ES2624788T3 - Cultivo biológico de una cepa de la especie Pseudomonas graminis y uso de dicho cultivo como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas - Google Patents

Cultivo biológico de una cepa de la especie Pseudomonas graminis y uso de dicho cultivo como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas Download PDF

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ES2624788T3 ES13382530.7T ES13382530T ES2624788T3 ES 2624788 T3 ES2624788 T3 ES 2624788T3 ES 13382530 T ES13382530 T ES 13382530T ES 2624788 T3 ES2624788 T3 ES 2624788T3
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Abstract

Cultivo biológico sustancialmente puro de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el número CBS136973 en la institución de depósito "Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.

Description

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DESCRIPCION
Cultivo biologico de una cepa de la especie pseudomonas graminis y uso de dicho cultivo como antagonista para el control biologico de bacterias patogenas.
La presente invencion se refiere a un cultivo biologico de una cepa de la especie Pseudomonas graminis y a la utilizacion de dicha cepa como antagonista para el control biologico de bacterias patogenas de transmision alimentaria en fruta. Tambien se refiere a un metodo para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparacion que comprende dicho cultivo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La fruta fresca cortada o fruta de cuarta gama es un producto de reciente aparicion en los mercados. Esta fruta es sometida a un procesado mlnimo consistente en la limpieza, pelado, corte, desinfeccion y envasado en atmosfera modificada pasiva o activa, conservandose finalmente en condiciones de refrigeracion.
La fruta cortada es un producto alimenticio muy susceptible a alteraciones flsicas, qulmicas y biologicas, que se deteriora a mayor velocidad que las piezas enteras. En la fruta cortada la respiracion y los procesos metabolicos se aceleran como resultado de la manipulacion, por lo que resulta esencial conservar el producto en atmosfera modificada y mantenerlo en condiciones de refrigeracion.
La reglamentacion actual aplica unos criterios microbiologicos muy estrictos a la fruta cortada con el objetivo de reducir al mlnimo las toxiinfecciones alimentarias o enfermedades originadas por la ingesta de fruta contaminada con bacterias del tipo Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli O157:H7.
En la actualidad, para garantizar la seguridad alimentaria de los productos de cuarta gama resulta habitual aplicar tratamientos consistentes en lavar la fruta con agua adicionada con hipoclorito sodico. Estos tratamientos consiguen reducir la carga microbiana de los productos pero presentan el inconveniente de que pueden dejar un residuo de cloro que facilita la formacion de sustancias que podrlan tener caracter cancerlgeno. Ademas, el tratamiento con hipoclorito no previene el crecimiento de los microorganismos durante la conservacion de la fruta o durante la vida util del producto.
El control biologico de las bacterias patogenas de transmision alimentaria en productos de cuarta gama es una alternativa a los tratamientos con hipoclorito sodico que resulta muy deseable. No obstante, para que esta alternativa sea viable resulta imprescindible hallar microorganismos antagonistas que sean efectivos contra cualquiera de los tres tipos de bacterias patogenas citadas (Salmonella spp., Listeria spp., y Escherichia coli O157:H7), tanto a temperatura ambiente como en condiciones de refrigeracion y atmosfera modificada. Ademas, es deseable que estos antagonistas sean innocuos tanto para los humanos como para los vegetales ya que, en caso contrario, podrlan perjudicar al consumidor o al producto tratado.
En el estado de la tecnica se han descrito antagonistas para el control biologico de bacterias patogenas de transmision alimentaria en fruta (“Biological control of postharvest decays of apple can prevent growth of Escherichia coli O157:H7 in apple wounds”, Janisiewicz, W. et al. JOURNAL OF FOOD PROTECTION 62 (12): 1372-1375. 1999 y “Biocontrol of the food-borne pathogens Listeria monocytogenes and Salmonella enterica serovar Poona on fresh-cut apples with naturally occurring bacterial and yeast antagonists.” Leverentz, B. et al. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY 72 (2):1135-1140. 2006).
Sin embargo, los antagonistas empleados no pertenecen a la especie Pseudomonas graminis y, ademas, ninguno de ellos es efectivo contra cualquiera de los microorganismos Salmonella spp. Listeria spp. y Escherichia coli O157H7 tanto a temperatura ambiente como en condiciones de refrigeracion.
DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION
Un primer objetivo de la presente invencion es proporcionar un cultivo biologico sustancialmente puro de una nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis depositada con el numero CBS136973 en la institution de deposito “Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.
Un segundo objetivo es proporcionar un cultivo biologico sustancialmente puro de una nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis depositada con el numero CBS136973 para su uso como antagonista para el control biologico de bacterias patogenas de transmision alimentaria en fruta para consumo humano.
Un tercer objetivo de la presente invencion consiste en el uso del mencionado cultivo biologico de la nueva cepa como antagonista para el control biologico de bacterias patogenas de transmision alimentaria en fruta para consumo humano.
Un cuarto objetivo consiste en proporcionar un metodo para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparacion que comprende el mencionado cultivo biologico de la nueva cepa.
Se ha observado que la nueva cepa aislada muestra una gran efectividad como antagonista frente
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bacterias patogenas de transmision alimentaria en fruta, en una amplia gama de patogenos y frutas, a temperatura ambiente, en atmosfera modificada y en condiciones de refrigeration. Su aplicacion permite reducir el crecimiento de los patogenos durante la vida util del producto, especialmente cuando se rompe la cadena de frlo.
En la presente invention, por bacterias patogenas de transmision alimentaria se entendera bacterias patogenas causantes de toxiinfecciones alimentarias o enfermedades originadas por la ingesta de alimentos contaminados, por ejemplo, fruta contaminada con bacterias patogenas del tipo Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli O157:H7.
La nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis (Behrendt et al.19991) se aislo de la superficie de una manzana “Golden Delicious” mediante un lavado con agua esteril, seguido de la inmersion en solution de peptona salina (peptona, 1 g/l; NaCl, 0,85 g/l), sonicacion en un bano de ultrasonidos durante 10 min y siembra del liquido de lavado en medio de cultivo NYDA (Caldo nutritivo, 8 g/l; extracto de levadura, 5 g/l; dextrosa, 10 g/l y agar 15 g/l) y posterior incubation a 25 °C durante 3 dlas.
El cultivo de la nueva cepa ha sido depositado por uno de los solicitantes, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del deposito de microorganismos para el proposito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de deposito “Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)” con domicilio en Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrech, Holanda. El numero de deposito asignado ha sido el CBS136973.
El aislado CBS136973 fue identificado mediante secuenciacion parcial de la region 16S rRNA: Pseudomonas sp., y mediante secuenciacion total de la region 16S rRNA: Pseudomonas graminis (Behrendt et al.19991).
Caracteristicas morfologicas y bioauimicas de la nueva cepa
La cepa CBS136973 es un bacilo gramnegativo, no formador de esporas, oxidasa negativo y catalasa positivo, movil y aerobio. En placa, las colonias son amarillas, de forma circular con bordes enteros.
La cepa CBS136973 presenta las caracteristicas bioqulmicas que se detallan en la Tabla 1 y se diferencia fenotlpicamente de otras especies de Pseudomonas por las pruebas que se muestran en la Tabla 2.
La temperatura de crecimiento esta comprendida entre 5 °C y 30 °C, con un optimo entre 25 °C y 30 °C. No crece ni a 33 °C ni a 0 °C.
El crecimiento en placas puede llevarse a cabo en medio de cultivo AN (Agar Nutritivo: Triptona 5 g/l, extracto de carne 3 g/l, agar 15 g/l), TSA (Caldo de triptona soja: triptona 15 g/l, peptona de soja 5,0 g/l, cloruro sodico 5,0 g/l y agar 15 g/l, pH 7,3) o NYDA (Caldo nutritivo: 8 g/l; extracto de levadura, 5 g/l; dextrosa, 10 g/l y agar 15 g/l).
