WO2022112631A1 - Pseudomonas palmensis bbb001 estimulante del metabolismo adaptativo de plantas frente a estrés abiótico y mejoradora de la nutrición mineral - Google Patents
Pseudomonas palmensis bbb001 estimulante del metabolismo adaptativo de plantas frente a estrés abiótico y mejoradora de la nutrición mineral Download PDFInfo
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Classifications
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- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
Definitions
- Pseudomonas palmensis BBB001 stimulator of the adaptive metabolism of plants against abiotic stress and improves mineral nutrition.
- the present invention relates to the bacterial strain Pseudomonas palmensis (BBB001 internal code of the laboratory), as a new species of the genus Pseudomonas, for use in the treatment of plants in order to improve adaptation to abiotic stress, reducing oxidative stress of in a way that increases growth and production.
- it is capable of producing siderophores, improving the iron nutrition of plants, reversing the symptoms of iron deficiency, and stimulating the mobilization of other nutrients such as phosphorus and potassium, which is why it is also of interest as a biofertilizer for organic farming. and conventional.
- the invention falls within the field of agri-food biotechnology, specifically within plant growth regulating bacteria, since the aforementioned bacterial strain can serve as the basis for the preparation of different types of products that stimulate the adaptive metabolism of plants. These products will improve the adaptation of plants to different abiotic stress conditions such as water deficit or excess soil salinity.
- the invention can be classified as one of the bacterial species of the genus Pseudomonas. STATE OF THE TECHNIQUE.-
- the action mechanisms of plant growth promoting bacteria can be summarized into two types: direct, when the bacteria or their metabolites alter the metabolism of the plant (hormonal activity, stimulation of adaptive mechanisms), and indirect, when they synthesize compounds that they facilitate the uptake or mobilization of nutrients or prevent the growth of pathogenic microorganisms on the plant, without altering its metabolism.
- direct when the bacteria or their metabolites alter the metabolism of the plant
- indirect when they synthesize compounds that they facilitate the uptake or mobilization of nutrients or prevent the growth of pathogenic microorganisms on the plant, without altering its metabolism.
- the plant has a secondary metabolism, highly inducible, related to the adaptation of the plant to adverse situations that it has to face during its life.
- the genus Pseudomonas is common among soil bacteria. Following the taxonomy of Bergey's Manual, March 2001 edition, this bacterium falls within the Domain Bacteria, Phylum Proteobacteria, Class gamma proteobacteria, Order Pseudomonadales, Family Pseudomonaceae.
- the genus Pseudomonas is very common in the edaphic system, and has been repeatedly described as a protective bacterium against different plant diseases. Some bacteria of this group produce yellow-green fluorescent pigments that are easily soluble in water. Among other functions, these pigments act as siderophores (molecules capable of capturing iron from the medium for the metabolism of the microorganism).
- compositions and formulations containing strains of the Pseudomonas genus alone or in combination with other organisms to stimulate and improve plant growth, or that serve as the basis for the formulation of phytosanitary products, protectors against pathogens or for preserve the good growth of the crops, some of which have been patented, case of the European patents with publication numbers in Spain ES2707807-T3, 2019-04-05, New fluorescent Pseudomonas of the species Pseudomonas azotoformans for the stimulation of the emergence and growth of plants, and ES2624788-T3, 2017-07-17, Biological culture of a strain of the species Pseudomonas graminis and use of said culture as an antagonist for the biological control of pathogenic bacteria; or the national patent ES2572746-B1, 2016-09-21, for a procedure for obtaining a plant growth promoting composition comprising Pseudomonas putida and its uses.
- the new technologies have made it possible to determine a new species, Pseudomonas palmensis BBB001, based on its unique genetic characteristics, which differentiate it from other strains of Pseudomonas when the BBB001 genome is compared with the 254 genomes complete and available Pseudomonas.
