-8任一项的用途，其中所述生物防治通过将所述水果保持在冷藏条件下进行。
12.权利要求2-11任一项的用途，其中所述生物防治通过将所述水果保持在气调中进行。
13.权利要求2-3任一项的用途，其中所述水果是pH为3-7的水果。
14.权利要求13的用途，其中所述水果是苹果。
15.权利要求13-14任一项的用途，其中所述水果是桃。
16.权利要求13-15任一项的用途，其中所述水果是甜瓜。
17.处理水果的方法，所述方法包括将包含禾草假单胞菌种的菌株的培养物的制剂施用于水果的步骤，所述禾草假单胞菌种的菌株以编号CBS124167保藏在保藏机构位于荷兰乌特勒支的荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）。
18.权利要求17的方法，所述方法包括将所述水果切成块、然后施用所述制剂的步骤。
19.权利要求17-18任一项的方法，其中所述制剂中菌株CBS124167的浓度等于或大于所述水果可能含有的估计的病原体浓度。
20.权利要求19的方法，其中所述制剂中菌株CBS124167的浓度等于或大于105cfu/ml。
21.权利要求20的方法，其中所述制剂中菌株CBS124167的浓度等于或大于107cfu/ml。
22.权利要求17-21任一项的方法，所述方法包括一旦施用所述制剂就包装所述水果的步骤。
23.权利要求17-22任一项的方法，所述方法包括向所述水果提供气调的步骤。
24.权利要求17-23任一项的方法，所述方法包括向所述水果提供冷藏温度的步骤。
25.权利要求17-24任一项的方法，所述方法包括将抗氧剂施用于所述水果、然后施用所述制剂的步骤。
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