El crecimiento en liquido puede llevarse a cabo en medio de cultivo TSB (Caldo de triptona soja: digerido pancreatico de caseina 17,0 g/l, digerido enzimatico de soja 3,0 g/l, cloruro sodico 5,0 g/l, dipotasio hidrogeno fosfato 2,5 g/l, glucosa 2,5 g/l, pH 7,3). Tambien puede usarse el medio NB (Caldo nutritivo: triptona 10 g/l, extracto de carne 5 g/l, cloruro sodico 5 g/l, pH 7,2)
El crecimiento de la cepa CBS136973 en medio TSB o NB en condiciones aerobias, en agitation y a temperatura de 25 y 30 °C, alcanza un maximo poblacional a las 20-24 h de incubacion (generalmente entre 1,9 y 2,9 x 109 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml), sin presentar grandes diferencias entre los dos medios de cultivo.
Tabla 1. Pruebas enzimaticas de las tiras bioquimicas API 20 NE - Sistema de identificacion de bacterias de la marca Biomerieux. Resultados despues de 24 h y 48 h a 30 °C.
TEST
COMPONENTES ACTIVOS Reacciones enzimaticas Resultado 24 h Resultado 48 h
NOa
Nitrato potasico Reduccion de nitratos en nitritos - nd
Reduccion de nitratos en nitrogeno - nd
TRP
L-triptofano Formacion de indol (TRiPtofano) - nd
GLU
D-glucosa Fermentacion (GLUcosa) - nd
ADH
L-arginina Arginina Di-Hidrolasa - -
URE
Urea Ureasa - -
ESC
Esculina Citrato ferrico Hidrolisis (b-glucosidasa) (ESCulina) + +
GEL
Gelatina (origen bovino) Hidrolisis (proteasa) (GELatina) - -
PNG
4-nitrofenil-bD- galactopi ranosida b-galactosidasa (Para-NitroFenil-bD- Galactopiranosidasa) + +
GLU
D-glucosa Asimilacion (GLUcosa) + +
ARA
L-arabinosa Asimilacion (ARAbinosa) + +
MNE
D-manosa Asimilacion (MaNosE) -/w +
MAN
D-manitol Asimilacion (MANitol) v +
NAG
N-acetil-glucosamina Asimilacion (N-Acetil-Glucosamina) - v
MAL
D-maltosa Asimilacion (MALtosa) v v
GNT
Gluconato potasico Asimilacion (GlucoNaTo potasico) + +
CAP
Acido capricho Asimilacion (acido CAPrico) v +
ADI
Acido adlpico Asimilacion (acido ADIpico) - -
MLT
Acido malico Asimilacion (MaLaTa) + +
CIT
Citrato trisodico Asimilacion (CITrato trisodico) + +
PAC
Acido fenilacetico Asimilacion (acido fenilACetico) - -
(+ positivo, - negativo, w debil , v variable, nd no determinado) 5
Tabla 2. Caracterlsticas fenotlpicas que diferencian la cepa CBS136973 de otras especies de Pseudomonas.
Caracterlstica
Cepa CBS136973 P. graminisa P. lutea P. rhizosphaerae
Oxidasa
-b - - -
Crecimiento a 6°C
+ + + nd
Produccion de acido a partir de glucosa
- - - -
Utilization de eritritol
- - - +
Utilizacion de sorbitol
W + - +
Utilizacion de xilitol
- v + -
Utilizacion de melibiosa
- - + -
Utilizacion de rhamnosa
- - - +
Hidrolisis de aesculina
+ + + -
Hidrolisis de gelatina
- v - -
a: Los datos de las especies de referencia se han tomado de Peix et al. (20033, 20044) y Behrendt et al. (19991). b: +: 10 positivo; - : negativo; w: debil; v: reaccion variable entre cepas de la misma especie; nd: datos no disponibles
Produccion de sustancias antimicrobianas
Se han llevado a cabo experimentos para determinar si la cepa CBS136973 produce sustancias 15 antimicrobianas. Para ello, la cepa se hizo crecer en medio TSB a 30 °C, durante 20-24 h. Del cultivo obtenido, se reservo una fraccion, a la que se llamo “cultivo, CUL”, que contenla tanto celulas como medio de cultivo y posibles metabolitos producidos durante el crecimiento. El resto se centrifugo a 8000 rpm durante 10 min, a 10°C. El pH del sobrenadante se ajusto a 6,5 y se esterilizo mediante filtracion (0,22 pm), obteniendo un “sobrenadante neutro libre de celulas, SNLC”. La fraccion celular obtenida tras la centrifugacion se resuspendio en agua desionizada esteril, se
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centrifugo y lavo dos veces consecutivas para la eliminacion de posibles restos de medio de cultivo, obteniendo unicamente “celulas, CEL”.
Se determino la efectividad de estas tres fracciones: CUL, SNLC y CEL, en condiciones in vitro, frente a varios cultivos indicadores: Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria innocua y Listeria monocytogenes. Para ello, Salmonella spp. y Escherichia coli O157:H7 se hicieron crecer en medio TSB y Listeria spp. en TYSEB (TSB suplementado con 6 g/l de extracto de levadura) a 37 °C, durante 18-20 h. Se anadio 50 ml de cada uno de los cultivos obtenidos a tubos conteniendo 10 ml de medio TSB (Salmonella spp. y Escherichia coli O157:H7) o TYSEB (Listeria spp.) conteniendo 7,5 g/l de agar y temperados a 45°C.
El contenido de cada uno de los tubos (medio + cultivo indicador) se deposito sobre placas conteniendo 20 g/l extracto de carne, 20 g/l de glucosa y 15 g/l de agar. Una vez solidificado, se depositaron 5 ml del CUL, SNLC o CEL y las placas se incubaron a 30 °C, durante 20 h, tras las cuales se indico la presencia o no de un halo de inhibicion.
No se observo inhibicion del crecimiento de los patogenos indicadores en aquellos tratamientos donde se inoculo el sobrenadante neutro libre de celulas por lo que se descarta la produccion de sustancias antimicrobianas por parte de la cepa CBS136973 en las condiciones ensayadas.
Tambien se ha ensayado la efectividad in vivo en manzana cortada del sobrenadante frente a Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. y Listeria innocua y se ha comparado con la efectividad de las celulas. Se ha visto que los sobrenadantes libres de celulas no tienen ningun efecto sobre el patogeno, e incluso favorecen su crecimiento tras 2 dlas de conservacion a 20 °C.
Fitopatogenicidad
Tambien se ha determinado si la cepa CBS136973 es o no fitopatogena, capaz de producir reaccion de hipersensitividad en hojas de tabaco, segun la metodologla de Noval et al. 19912. Para ello se preparo una suspension de 109 ufc/ml de la cepa y se inyecto en las venas de hojas de tabaco utilizando una jeringuilla de insulina. Se utilizo agua para el control negativo y la cepa CPA-3 de Pantoea ananatis como control positivo, ya que esta cepa si es fitopatogena. Las plantas se mantuvieron a temperatura ambiente y periodicamente se observo si presentaban o no slntomas de hipersensitividad, en forma de necrosis, amarillamiento de la zona infiltrada y muerte de las hojas. No se observo ninguna reaccion en las hojas tratadas, incluso con altas dosis de CBS136973 (109 ufc/ml). Por lo tanto, la cepa CBS136973 no es fitopatogena.
Supervivencia al jugo gastrico en contacto directo e inoculada en manzana
Para valorar la supervivencia en contacto directo, se anadieron 50 ml de una suspension de 109 ufc/ml de la cepa CBS136973 en una solucion simulada de saliva y jugo gastrico (6,2 g/l NaCl, 2,2 g/l KCl, 0,22 g/l de CaCl2 y 1,2 g/l NaHCO3, 0,3 g/l pepsina; pH ajustado a 2,0, temperada a 37 °C) y se incubo a 37 °C, durante 2 h. Se tomo muestra al cabo de 1 y 2 h. No se detecto ninguna celula viable de la cepa de la presente invencion, incluso tras 10 min de contacto.