- the parameters that allow a new species to be identified are one of the following: i) average nucleotide identity (ANI) and average amino acid identity (AAI), the limit values for defining a new species being less than 95%; ii) digital DNA-DNA hybridization (dDDH), with values below 70%; iii) Guanine-cytosine content (G+C), values above 1%; iv) correlation index of the frequencies of use of tetranucleotides (TETRA), with values below 0.99; v) multilocus sequence analysis (MLSA), with values below 97%.
- ANI average nucleotide identity
- AAI average amino acid identity
- Pseudomonas alkylphenolica is the closest species according to the ANI and AAI values were 83.39% and 85.11%, respectively, both below 95%, the DNA-DNA digital hybridization values (dDDH) 27.10%, below 70% and the content of guanine-cytosine (G+C) 3.43%, above 1%.
- the Pseudomonas palmensis strain is characterized by its beneficial effects on plants: it induces the metabolism involved in the elimination of free radicals produced in stress situations, improving the adaptation of the plant to these conditions through a mechanism of homeostasis of redox metabolism and an increase of the hydric potential under these conditions, a clear indicator of the capacity of this strain to induce a hydric balance, resulting in a greater capacity of the plant to resist hydric stress conditions. On the other hand, it is capable of improving the iron nutrition of plants, also improving their growth.
- the object of the invention described here and that, in view of the prior art, is understood to meet the conditions of novelty and inventive activity necessary to be worthy of the patent right, is the isolation and characterization of the bacterial strain Pseudomonas palmensis BBB001 (CECT 30222), which is a microorganism of the group of Gram - bacteria, genus Pseudomonas, with the ability to stimulate the adaptation metabolism to abiotic stress of plants, reducing oxidative stress by inducing the metabolism involved in the elimination of free radicals produced in stress situations, improving the adaptation of the plant to these conditions through the homeostasis of redox metabolism, in such a way that growth and production are stimulated, in addition to having application for the mobilization of nutrients, especially for iron nutrition.
- CECT 30222 a microorganism of the group of Gram - bacteria, genus Pseudomonas
- Pseudomonas BBB001 of which 41 genes were associated with a specific subsystem.
- 41 unique genes of Pseudomonas BBB001 those related to the uptake and metabolism of iron, and those related to the synthesis of amino acids and derivatives stand out, due to their abundance.
- These 41 genes corresponding to SEQ ID NO: 1 to 41 of the sequence list have the capacity to encode formulations for the production of substances or compounds on an industrial scale, and can be used for heterologous expression in obtaining products that contain raw materials. strain biology.
- BIOLOG Eco profile indicates that it is capable of degrading malic tricarboxylic acids, hydroxybutyric acid and glucosamine acid, and the degradation of glucose 1 P, cellobiose, lactose and N-acetylglucosamine stand out among the sugars.
- nitrogen sources it uses putrescine, phenylethylamine, serine and glycol-L-glutamic acid.
- ROS free oxygen radicals
- Another experiment has been carried out to demonstrate the ability to stimulate adaptive metabolism to salinity stress conditions in tomato plants.
- the strain induces a substantial improvement in water potential with respect to the control, slightly increasing the proline content, a compatible osmolyte.
- the increase in water potential under these conditions is a clear indicator of the ability of this strain to induce a water balance, generating as a result a greater capacity of the plant to resist salinity or water stress conditions.
- an experiment has been carried out with BBB001 to evaluate the ability to increase production under normal irrigation conditions and with a 25% reduction in irrigation.
- the purpose pursued with this invention and which constitutes the technical advantage provided by it, is to have a bacterium (biostimulant/biofertilizer) that improves the ability to stimulate the metabolism of adaptation to abiotic stress in plants, decreasing oxidative stress, in such a way that growth and production are stimulated.
- a biofertilizer because it stimulates the mobilization of nutrients, specifically the nutrition of iron, phosphorus and potassium, bringing said bacteria or any of its parts into contact with the plant by any available means, improving the effect with certain bacterial species.