Para valorar la supervivencia al jugo gastrico de la cepa CBS136973 sobre manzana, se inocularon manzanas “Golden Delicious” con la cepa CBS136973 a una dosis de 107 ufc/ml mediante inmersion en bano durante 2 min. Se dejaron secar y se envasaron en barquetas de polipropileno y se sellaron con film de polipropileno de 35 mm de grosor y una permeabilidad al O2 y CO2 de 3500 cm3/m2*dia*atm a 23 °C, y al vapor de agua de 0,9 g/m2*dla a 25 °C y 75 % de humedad relativa, y se conservaron a 5°C. Tras 0, 4, 7 y 14 dlas, se tomaron 10 g y se sometieron a una simulacion de transito gastrico. Para ello se mezclaron con 10 ml de solucion artificial de saliva (6,2 g/l NaCl, 2,2 g/l KCl, 0,22 g/l de CaCl2 y 1,2 g/l NaHCO3), temperada a 37 °C. Se homogenizo durante 2 min y se transfirio a un matraz Erlenmeyer con 80 ml de jugo gastrico (0,3 g/l pepsina; pH 2,0) y se incubo a 37 °C durante 2 h. A continuacion se determino la poblacion viable de la cepa, mediante siembra en placas de medio AN.
No se observaron celulas viables tras 2 h de contacto con el jugo gastrico en ninguna de las muestras analizadas. Por tanto, puede deducirse que la cepa de la presente invencion no sobrevive al paso gastrico. Esto es positivo pues, aunque las celulas crezcan sobre la superficie de la fruta durante su conservacion, dichas celulas no pueden causar ningun dano al ingerir la fruta tratada ya que no sobreviviran al transito gastrico. Cabe mencionar tambien que no se han encontrado referencias que relacionen la especie Ps. graminis con casos de toxiinfecciones alimentarias.
Crecimiento en la fruta
Se ha observado que la cepa CBS136973 es capaz de crecer en manzana, melocoton y melon cortados a distintas temperaturas, aunque el crecimiento es mucho mayor en melon, debido a su menor acidez (mayor pH). Tambien se ha observado crecimiento en manzana conservada en condiciones de atmosfera modificada y a temperatura o condiciones de refrigeracion.
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DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Se ha observado que la cepa CBS136973 es muy efectiva contra bacterias patogenas de transmision alimentaria en fruta, preferiblemente, en fruta cortada a trozos y, ventajosamente, contra los microorganismos Salmonella spp., Listeria spp., y/o Escherichia coli O157:H7, que son los mas importantes en frutas y hortalizas.
Gracias a ello, la cepa CBS136973 puede usarse como antagonista contra cualquiera de dichos microorganismos, favoreciendo el cumplimiento de los criterios microbiologicos establecidos especialmente para fruta cortada o fruta de cuarta gama, para evitar las toxiinfecciones alimentarias o enfermedades originadas por la ingesta de fruta contaminada con bacterias del tipo Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli O157:H7.
En particular, la efectividad en Salmonella spp. se ha observado para la especie Salmonella choleraesuis, mientras que la efectividad en Listeria spp. se ha observado para las especies Listeria monocytogenes y Listeria innocua.
Segun una primera realizacion de la presente invencion, la cepa de la presente invencion se usa para el control biologico en fruta, preferiblemente fruta cortada a trozos, manteniendo la fruta a una temperatura superior a 10 °C, preferiblemente, una temperatura igual o superior a 20 °C.
A temperatura ambiente, se ha observado que la cepa CBS136973 puede frenar el crecimiento, e incluso reducir, a cualquiera de los microorganismos antes citados, inclusive cuando estos microorganismos estan presentes en la fruta a una concentracion igual o superior a 103 ufc/g, que es una concentracion muy elevada y diflcil que se de en la realidad.
Este uso es particularmente ventajoso ya que permite controlar el crecimiento de los patogenos en los casos en que la temperatura de conservacion de la fruta no es la adecuada, o se corta la cadena de frlo del producto durante el almacenamiento o transporte, por ejemplo, por problemas en el mantenimiento de los equipos de refrigeracion de la fruta. Es muy importante que la cepa sea efectiva a temperatura ambiente, ya que a esta temperatura es cuando el microorganismo patogeno puede crecer mas y por tanto se incrementa el riesgo en el consumidor.
Segun una segunda realizacion, la cepa de la presente invencion se usa para el control biologico en fruta, por ejemplo fruta cortada a trozos, manteniendo la fruta en condiciones de refrigeracion. Por condiciones de refrigeracion se entendera el mantenimiento de la fruta a una temperatura de refrigeracion igual o inferior a 10°C, preferiblemente, igual o inferior a 5°C.
Sorprendentemente, la efectividad de la cepa CBS136973 contra cualquiera de los microorganismos Salmonella spp., Listeria spp. y Escherichia coli O157:H7 se ha demostrado tambien a las temperaturas de refrigeracion que son las que marca el productor o distribuidor para la conservacion de la fruta.
Segun una tercera realizacion, la cepa de la presente invencion se usa para el control biologico en fruta, preferiblemente, fruta cortada, manteniendo la fruta en una atmosfera modificada. Por atmosfera modificada se entendera una atmosfera con una composicion de gases diferente a la del aire para mejorar las condiciones en que se conserva la fruta.
La cepa de la presente invencion muestra tambien efectividad cuando la fruta es envasada en atmosfera modificada para su conservacion. Gracias a ello, la cepa puede ser empleada en las condiciones habituales de comercializacion, por lo que es posible garantizar la seguridad alimentaria tambien en las condiciones de los lineales de los supermercados o tiendas.
Ventajosamente, dicha fruta es fruta con un pH comprendido entre 3 y 7, por ejemplo, frutas como manzana, melocoton y/o melon.
Se ha observado que el crecimiento de Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli O157:H7 puede darse en un amplio rango de fruta, a pesar de las condiciones de acidez de ciertas frutas como la manzana. Tambien, se ha observado que el crecimiento de las mencionadas bacterias es muy rapido en frutas menos acidas como el melon. Sin embargo, gracias a la cepa de la presente invencion, el crecimiento de estos patogenos puede ser controlado en un amplio rango de frutas.
Tal y como se ha comentado en la descripcion de la invencion, un objetivo de la presente invencion es el de proporcionar un metodo de preparacion de fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparacion que comprende el cultivo biologico de la nueva cepa CBS136973.
Segun una realizacion preferida de dicho metodo, la fruta es cortada a trozos antes de aplicar dicha
preparacion.
Preferiblemente, la concentracion de la cepa CBS136973 en dicha preparacion es igual o superior a la concentracion estimada de patogeno que puede contener la fruta, preferiblemente, la fruta cortada.
Segun una realizacion, la concentracion de dicha cepa en la preparacion es igual o superior a 105 ufc/ml.
Se ha observado que esta concentracion tiene efectos contra cualquiera de los tres microorganismos Salmonella spp., Listeria spp. y/o Escherichia coli O157:H7 y a concentraciones mucho mas elevadas de las que dichos microorganismos pueden encontrarse en la fruta cortada en la realidad.
Ventajosamente, la concentracion de dicha cepa en la preparacion es igual o superior a 107 ufc/ml.
Se ha observado que esta concentracion garantiza una reduccion de las bacterias patogenas de al menos
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dos unidades logarltmicas (dos unidades de la escala logarltmica decimal), independientemente de la concentracion de bacterias patogenas de la fruta.
Segun otra realizacion, el metodo comprende la etapa de envasar la fruta una vez aplicada dicha
preparacion.
Ventajosamente, dicho metodo comprende tambien la etapa de proporcionar a la fruta una atmosfera modificada y/o la etapa de proporcionar a la fruta una temperatura de refrigeracion, por ejemplo, una temperatura igual o inferior a 10 °C, preferiblemente, una temperatura igual o inferior a 5 °C.
La atmosfera modificada puede proporcionarse de una forma pasiva, por ejemplo, envasando el producto mediante la utilizacion de pellculas plasticas de diferente permeabilidad a los gases, creando de forma pasiva una atmosfera modificada favorable como resultado de la permeabilidad de la pared del envase y factores como la respiracion del producto y cambios bioqulmicos.
El envasado del producto en atmosfera modificada contribuye a mantener la calidad de frescura de la fruta cortada durante mas tiempo, por lo que la vida util del producto se alarga.
Tal y como se ha comentado anteriormente, la cepa de la presente invencion es efectiva tambien en estas condiciones de envasado en atmosfera modificada.
Ventajosamente, dicho metodo de preparacion de la fruta, preferiblemente fruta cortada, comprende la etapa de aplicar un antioxidante a la fruta, antes de aplicar la suspension que contiene la cepa.
Se ha observado que la cepa de la presente invencion no se ve alterada por el empleo de algunas sustancias antioxidantes, por lo que dichas sustancias antioxidantes pueden emplearse para retardar la oxidacion de la fruta.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Para mayor comprension de cuanto se ha expuesto se acompanan unos dibujos en los que, esquematicamente y solo a tltulo no limitativo, se representan resultados de varios ejemplos de realizacion.
En dichos dibujos,
la figura 1 es una representacion grafica que muestra la poblacion de Escherichia coli O157:H7 en los cilindros de manzana tras la inoculacion (concentracion inicial), tras 2 dlas de incubacion a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra el antagonista CBS136973. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estandar. Los numeros entre parentesis indican la media de la reduccion obtenida.
la figura 2 es una representacion grafica que muestra la poblacion de Salmonella choleraesuis BAA-709 en los cilindros de manzana tras la inoculacion (concentracion inicial), tras 2 dlas de incubacion a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS136973. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estandar. Los numeros entre parentesis indican la media de la reduccion obtenida.
la figura 3 es una representacion grafica que muestra la poblacion de Listeria innocua CECT-910 en los cilindros de manzana tras la inoculacion (concentracion inicial ), tras 2 dlas de incubacion a 20 °C sin
antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS136973. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estandar. Los numeros entre parentesis indican la media de la reduccion obtenida.
la figura 4 es una representacion grafica que muestra la poblacion de Escherichia coli O157:H7 en los cilindros de melocoton tras la inoculacion (concentracion inicial), tras 2 dlas de incubacion a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS136973. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estandar. Los numeros entre parentesis indican la media de la reduccion obtenida.
la figura 5 es una representacion grafica que muestra la poblacion de Salmonella choleraesuis BAA-709 en los cilindros de melocoton tras la inoculacion (concentracion inicial), tras 2 dlas de incubacion a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS136973. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estandar. Los numeros entre parentesis indican la media de la reduccion obtenida.
la figura 6 es una representacion grafica que muestra la poblacion de Listeria innocua CECT-910 en los cilindros de melocoton tras la inoculacion (concentracion inicial), tras 2 dlas de incubacion a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS136973. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estandar. Los numeros entre parentesis indican la media de la reduccion obtenida.
la figura 7 es una representacion grafica que muestra la poblacion de Salmonella choleraesuis BAA-709 en los cilindros de melon tras la inoculacion (concentracion inicial) y tras 2 dlas de incubacion a 20 °C sin antagonista (control) y con 12 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS136973. Los valores
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representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estandar. Los numeros entre parentesis indican la media de la reduccion obtenida.
la figura 8 es una representacion grafica que muestra la poblacion de Listeria monocytogenes LM230/3 en los cilindros de melon tras la inoculacion (concentracion inicial), tras 2 dlas de incubacion a 20 °C sin antagonista (control) y con 12 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS136973. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estandar. Los numeros entre parentesis indican la media de la reduccion obtenida.
la figura 9 es una representacion grafica que muestra la evolucion en el tiempo de la poblacion de Escherichia coli O157:H7 en cilindros de manzana co-inoculados o no con una suspension de la cepa CBS136973 (108 ufc/ml) y conservados a 5 °C.
la figura 10 es una representacion grafica que muestra la evolucion en el tiempo de la poblacion de Escherichia coli O157:H7 en cilindros de melocoton co-inoculados o no con una suspension de la cepa CBS136973 (108 ufc/ml) y conservados a 5 °C y a 10 °C.
la figura 11 es una representacion grafica que muestra la evolucion en el tiempo de la poblacion de Salmonella cholearaesuis BAA-709 en cilindros de melocoton co-inoculados o no con una suspension de la cepa CBS136973 (108 ufc/ml) y conservados a 5 °C.
la figura 12 es una representacion grafica que muestra la evolucion en el tiempo de la poblacion de Salmonella cholearaesuis BAA-709 en cilindros de melon co-inoculados o no con una suspension de la cepa CBS136973 (108 ufc/ml) y conservados a 5 °C y a 10 °C.
la figura 13 es una representacion grafica que muestra la evolucion en el tiempo de la poblacion de un coctel de cepas de Listeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3) en cilindros de melon co-inoculados o no con la cepa CBS136973 a distintas concentraciones y conservados a 10 °C.
la figura 14 es una representacion grafica que muestra la evolucion en el tiempo de la poblacion de un coctel de cepas de Salmonella choleraesuis (BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) en cilindros de melon co- inoculados o no con la cepa CBS136973 a distintas concentraciones y conservados a 10 °C.
la figura 15 es una representacion grafica que muestra la evolucion en el tiempo de la poblacion de un coctel de cepas de Salmonella choleraesuis (BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) en manzana cortada tratada con antioxidante e inoculada o no con la cepa CBS136973 a 107 ufc/ml, mediante inmersion durante 2 min, y conservada en envasado en atmosfera modificada (MAP) a 5 °C y 10 °C.
la figura 16 es una representacion grafica que muestra la evolucion en el tiempo de la poblacion de un coctel de cepas de Listeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3) en manzana cortada tratada con antioxidante e inoculada o no con la cepa CBS136973 a 107 ufc/ml, mediante inmersion durante 2 min, y conservada en envasado en atmosfera modificada (MAP) a 5 °C y 10 °C.
DESCRIPCION DE EJEMPLOS
A continuacion se exponen distintos ensayos los cuales deben interpretarse como un medio auxiliar para la mejor comprension de la invencion y no como limitaciones al objeto de la misma.
El efecto antagonista se ha ensayado en distintas cepas de los generos Salmonella y Listeria y en una cepa de Escherichia coli O157:H7. Estos patogenos son los mas importantes en frutas y hortalizas. En la Tabla 3 adjunta aparecen las cepas de microorganismos patogenos de transmision alimentaria utilizados en los ensayos.
En primer lugar, se describen los ejemplos realizados para demostrar la efectividad en condiciones de laboratorio. En segundo lugar, se describen los ejemplos realizados para demostrar la efectividad en condiciones que simulan la produccion comercial.
Ensayos para demostrar la efectividad de la cepa CBS136973 frente a los principales patogenos de transmision alimentaria en fruta cortada en condiciones de laboratorio.
A continuacion se describen una pluralidad de ejemplos de ensayos en condiciones de laboratorio que demuestran la efectividad de la cepa CBS136973 aplicada a distintas dosis, en distintas frutas, a temperatura ambiente y en condiciones de refrigeration.
Las cepas de microorganismos patogenos utilizados en estos ensayos fueron: Listeria innocua (CECT-910), Escherichia. coli O157:H7 (NCTC-12900), y Salmonella choleraesuis (BAA-709, BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA- 711) y, en algun caso, Listeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3), (ver Tabla 3).