- Pseudomonas palmensis BBB001 may be as part of any preparation with the strain, either individually or in combination with other bacterial species or organisms, and by any available means that puts the bacteria in contact with the seed, the root or aerial system. of the plants.
- Pseudomonas palmensis BBB001 is particularly suitable in combination with Pseudomonas fluorescens CECT 9015, or as part of any preparation with this other strain, to improve the response to salt stress; and also in combination with Arthrobacter oxydans CECT Code 30231, to improve mineral nutrition in iron, nitrogen, phosphorus and potassium, both in organic and conventional agriculture.
- the strain of the genus Pseudomonas reported here was isolated by studying the rhizosphere of natural populations of Nicotiana glauca in a transect on the island of Las Palmas de Gran Canaria (Canary Islands). This plant species (Nicotiana glauca) was selected because it belongs to the Solanaceae family, because it has an active secondary metabolism and because it is a good source of microorganisms with biological activity of interest in agriculture.
- the rhizosphere samples for the isolation of the bacterial strain were carried out in natural populations of Nicotiana glauca in December 2017. As a result of said sampling, 450 strains were collected, among which Pseudomonas palmensis (BBB001, internal code of the laboratory) was found. The isolation of said strain was carried out in nutritive agar (PCA).
- PCA nutritive agar
- this microorganism is maintained with a high survival rate in 20% glycerol in nutrient broth (Pronadisa) at -80°C or in 15% glycerol in water at - 20°C and are easily recovered in the culture medium used for isolation, both in solid phase and in liquid phase at 28°C.
- Table 1 specifies the morphology of the colonies at 24 h of incubation at 28° in agar for standard methods (PCA).
- the metabolic profile (BIOLOG Eco, www.biolog.com/products-portfolio-overview/microbial- community-analysis-with-ecoplates/) indicates that it is capable of degrading the acids: melic tricarboxylic, hydroxybutyric and glucosamine acid, and the degradation glucose 1 P, cellobiose, lactose and N-acetylglucosamine stand out among the sugars.
- nitrogen sources it uses putrescine, phenylethylamine, serine and glycol-L-glutamic acid.
- ANI average nucleotide identity
- AI average amino acid identity
- dDDH digital DNA-DNA hybridisation
- G +C difference in guanine-cytosine content
- TETRA frequency of use of tetranucleotides
- ANI and AAI values represent a robust measure of the evolutionary distance between two genomes; when these values are less than 95%, it is assumed that it is a new species. It has been empirically proven that ANI and AAI values of 95-96% are equivalent to a DDH (DNA-DNA hybridization) value of 70%, another parameter commonly used to delimit prokaryotic species (e.g., Konstantinidis and Tiedje 2005, PNAS 102:2567- 2572; Richter and Rosselló-Mora 2009, PNAS 106:19126-19131; Kim et al.2014, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64:346-351).
- DDH DNA-DNA hybridization
- dDDH index has shown a higher correlation with traditional DDH values (Auch et al. 2010, Standards in Genomic Sciences 2:1). For this reason, it is considered that dDDH values greater than 70% are indicative that the compared genomes belong to the same species.
- TETRA values between the Pseudomonas BBB001 genome and the 26 most closely related genomes will predictably show similar tetranucleotide usage frequencies, with correlation indices (TETRA) equal to or greater than 0.99, therefore, TETRA values less than 0.99 are indicators of a new species (Teeling et al. 2004, Environmental Microbiology 6:938947; Richter and Rosselló-Mora 2009, PNAS 106:19126-19131).
- the sequencing of the 16S ribosomal gene (16S rRNA) is the basic tool in current systems for classifying bacterial species. It is generally accepted that two different species will have similarity values for the 16S rRNA gene of less than 98.65-99% (Kim et al. 2014, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64:346-351). However, in many cases, the 16S rRNA gene may offer limited resolving power. On the one hand, this gene may have a low ability to discriminate between closely related species. On the other hand, some species may display very similar 16S rRNA sequences ( ⁇ 99%), despite being clearly different based on DDH values (Ash et al.
- Mulet et al. have recommended the analysis of three additional genes (gyrB, rpoB and rpoD) to delimit species, identify new strains, or resolve the phylogenetic relationships within this group (Mulet et al. 2012a, Systematic and Applied Microbiology 35:455-464; Mulet et al. 2012b, Systematic and Applied Microbiology 35:145-149; Sánchez et al.
- Mulet et al established a mean similarity of 97% as the criterion for species delimitation based on the MLSA of these four genes within the genus Pseudomonas (Mulet et al. 2010, Environmental Microbiology 12:1513-1530).
- the first stage of this analysis consists of the comparison at the nucleotide and amino acid level of the Pseudomonas BBB001 genome with respect to all the complete genomes available in the RefSeq database (NCBI Reference Sequence database) for the Pseudomonas genus.
- ANI Nucleotide identity index
- TETRA tetranucleotides
- JSpecies software (Richter and Rosselló-Mora 2009, PNAS 106:19126-19131) was used to calculate differences in tetranucleotide usage profiles between the Pseudomonas BBB001 genome and the 26 most closely related genomes.
- gyrB, rpoD and rpoB The gyrB, rpoD and rpoB genes were extracted from the whole genomes in question by mapping against reference using BWA 0.7.12 (Li and Durbin 2010, Bioinformatics 26:589-595).
- BPGA software (Chaudhari et al. 2016, Scientific Reports 6:24373) was used to perform homology clustering of annotated genes in the 253 complete Pseudomonas genomes and in Pseudomonas BBB001.
- the grouping threshold was 50% homology, thus grouping homologous genes and also genes that may belong to the same family.
- BPGA identifies the families of genes shared by all the genomes analyzed (core genome), the accessory genes and, in addition, the unique functions, that is, genes that have not been grouped in any of the clusters created.
- RAxML v8.2.9 software (Stamatakis 2014, Bioinformatics 30:1312-1313) was used to generate the maximum likelihood phylogenetic tree of all concatenated SNPs. The support of each node was calculated by running 1000 bootstrap replicates.
- the gene presence/absence matrix produced by BPGA was used to reconstruct a maximum likelihood phylogenetic tree using IQTREE (Chernomor et al. 2016, Systematic Biology 65:997-1008). The support of each node was calculated by running 1000 bootstrap replicates.
- nr non-redundant protein database available in the NCBI/EMBL/DDBJ database collection was created to perform a search for these using the BLAST+ 2.6.0 program (Camacho et al. 2008, BMC Bioinformatics 10:421).
- Table 2 shows the results of the estimates of the degree of similarity between genomes. For each genome, its length (in base pairs, bp), the number of annotated genes, and the values of ANI, AAI, dDDH, intergenomic distance, difference in G+C content and TETRA index estimated in the genome are specified. comparison with the genome of
- Table 3 shows the percentage similarity for each of the four genes included in the MLSA and mean similarity calculated for all four genes together.
- P. fluorescens which includes other species such as P. mandelii, P. koreensisis, P. brassicacearum, P. protegens or P. fragi. (57 genomes)
- the P. putida group encompasses a total of 43 of the 254 complete genomes analyzed and available in databases. In addition to all the genomes belonging to P. putida, other species such as P. monteilii or P. parafulva are found in this group.
- Pseudomonas BBB001 forms a statistically well-supported subgroup with the species P. alkylphenolica and Pseudomonas sp. NZ CP024478.1 (strain HLS-6). Within this subgroup it is not possible to make a direct comparison with the MLSA results, since the species P. japonica and P.
- vranovensis do not have published complete genomes and, therefore, are not included in the core genome analysis.
- the SNP phylogeny did not allow to resolve the phylogenetic position of Pseudomonas BBB001 with respect to the other species, the SNP phylogeny provided greater resolution, recovering Pseudomonas BBB001 as the basal lineage of this subgroup (i.e., Pseudomonas BBB001 was the first to be separated from P. alkylphenoiica and Pseudomonas sp. strain HLS-6).