Las frutas se desinfectaron previamente mediante aspersion con etanol 70%. A continuacion se prepararon trozos en forma cillndrica de la fruta a ensayar, mediante un sacabocados, de dimensiones 1,2 cm de diametro y 1 cm de altura, que equivalen aproximadamente a 1 g de fruta. Estos trozos se introdujeron en el interior de tubos de ensayo esteriles y se inocularon con 15 ml de una suspension que contenla los dos microorganismos (patogeno y antagonista),
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llamese co-inoculacion. En el tratamiento control, el patogeno se anadio a un tubo con 10 ml de agua esteril (sin microorganismo antagonista). Tras la co-inoculacion, se dejo secar la fruta a temperatura ambiente. A continuacion, se tomaron 3 tubos, de los que se midio la concentracion inicial de patogeno mediante siembra en medios de cultivo especlficos. Los otros tubos se conservaron a 20 °C, 10 °C o 5 °C, en funcion del ensayo. Al cabo de 2 dlas (ensayos conservacion a 20 °C), o de 2-3 dlas, 5-7 dlas y 10 dlas (ensayos a 5 o 10 °C), se volvio a determinar la concentracion de patogeno por trozo de fruta en las muestras con antagonista (tratamiento con antagonista) y en las que no tenlan antagonista (tratamiento control). Los datos de concentracion se transformaron a logaritmo decimal.
Para calcular el valor de reduccion del crecimiento del patogeno se uso la siguiente formula:
Reduccion (unidades logarltmicas decimales) = log10Ct-control - log10 Ct+antagonista, donde:
Ct-control es la concentracion del patogeno en el tratamiento control despues de “t” dlas de conservacion, y Ct+antagonista es la concentracion del patogeno en el tratamiento con antagonista despues de “t” dlas de conservacion.
Valores positivos de la reduccion indican que el crecimiento del patogeno en la fruta ensayada en presencia del antagonista es menor que el mismo sin antagonista. A mayor valor, mayor efectividad frente al patogeno estudiado
En los ensayos a temperatura ambiente (20 °C), para obtener la suspension de la cepa CBS136973 y de las otras cepas ensayadas, se utilizo la produccion en medio NYDA incubado a 25 °C durante 48 h. Se tomaron colonias aisladas que se suspendieron en agua desionizada esteril y a partir de dicha suspension se preparo otra suspension que se ajusto, mediante un espectrofotometro, a distintos porcentajes de transmitancia (1=420 nm) que se corresponden con las distintas concentraciones de antagonistas ensayadas (105 ufc/ml, 106 ufc/ml, 107 ufc/ml y 108 ufc/ml).
En los ensayos en condiciones de refrigeracion (5 °C o 10 °C), para obtener la suspension de la cepa CBS136973, se utilizo la produccion en medio llquido. Para ello, se inoculo un matraz Erlenmeyer con 50 ml de TSB, que se incubo a 30°C durante 20-24 h. Se centrifugo durante 10 min a 10000 rpm y se redisolvio con 25 ml de agua desionizada esteril.
Los patogenos se inocularon en tubos conteniendo 10 ml de medio TSB (Salmonella choleraesuis BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711 y Escherichia coli O157:H7) o TYSEB (Listeria innocua CECT-910 y Listeria monocytogenes CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3), que se incubaron a 37 °C durante 2024 h. A continuacion se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min y el precipitado celular se redisolvio con 5 ml de solucion salina (0,85 g/l de NaCl). Mediante la medicion de la transmitancia a 420 nm y una curva previamente obtenida en el laboratorio para cada uno de los patogenos, se determino la concentracion estimada de patogeno.
Tabla 3. Listado de cepas de microorganismos patogenos de transmision alimentaria utilizados en los ensayos.
Coleccion
Especie Serovar Nomenclatura
ATCC BAA-707
Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Smith) Weldin Agona BAA-707
ATCC BAA-709
Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Smith) Weldin Michigan BAA-709
ATCC BAA-710
Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Smith) Weldin Montevideo BAA-710
ATCC BAA-711
Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Smith) Weldin Gaminara BAA-711
CECT-4031
Listeria monocytogenes (Murray et al. 19268) Pirie 1940 1a
CECT-4031
CECT-4032
Listeria monocytogenes (Murray et al. 19268) Pirie 1940 4b
CECT-4032
CECT-933
Listeria monocytogenes (Murray et al. 19268) Pirie 1940 3a
CECT-933
CECT-940
Listeria monocytogenes (Murray et al. 19268) Pirie 1940 4d
CECT-940
Listeria monocytogenes* 1/2a LM230/3
CECT-910
Listeria innocua L. innocua
NCTC-12900 / ATCC 700728
Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers serotype O157:H7 E. coli O157:H7
*: Aislada de lechuga fresca cortada en nuestro laboratorio (Abadias et al. 20085)
CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo; ATTC: American Type Culture Collection: NCTC: National Collection of Type Cultures.
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Las concentraciones de patogeno ensayadas oscilan entre 105 ufc/ml y 107 ufc/ml. Sin embargo, en condiciones reales se estima que la concentration de patogeno 105 ufc/ml, que en los ensayos realizados corresponde a 103 ufc/g de producto, es incluso una concentracion muy elevada de patogeno (Salleh et al., 20036; Nguz et al., 20057), por lo que los resultados obtenidos se presentan en condiciones desfavorables/adversas para la cepa CBS136973.
Ejemplo 1. Efectividad de la cepa CBS136973 frente a distintos patogenos de transmision alimentaria en manzana “Golden Delicious” a 20°C
Las figuras 1 a 3 muestran un ejemplo de resultados obtenidos frente a las cepas de Escherichia coli O157:H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 y Listeria innocua CECT-910, en manzana “Golden Delicious”, comparando la efectividad de la cepa CBS136973 con otras cepas aisladas en el laboratorio y que se ensayaron en las mismas condiciones.
La suspension que se inoculo tenia una concentracion de la cepa CBS136973 de aproximadamente 108 ufc/ml y 107 ufc/ml de microorganismo patogeno. El pH de las manzanas fue de 3,8±0,2 y la acidez entre 1,6 y 2,9 g acido malico/l.
Tal y como muestra la figura 1, la concentracion inicial de E. coli O157:H7 fue de 5,1 log10ufc/g y aumento en el tratamiento control (sin antagonista) hasta 6,8 log10ufc/g. En cambio, en los trozos co-inoculados con distintos
antagonistas, el crecimiento fue menor, observandose reducciones entre 1,0 y 1,6 unidades logarltmicas. En el caso de la cepa CBS136973, la poblacion de patogeno tras los dos dlas de conservation a 20 °C fue menor incluso que la inicial (2,4 log10 ufc/g), lo que nos indica una reduction efectiva de 4,5 unidades logarltmicas.
Resultados similares se obtuvieron cuando se ensayo la efectividad de distintas cepas frente a Salmonella BAA-709 (figura 2), con reducciones entre 0,3 y 1,0 unidades logarltmicas en el caso de los otros antagonistas y de 4,7 unidades logarltmicas en el caso de la cepa CBS136973.
El crecimiento de Listeria innocua en manzana no tratada con antagonista tras la conservacion a 20 °C durante 2 dlas fue mayor, de 2,5 log10 ufc/g. En el caso de algunos de los antagonistas aislados en el laboratorio la reduccion fue notable, entre 1,1 y 2,2 unidades logarltmicas, pero la cepa CBS136973 mostro unos resultados mucho mejores, con una reduccion de 5,9 unidades logarltmicas tras la conservacion, lo que indica que la poblacion de Listeria innocua en manzanas que hablan sido tratadas con la cepa CBS136973 fue menor de 2 log10 ufc/g (figura 3).
Ejemplo 2. Efectividad de la cepa CBS136973 frente a distintos patogenos de transmision alimentaria en distintas variedades de melocoton a 20°C
Las figuras 4 a 6 muestran un ejemplo de resultados obtenidos frente a las cepas de Escherichia coli O157:H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 y Listeria innocua CECT-910, en melocoton, comparando la efectividad de la cepa CBS136973 con otras cepas aisladas en el laboratorio y que se ensayaron en las mismas condiciones.