- the phylogeny obtained from the information on the presence/absence of genes in the pan-genome was similar to that obtained based on the analysis of SNPs, although some significant differences were observed.
- the group of P. stutzer ⁇ which according to the phylogeny of SNPs is closer to the group of P. pulida than P. aeruginosa, appears as the basal group, the most divergent of all those analyzed, based on its content of accessory genes.
- Pseudomonas BBB001 is also part of the P. pulida group, constituting a well-differentiated subgroup together with P. aikyiphenolica and Pseudomonas sp. NZ CP024478.1 (strain HLS-6).
- the analysis establishes, with significant support value, a closer relationship between Pseudomonas BBB001 and Pseudomonas sp. (HLS-6 strain). It is therefore likely that the accessory gene repertoire of Pseudomonas BBB001 is more similar to that of Pseudomonas sp. (strain HLS-6) than that of P. aikyiphenolica.
- Non photochemical quenching-NPQ Non photochemical quenching-NPQ
- CAT catalase
- GR glutathione reductase
- the photosynthetic fluorescence parameters F0, Fv/Fm, PSII, NPQ
- SOD photosynthetic fluorescence parameters
- Ascorbate-glutathione cycle dehydroascorbate reductase-DHR, monodehydroascorbate reductase-MDHR, glutathione reductase-GR
- the antioxidant potential ability to inhibit the oxidation of B-carotene
- the levels of malondialdehyde-MDA an indicator of the oxidative state of the cell, were assessed.
- Non photochemical quenching-NPQ Non photochemical quenching-NPQ
- a decrease in chlorophyll B were observed at both sampling times;
- the metabolic profile of enzymes related to the control of oxidative stress consists of a significant increase in superoxide dismutase (SOD) and monodehydroascorbate reductase (MDHA) activity, and a decrease in ascorbate peroxidase (APX) activity, associated with an improvement in the antioxidant potential and a level of malondialdehyde slightly lower than the control in fruiting.
- SOD superoxide dismutase
- MDHA monodehydroascorbate reductase
- APX ascorbate peroxidase
- chlorosis Since chlorosis appeared, they began to be irrigated with Hoagland with Fe, providing Fe in insoluble form (CI3Fe), maintaining control with a complete Hoagland solution with soluble Fe; 3 doses of bacteria were applied with a difference of 4 days between applications. At 2 weeks, chlorosis had reversed, photosynthetic fluorescence parameters (F0, Fv/Fm, PSII, NPQ) were measured and plants were harvested. Dry weight, photosynthetic pigments, and foliar nutrient analysis were analyzed.
- palmensis with Arthrobacter oxydans CECT code 30231 had a synergistic effect according to Colby (http://www.jstor.org/stable/4041058) in the absorption of Fe, increasing the Fe content by 36.4% with regarding the control and the effect of each strain individually. Likewise, an increase of 1.5%, 9.7% and 9.5% was observed in the analysis of the absorption of nitrogen, phosphorus and potassium.
- this bacterial strain has a specific application in the agri-food, chemical and pharmaceutical industries, as it can be used as part of any preparation (individually or in combination with other microorganisms) and making them come into contact (with the strain or any part of it) with the seed, root or aerial system of plants by any available means, in any plant species, or in any form of in vitro culture, to increase the adaptability of the strain to abiotic stress conditions and improve mineral nutrition, specifically iron, nitrogen, phosphorous and potassium.
Abstract
Cepa bacteriana Pseudomonas palmensis BBB001, microorganismo del grupo de las bacterias Gram -, género Pseudomonas, estimulante del metabolismo adaptativo de plantas frente a estrés abiótico y mejoradora de la nutrición vegetal en hierro y otros nutrientes. Esta cepa, aislada a partir de la rizosfera de Nicotiana glauca, ha sido caracterizada desde el punto de vista morfológico, bioquímico y genético mediante secuenciación total de su genoma, identificándose como nueva especie, disminuye el estrés oxidativo en las plantas induciendo una mayor producción y una mejora en su adaptación a condiciones de estrés abiótico, por ejemplo, por falta de agua o alta salinidad, por lo que puede ser utilizada, sola o en combinación con otras cepas, con objeto de incrementar el fitness de las plantas en especies vegetales de interés agronómico alimentario. Por otra parte, dado que es capaz de mejorar la nutrición de hierro, fósforo y potasio, tiene también aplicación como biofertilizante, tanto en agricultura ecológica como convencional.
Description
DESCRIPCION
Pseudomonas palmensis BBB001 estimulante del metabolismo adaptativo de plantas frente a estrés abiótico y mejoradora de la nutrición mineral. -
La presente invención se refiere a la cepa bacteriana Pseudomonas palmensis (BBB001 código interno del laboratorio), como nueva especie del género Pseudomonas, para su uso en el tratamiento de plantas con el objeto de mejorar la adaptación a estrés abiótico, disminuyendo el estrés oxidativo de tal forma que aumenta el crecimiento y la producción. Además, es capaz de producir sideróforos, mejorando la nutrición de hierro de las plantas, revirtiendo los síntomas de déficit de hierro, y de estimular la movilización de otros nutrientes como fosforo y potasio, por lo que también resulta de interés como biofertilizante para agricultura ecológica y convencional.
Esta cepa ha sido depositada a los fines de patente en La Colección Española de Cultivos Tipo de la Universidad de Valencia (CECT), donde se le ha asignado el número 30222.
CAMPO DE APLICACIÓN. -
La invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología agroalimentaria, concretamente dentro de las bacterias reguladoras del crecimiento vegetal, ya que la referida cepa bacteriana puede servir de base para la preparación de diferentes tipos de productos estimulantes del metabolismo adaptativo de plantas. Estos productos mejorarán la adaptación de las plantas a distintas condiciones de estrés abiótico como pueden ser el déficit hídrico o el exceso de salinidad edáfica.
Y también dentro del campo de los biofertilizantes orgánicos, ya que la cepa puede utilizarse para mejorar la nutrición de la planta en general y más específicamente, la absorción de hierro en suelos, especialmente con pH básico, tanto en cualquier formulado bacteriano como con metabolitos bacterianos obtenidos en determinadas condiciones.
Además, puesto que se trata de una cepa perteneciente a una nueva especie, siguiendo la terminología utilizada para la indexation de bacterias del "Manual de Bacteriología Determinante” de Bergey’s, edición de marzo de 2001, junto con el análisis genómico realizado, la invención puede clasificarse como una de las especies bacterianas del género Pseudomonas.
ESTADO DE LA TÉCNICA.-
Los mecanismos de acción de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal se pueden resumir en dos tipos: directos, cuando las bacterias o sus metabolites alteran el metabolismo de la planta (actividad hormonal, estimulación de los mecanismos adaptativos), e indirectos, cuando sintetizan compuestos que facilitan la captación o movilización de nutrientes o evitan el crecimiento de microorganismos patógenos sobre la planta, sin alterar el metabolismo de esta. En el caso de esta patente, ambos resultan de interés. La planta posee un metabolismo secundario, altamente inducible, relacionado con la adaptación de la planta a situaciones adversas a las que tiene que hacer frente durante su vida.
El género Pseudomonas es común entre bacterias del suelo. Siguiendo la taxonomía del Manual Bergey's, edición marzo de 2001, esta bacteria se encuadra dentro del Dominio Bacteria, Phylum Proteobacteria, Clase gamma proteobacteria, Orden Pseudomonadales, Familia Pseudomonaceae. El género Pseudomonas es muy común en el sistema edáfico, y se ha descrito en repetidas ocasiones como bacteria protectora frente a distintas enfermedades de plantas. Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de colores amarillo-verdosos fácilmente solubles en agua. Entre otras funciones, estos pigmentos actúan como sideróforos (moléculas capaces de capturar el hierro del medio para el metabolismo del microorganismo). Además, presentan una gran versatilidad metabólica debido a un gran número de plásmidos que contienen operones inducibles para la síntesis de enzimas específicas que permitan catabolizar los compuestos presentes en el medio. La presencia de Pseudomonas sp. en la rizosfera de distintas plantas afecta de forma beneficiosa a su fisiología indicando que es muy posible su selección por la planta a nivel rizosférico. Los efectos de esta cepa sobre la fisiología de distintas plantas indican que la planta las selecciona en su beneficio.