Se utilizaron melocotones de las variedades “Merry O'Henry”, “Tardibelle”, “Roig d'Albesa”, “Placido”, “Royal Glory” y “Elegant Lady”. La suspension que se inoculo tenia una concentracion de la cepa CBS136973 de aproximadamente 108 ufc/ml y 107 ufc/ml de microorganismo patogeno. El pH de los melocotones utilizados fue
de 3,6-5,3, con una acidez entre 2,8 y 7,8 g acido malico/l.
Tal y como muestra la figura 4, la concentracion inicial de E. coli O157:H7 en melocoton fue de 4,9 log10ufc/g, y aumento aproximadamente 3 unidades logarltmicas en los trozos no tratados con antagonista tras 2 dlas de conservacion a 20 °C. En los trozos inoculados con algunos de los antagonistas aislados, la concentracion de E. coli O157:H7 se redujo entre 1,8 y 3,0 unidades logarltmicas, mientras que con la cepa CBS136973, la reduccion fue de 4,3 unidades logarltmicas, siendo la concentracion a los 2 dlas incluso inferior a la inicial, lo que demuestra su gran efectividad.
En la figura 5 se muestran los resultados del mismo ensayo, pero realizado con la cepa de Salmonella BAA- 709. En este caso, el incremento en la poblacion tras dos dlas de conservacion a 20 °C fue menor que el de E. coli O157:H7, con aproximadamente 2,5 log de incremento. En general, las reducciones con los otros antagonistas fueron menores, entre 0,4 y 1,8 logaritmos, pero la reduccion de Salmonella BAA-709 en aquellos trozos de manzana tratados con la cepa CBS136973 fue la mayor con 2,8 unidades logarltmicas.
La figura 6 muestra los datos referentes a Listeria innocua en melocoton. En esta figura 6 se observa que la poblacion de Listeria innocua en el tratamiento control (sin antagonista) tambien aumento aproximadamente 3 unidades logarltmicas en cada trozo de melocoton, mientras que en aquellos trozos inoculados con distintos antagonistas aislados en el laboratorio, la poblacion fue menor, observandose reducciones entre 0,7 y 2,1 unidades logarltmicas. De nuevo, la reduccion obtenida con la cepa CBS136973 fue superior, de 4 unidades logarltmicas, logrando tambien que la poblacion final fuera incluso inferior a la inicial.
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Ejemplo 3. Efectividad de la cepa CBS136973 frente a distintos patogenos de transmision alimentaria en melon a 20 °C
Las figuras 7 y 8 muestran un ejemplo de resultados obtenidos frente a las cepas de Salmonella choleraesuis BAA-709 y Listeria monocytogenes LM230/3, en melon, comparando la efectividad de la cepa CBS136973 con otras cepas aisladas en el laboratorio y que se ensayaron en las mismas condiciones.
El melon es una fruta con pH mas neutro y menos acidez que la manzana y el melocoton (pH 5,7-6,5, acidez 0,7-1,9 g acido cltrico/l, generalmente). En este caso, la problematica de los patogenos es mas importante porque el pH no ejerce de barrera al crecimiento de los patogenos de transmision alimentaria. La suspension que se inoculo tenia una concentration de la cepa CBS136973 de aproximadamente 108 ufc/ml y 107 ufc/ml de
microorganismo patogeno.
La figura 7 muestra los resultados de distintas cepas de microorganismos antagonistas, incluida la CBS136973 frente a Salmonella en trozos de melon “Piel de sapo”. En este caso, los valores de reduction oscilaron entre 1,5 y 3,2 unidades logaritmicas, siendo la reduccion mayor la obtenida con la cepa CBS136973, con un total de 3,5 unidades logaritmicas. Puede observarse que el crecimiento de Salmonella en melon en el tratamiento control (sin antagonista) tras 2 dlas de conservation a 20 °C fue muy elevado, de 4,2 unidades logaritmicas, superandose la poblacion en mas de 108 ufc/g de producto.
La figura 8 muestra la efectividad de la cepa CBS136973 frente a la cepa de Listeria monocytogenes LM230/3, en melon conservado 2 dlas a 20 °C. Tal y como puede observarse, en este caso, tambien hay una reduccion del patogeno respecto al control no tratado.
Ejemplo 4. Efectividad de la cepa CBS136973 frente a Escherichia coli O157:H7 en manzana “Golden Delicious” en condiciones de refrigeration
La figura 9 muestra el resultado de la efectividad de la cepa CBS136973 frente a E. coli O157:H7 en manzana “Golden Delicious” conservada a 5 °C. El ensayo se realizo mediante co-inoculacion de 15 ml de una
suspension que contenla ambas cepas, E. coli O157:H7 a 107 ufc/ml y CBS136973 (30 % transmitancia,
aproximadamente 108 ufc/ml).
Tal y como puede verse en la figura, a 5 °C no se observo crecimiento de E. coli O157:H7 en manzana cortada en el tratamiento control, en cambio, en las muestras co-inoculadas con el antagonista, se vio una reduccion a
partir del segundo dla de conservacion y, a partir de los 7 dlas, la poblacion se redujo por debajo de 10 ufc/g.
Ejemplo 5. Efectividad de la cepa CBS136973 frente a distintos patogenos de transmision alimentaria en melocoton en condiciones de refrigeracion
Las figura 10 y 11 muestran la efectividad de la cepa CBS136973 en melocoton (variedades “Elegant Lady” y “Placido”), a 5 y 10 °C, frente a Escherichia coli O157:H7 y Salmonella BAA-709. La suspension que se inoculo tenia una concentracion de la cepa CBS136973 de aproximadamente 108 ufc/ml y 107 ufc/ml de microorganismo patogeno.
Tal y como muestra la figura 10, la cepa CBS136973 reduce la concentracion de patogeno, siendo esta reduccion mayor a 5 °C que a 10 °C y manteniendose incluso por debajo del limite de detection tras 6 dias de conservacion.
Resultados similares se obtuvieron cuando la cepa CBS136973 se utilizo frente a Salmonella en melocoton de la variedad “Placido” (figura 11). En este caso, tras 6 dias de conservacion a 5 °C, no se detecto Salmonella en los trozos de melocoton cortado, mientras que la poblacion se mantuvo en el tratamiento sin antagonista (control).
Ejemplo 6. Efectividad de la cepa CBS136973 frente a Salmonella choleraesuis BAA-709, en melon en condiciones de refrigeracion
La figura 12 muestra la efectividad de la cepa CBS136973 en melon conservado a 10 °C frente a Salmonella BAA-709. La suspension que se inoculo tenia una concentracion de la cepa CBS136973 de aproximadamente 108 ufc/ml y 107 ufc/ml de microorganismo patogeno.
Tal y como muestra la figura, a 10 °C el patogeno crecio en el tratamiento control (sin antagonista), mientras que el tratamiento en el que se aplico CBS136973 la poblacion se mantuvo mas baja, con una reduccion de mas de 1,5 unidades logaritmicas a partir del sexto dla de conservacion. A 5 °C, en las condiciones ensayadas, Salmonella no fue capaz de crecer y la adicion de la cepa CBS136973 no represento ningun cambio respecto el tratamiento control.
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Ejemplo 7. Efectividad de la cepa CBS136973 aplicada a distintas dosis frente a distintos patoqenos de transmision alimentaria en manzana Golden Delicious a 20°C
Las tablas 4, 5 y 6 muestran la efectividad de la cepa CBS136973 aplicada a distintas dosis, y frente a distintas concentraciones de patoqenos Escherichia coli O157:H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 y Listeria innocua CECT-910. Esta efectividad se midio en unidades loqarltmicas decimales de reduction de crecimiento sequn la formula citada mas arriba.
Tal y como puede observarse en las tablas adjuntas, los resultados muestran reduccion del crecimiento de patoqenos para concentraciones de la cepa CBS136973 iquales o superiores a la concentration inoculada de patoqeno.
Tabla 4. Valores de reduccion (unidades loqarltmicas decimales) de Escherichia coli O157:H7 aplicada a distintas concentraciones, en funcion de la dosis de la cepa CBS136973, en manzana “Golden Delicious” conservada a 20°C durante 2 dlas.
Concentracion de Escherichia coli O157:H7 inoculada (ufc/ml)
Dosis cepa CBS 136973 (ufc/ml)
105 106 107
108
4,7 6,1 3,6
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3,8 3,4 2,0
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1,5 1,7 0,6
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0,7 1,6 0,3
Tabla 5. Valores de reduccion (unidades loqarltmicas decimales) de Salmonella choleraesuis BAA-709 aplicada a distintas concentraciones, en funcion de la dosis de la cepa CBS136973, en manzana “Golden Delicious” conservada a 20°C durante 2 dlas.
Concentracion de Salmonella choleraesuis BAA-709 inoculada (ufc/ml)
Dosis cepa CBS136973 (ufc/ml)
105 106 107
108
5,4 3,8 4,5
107
5,0 3,3 3,3
106
3,2 1,9 1,3
105
1,9 1,5 0,3
Tabla 6. Valores de reduccion (unidades loqarltmicas decimales) de Listeria innocua aplicada a distintas concentraciones, en funcion de la dosis de la cepa CBS136973, en manzana 'Golden Delicious' conservada a 20°C durante 2 dlas.
Concentracion de Listeria innocua inoculada (ufc/ml)
Dosis CBS136973 (ufc/ml)
105 106 107
108
5,0 4,5 3,5
107
4,2 3,9 2,2
106
3,1 2,1 1,1
105
2,2 1,3 0,8
En el caso de Salmonella y Listeria innocua, inoculadas en manzana, la relation 1:1 (patoqeno:antaqonista) es suficiente para observar reducciones superiores a 1,9 unidades loqarltmicas.
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De las dosis ensayadas, la 108 ufc/ml es la que presenta los resultados mas buenos para los tres patogenos (reducciones superiores a 3,5 unidades logaritmicas). No obstante, la dosis 107 ufc/ml de la cepa CBS136973 es la que se considera mas adecuada para la aplicacion comercial, ya que garantiza un minimo de dos unidades logaritmicas de reduction para los tres patogenos estudiados, independientemente de la concentration de bacterias patogenas de la fruta.
Ejemplo 8. Efectividad de la cepa CBS136973 aplicada a distintas dosis frente a distintos patogenos de transmision alimentaria en melon a 20°C y 10°C
En este ejemplo, se utilizo un coctel de cepas de Salmonella choleraesuis (BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) o de Listeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3).
Las tablas 7 y 8 muestran la efectividad en melon conservado a 20 °C de la cepa CBS136973, aplicada a distintas dosis, y frente a distintas concentraciones de coctel de patogenos de los generos Salmonella y Listeria monocytogenes. Esta efectividad se midio en unidades logaritmicas decimales de reduccion de crecimiento segun la formula citada mas arriba.
Tabla 7. Valores de reduccion (unidades logaritmicas decimales) de Salmonella choleraesuis aplicada a distintas concentraciones, en funcion de la dosis de la cepa CBS136973, en melon “Piel de sapo” conservado a 20 °C durante 2 dias.
Concentracion de Salmonella choleraesuis inoculada (ufc/ml)
Dosis CBS136973 (ufc/ml)
105 107
108
7,3 2,1
107
3,7 0,9
106
0,2 0,4
Tabla 8. Valores de reduccion (unidades logaritmicas decimales) de Listeria monocytogenes aplicada a distintas concentraciones, en funcion de la dosis de la cepa CBS136973, en melon “Piel de sapo” conservado a 20 °C durante 2 dias.
Concentracion de Listeria monocytogenes inoculada (ufc/ml)
Dosis CBS136973 (ufc/ml)
105 107
108
5,3 4,9
107
4,2 2,8
106
2,1 1,0
Tal y como puede verse en las tablas, en melon, la dosis 107 ufc/ml de la cepa CBS136973 muestra valores de reduccion de crecimiento iguales o superiores a 3,7 unidades logaritmicas de Salmonella y Listeria monocytogenes aplicadas a 105 ufc/ml de melon que equivale aproximadamente a 103 ufc/g melon.
Las figuras 13 y 14 muestran la efectividad a distintas concentraciones de la cepa CBS136973, en melon conservado a 10 °C, frente a los mencionados cocteles de Salmonella choleraesuis y Listeria monocytogenes aplicados a una concentracion de 105 ufc/ml.
Tal y como muestran las figuras, la reduccion de Listeria monocytogenes y Salmonella es mayor a mayor concentracion de la cepa CBS136973.
Ensayo para demostrar la efectividad de la cepa antagonista CBS136973 frente a los principales patogenos de transmision alimentaria en fruta cortada en condiciones que simulan la production comercial.
A continuation se describe un ejemplo de un ensayo en manzana “Golden Delicious” en condiciones que simulan la produccion comercial.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En este ejemplo se utilizo un coctel de cepas de Salmonella choleraesuis (BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA- 711) y un coctel de cepas de Listeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, cEcT-933, CECT-940 y LM230/3).
Las manzanas enteras se desinfectaron, se descorazonaron y se cortaron en diez gajos. A continuacion se sumergieron en un bano que contenla el antioxidante NatureSeal® AS1 (6%, Agricoat Ltd., Great Shefford, UK), durante 2 min y en agitacion, y se dejaron secar.
Una vez tratados con antioxidante, los trozos de manzana se sumergieron en una suspension que contenla el coctel de cepas del patogeno y el antagonista, durante 1 min y en agitacion, simulando la aplicacion que tendrla lugar en un tanque de la llnea de tratamiento de fruta. En el tratamiento control, los trozos de manzana se sumergieron en una suspension que contenla el coctel de cepas del patogeno sin la cepa antagonista.
A continuacion, los trozos de manzana se dejaron escurrir y se envasaron (200 g) en barquetas de polipropileno de 500 ml de capacidad y se sellaron con un film de polipropileno del tipo habitualmente empleado de 35 pm de grosor y una permeabilidad al O2 y CO2 de 3500 cm3 */m2*dla*atm a 23°C, y al vapor de agua de 0,9 g/m2*dla a 25°C y 75% de humedad relativa. Debido a la respiracion del fruto y las caracterlsticas de permeabilidad al O2 y al CO2 del film, se crea en el interior del envase una atmosfera modificada pasiva (MAP). La cepa antagonista CBS136973 puede verse afectada por esta atmosfera, por lo que su efectividad ha de demostrarse tambien en estas condiciones de atmosfera modificada.
Los trozos de manzanas se conservaron a 5 °C y a 10 °C durante 15 dlas (vida util estimada para este tipo de productos). Periodicamente se realizaron recuentos microbiologicos y se hizo una determinacion de distintos parametros de calidad (color, textura, pH, acidez, contenido en solidos solubles y calidad visual).
Para obtener la suspension de la cepa CBS136973, se utilizo la produccion en medio llquido TSB y se ajusto el porcentaje de transmitancia (1=420 nm) para una concentracion de la cepa de 107 ufc/ml.
Los patogenos se inocularon en tubos conteniendo 10 ml de medio TSB (Salmonella choleraesuis BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) o TYSEB (Listeria monocytogenes CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3), que se incubaron a 37 °C durante 20-24 h. A continuacion se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min y el precipitado celular se redisolvio con 5 ml de solucion salina (0,85 g/l de NaCl). Mediante la medicion de la transmitancia a 420 nm y una curva previamente obtenida en el laboratorio para cada uno de los patogenos, se determino la concentracion estimada de patogeno, que en el ensayo que se describe fue una suspension con una concentracion de 105 ufc/ml.
Ejemplo 9. Efectividad de la cepa CBS136973 en condiciones que simulan las comerciales frente a distintos patogenos de transmision alimentaria en manzana “Golden Delicious” cortada y envasada a diferentes temperaturas
Las figuras 15 y 16 muestran los resultados obtenidos frente a los mencionados cocteles de cepas de Salmonella y Listeria monocytogenes, en manzana “Golden Delicious” a 5 °C y 10 °C.