Existen numerosas referencias en la literatura relativas a composiciones y formulaciones conteniendo cepas del género Pseudomonas, solas o en combinación con otros organismos para estimular y mejorar el crecimiento vegetal, o que sirven de base a la formulación de productos fitosanitarios, protectores frente a patógenos o para preservar el buen crecimiento de los cultivo, algunas de las cuales han sido patentadas, caso de las patente europeas con números de publicación en España ES2707807-T3, 2019-04-05, Nueva Pseudomona fluorescente de la especie Pseudomonas azotoformans para la estimulación de la emergencia y el crecimiento de las plantas, y ES2624788-T3, 2017-07-17, Cultivo biológico de una cepa de la especie Pseudomonas graminis y uso de dicho cultivo como antagonista
para el control biológico de bacterias patógenas; o la patente nacional ES2572746-B1 , 2016- 09-21 , para Procedimiento de obtención de una composición promotora del crecimiento vegetal que comprende Pseudomonas putida y usos de esta.
En el caso de la presente solicitud de patente las nuevas tecnologías han permitido dirimir una nueva especie, Pseudomonas palmensis BBB001 , en base a sus características genéticas únicas, que la diferencian de otras cepas de Pseudomonas cuando se compara el genoma de BBB001 con los 254 genomas completos y disponibles de Pseudomonas.
Los parámetros que permiten identificar una nueva especie son alguno de los siguientes: i) identidad nucleotídica promedio (ANI) e identidad aminoacídica promedio (AAI), siendo los valores límite para definir una nueva especie menor del 95%; ii) hibridación digital DNA-DNA (dDDH), con valores por debajo del 70%; iii) Contenido guanina-citosina (G+C), valores por encima del 1%; iv) índice de correlación de las frecuencias de uso de tetranucleótidos (TETRA), con valores por debajo de 0.99; v) análisis de secuencias multilocus (MLSA), con valores por debajo del 97%.
Al comparar el genoma de BBB001 con los 254 genomas disponibles, Pseudomonas alkylphenolica es la especie más cercana según los valores de ANI y AAI fueron 83.39% y 85.11%, respectivamente, ambos por debajo del 95%, los valores de hibridación digital DNA- DNA (dDDH) 27.10%, por debajo del 70% y el contenido de guanina-citosina (G+C) 3.43%, por encima del 1%. Los valores del índice de correlación de las frecuencias de uso de tetranucleótidos (TETRA) frente a la especie más semejante en este análisis, Pseudomonas sp.NZ CP024478.1 (cepa HLS-6), fue de 0.983, por debajo del 0.99. Por otra parte, en el análisis filogenético y delimitación de especies en base al análisis de secuencias multilocus (MLSA) de los genes seleccionados (16S rRNA, gyrB, rpoB rpoD), la mayor estima de similitud es del 91.52% con respecto a Pseudomonas japónica, que es la especie más semejante en este análisis; valores por debajo de 97% indican que es una nueva especie. La filogenia de single nucleotide polymorphisms (SNPs) en el conjunto de genes compartidos por todos los genomas de Pseudomonas (core genome), reveló que su core genome consta de 585 familias génicas, representando tan sólo el 0.05 % del contenido total de familias génicas de este grupo, valor que refuerza su identidad como nueva especie. Y, por último, la filogenia basada en la presencia o ausencia de familias de genes homólogos en el pan-genome, arroja resultados muy similares a los obtenidos en base al análisis de SNPs. En las tablas 2 y 3 del apartado forma de realización de la invención aparecen todos los resultados de similitud entre la nueva especie y las más semejantes a ella.