La suspension que se inoculo mediante inmersion de los trozos de manzana contenla una concentracion de la cepa CBS136973 de 107 ufc/ml y una concentracion de 105 ufc/ml de ambos microorganismos patogenos.
Tal y como puede observarse en las figuras, la cepa CBS136973 ha resultado efectiva frente a Salmonella, especialmente a 10 °C, donde se observo crecimiento. En el caso de Listeria monocytogenes, se observo reduccion del crecimiento tanto a 5 °C como a 10 °C.
Por lo tanto, puede concluirse que la cepa CBS136973 es efectiva frente a distintos patogenos de transmision alimentaria en condiciones que simulan las comerciales (refrigeracion y atmosfera modificada pasiva MAP).
Ademas, es importante destacar que la aplicacion de la cepa CBS136973 no afecto al color, ni a la textura, ni a los solidos solubles, ni a la acidez de las manzanas.
A pesar de que se ha descrito y representado ejemplos concretos de la presente invencion, es evidente que el experto en la materia podra introducir variantes y modificaciones, o substituir los detalles por otros tecnicamente equivalentes, sin apartarse del ambito de proteccion definido por las reivindicaciones adjuntas.
Referencias:
(1) Behrendt, U., Ulrich, A., Schumann, P., Erler, W., Burghardt, J., Seyfarth, W. 1999. A taxonomic study of bacteria isolated from grasses: a proposed new species Pseudomonas graminis sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 49: 297-308.
(2) Noval, C. 1991. Comprobacion del poder patogeno. En: Manual de laboratorio. Diagnostico de hongos, bacterias y nematodos fitopatogenos. Ed. MAPA, pp.137-148.
(3) Peix, A.; Rivas, R., Mateos, P.F., Martinez-Molina, E., Rodriguez-Barrueco, C.,Velazquez, E. 2003. Pseudomonas
rhizosphaerae sp. nov., a novel species that actively solubilizes phosphate in vitro. International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology, 53: 2067-2072.
(4) Peix, A., Rivas, R., Santa-Regina, I., Mateos, P.F., Martinez-Molina, E., Rodriguez-Barrueco, C., Velazquez, E. 2004. Pseudomonas lutea sp. nov., a novel phosphate-solubilizing bacterium isolated from the rhizosphere of grasses. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 847-850.
5
(5) Abadias, M., Usall, J., Anguera, M., Solsona, C., Vinas, I. 2008. Microbiological quality of fresh, minimally-processed fruit and vegetables, and sprouts from retail establishments. International Journal of Food Microbiology, 123: l2l-129.
(6) Salleh, N.A.; Rusul, G., Hassan, Z., Reezal, A., Isa, S.H. Nishibuchi, M.; Radu, S. 2003. Incidence of Salmonella spp. 10 in raw vegetables in Salangor, Malaysia. Food Control 14: 475-479.
(7) Nguz, K., Shindano, J., Samapundo, S., Huyghebaert, A. 2005. Microbiological evaluation of fresh-cut organic vegetables produced in Zambia. Food Control 16: 623-628.
15 (8) Murray, E.G.D., Webb, R.E., Swann, M.B.R. 1926. A disease of rabbits characterized by a large mononuclear leucocytosis, caused by a hitherto undescribed bacillus Bacterium monocytogenes (n. sp.). J. Pathol. Bacteriol. 29: 407439.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Cultivo biologico sustancialmente puro de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el numero CBS136973 en la institucion de deposito “Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.
  2. 2. Uso del cultivo CBS136973 de la reivindicacion 1 como antagonista para el control biologico de bacterias patogenas de transmision alimentaria en fruta para consumo humano.
  3. 3. Uso segun la reivindicacion 2, en la que dicha fruta es fruta cortada a trozos o fruta de cuarta gama.
  4. 4. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que dichas bacterias patogenas son seleccionadas de un grupo que consiste en microorganismos Salmonella spp., microorganismos Listeria spp. y microorganismos Escherichia coli O157:H7 o una combinacion de los mismos.
  5. 5. Uso segun la reivindicacion 4, en el que la Salmonella spp. es de la especie Salmonella choleraesuis.
  6. 6. Uso segun la reivindicacion 4, en el que la Listeria spp. es de cualquiera de las especies Listeria monocytogenes o Listeria innocua.
  7. 7. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que dicho control biologico se lleva a cabo manteniendo la fruta a una temperatura superior a 10 °C, preferiblemente, a una temperatura igual o superior a 20°C.
  8. 8. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que dicho control biologico se lleva a cabo manteniendo la fruta a una temperatura igual o inferior a 10°C.
  9. 9. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dicho control biologico se lleva a cabo manteniendo la fruta en una atmosfera modificada con una composicion de gas diferente de la del aire.
  10. 10. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que dicha fruta es fruta con un pH comprendido entre 3 y 7.
  11. 11. Uso segun la reivindicacion 10, en el que dicha fruta es seleccionada de un grupo que consiste en manzana, melocoton y melon.
  12. 12. Metodo para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparacion que comprende un cultivo de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el numero CBS136973 en la institucion de deposito “Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.
  13. 13. Metodo segun la reivindicacion 12, que comprende la etapa de cortar la fruta a trozos antes de aplicar dicha preparacion.
  14. 14. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en el que la concentracion de la cepa CBS136973 en dicha preparacion es igual o superior a la concentracion estimada de patogeno que puede contener la fruta.
  15. 15. Metodo segun la reivindicacion 14, en el que la concentracion de la cepa CBS136973 en dicha preparacion es igual o superior a 105 ufc/ml, preferiblemente, igual o superior a107 ufc/ml.
    2 Old
    o —* ro co m or —loo
    o o o o o o o o o
    Control CPA-1 CPA-2 PN5 PN6 CPA-5 M174BAL2 EL8 128-M C9 P21
    imagen1
    CBS 136973
    FIG. 1
    Concent ration initial
    Cantrgl CPA-1 CPA-2 PN5 PNS CPA-5 M174BAL2 ELS 128-M C9 P21
    imagen2
    CBS- 136973
    Concent racion inicial
    Control
    CPA-5
    EL8
    "n
    RG4
    O ■
    CPA-2
    PN6
    CPA-3
    F-10
    CBS 136973
    C9 P21
    imagen3
    FIG. 3
    o->-K)co^aicn^ioo o o o o o o o o o
    Control
    CPA-1
    CPA-2
    PN5
    PN6
    CPA-5
    M174BAL2
    EL8
    128-M
    C9 P21
    CBS 136973
    imagen4
    FIG. 6
    Listeria innocua, logio ufc/g melocoton
    o^roco-t^cncD^JOoco o o o o o o o o o o
    Control CPA-5 EL8 RG4 CPA-2 PN6 CPA-3 F-10 CB! 136973 C9 P21
    imagen5
    FIG. 5
    Control CPA-5 EL8 RG4 CPA-2 PN6 CPA-3 F-10 CBS- 136973 C9 P21
    O-’-l'JCO-NOlCn^lOOCO O O O O O O O O O O
    imagen6
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    o o o o o o
    Concentracion
    inicial
    Control
    M247 PS 11
    M290 PSI4
    "n
    M201 PS I 3
    P
    128-G
    00
    F-10
    CB£ 136973
    M172 PSI1
    C-9 P -21
    128-M
    imagen7
    FIG. 7
    imagen8
    -§
    Escherichia coli 0157:H7, log10 ufc/g melocoton
    imagen9
    Dias de conservacion
    Escherichia coli 0157:H7, logio ufc /g manzana
    o hj co on
    o o o o o o
    imagen10
    imagen11
    Dias de conservation
    O h-* NJ UJ Ln
    O O O O O O
    imagen12
    Ol-iNJUJ-piUlCn''>JOOlI5
    o o o o o o o o o o
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    o
    Dias de conservation
    imagen14
    o o o o o o o o o o
    imagen15
    Listeria monocytogenes, log10 ufc/g manzana
    imagen16
    FIG. 15
    imagen17
    FIG. 16
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