Por tanto, en base a la aproximación polifásica, se ha descrito una nueva especie para la cual se ha propuesto el nombre de Pseudomonas palmensis sp. nov (N.° Depósito CECT 030222). Las características fisiológicas y el análisis genético de esta cepa permiten identificarla inequívocamente, diferenciándola de otras especies del género Pseudomonas.
La cepa Pseudomonas palmensis se caracteriza por sus efectos beneficiosos sobre las plantas: induce el metabolismo implicado en la eliminación de radicales libres producidos en situaciones de estrés, mejorando la adaptación de la planta a dichas condiciones mediante un mecanismo de homeostasis del metabolismo redox y un aumento del potencial hídrico en estas condiciones, claro indicador de la capacidad de esta cepa para inducir un equilibrio hídrico, dando como resultado una mayor capacidad de la planta para resistir condiciones estrés hídrico. Por otra parte, es capaz de mejorar la nutrición férrica de las plantas, mejorando asimismo su crecimiento.
Al ser una nueva especie, no existen patentes de Pseudomonas palmensis sobre ninguno de los efectos reportados. Con respecto al género Pseudomonas óay diversas publicaciones que describen la capacidad de éstas de producir sideróforos y modular el metabolismo implicado en el estrés oxidativo (Bar-Ness et. al., 1991 , Journal Iron mnutrition and interactions in plants, 271-281 ; Weger et. al., 1988, DOI: 10.1128/jb.170.10.4693-4698.1988; Ghosh et. al., 2018, DOI: https://doi.org/10.1007/s13213-018-1366-7; Vives-Peris et. al., 2018, DOI: https://doi.org/10.1007/s00299-018-2328-z). Con respecto a las cepas de Pseudomonas que mayor similitud presentan con la nueva especie propuesta en base los criterios anteriormente expuestos, que son P.aikyiphenolica, P.japonica o Pseudomonas sp.NZ CP024478.1 (cepa HLS-6), no existe ninguna patente ni publicación sobre estas especies en el campo de aplicación de la presente invención. Existe alguna información sobre P.japonica relacionada con la degradación de aceite de industria (Pseudomonas japónica sp. nov., a novel species that assimilates straight chain alkylphenols. JOURNAL OF GENERAL AND APPLIED MICROBIOLOGY 2008 54;1 Strain Number cited in this paper: TISTR 1526) y con la capacidad de evitar la adhesión de los moluscos a cualquier superficie (WO2014149324A1), pero no relacionadas con el campo agroalimentario al que se refiere la presente invención.
LA INVENCIÓN.-
El objeto de la invención que aquí se describe y que, a la vista del estado de la técnica anterior, se entiende cumple con las condiciones de novedad y actividad inventiva
necesarias para poder ser merecedora del derecho de patente, es el aislamiento y caracterización de la cepa bacteriana Pseudomonas palmensis BBB001 (CECT 30222), que es un microorganismo del grupo de las bacterias Gram -, género Pseudomonas, con capacidad de estimular el metabolismo de adaptación a estrés abiótico de las plantas, disminuyendo el estrés oxidativo mediante inducción del metabolismo implicado en la eliminación de radicales libres producidos en situaciones de estrés, mejorando la adaptación de la planta a dichas condiciones a través de la homeostasis del metabolismo redox, de tal forma que se estimula el crecimiento y producción, además de tener aplicación por la movilización de nutrientes, especialmente para la nutrición de hierro.
Las características fisiológicas y el análisis genético de esta cepa, con un genoma secuenciado conforme a la norma OMPI ST.25 que se integra al final de la presente memoria descriptiva, permiten identificarla inequívocamente, diferenciándola de otras especies del género Pseudomonas.
En un screening de bacterias realizado en la rizosfera de Nicotiana glauca se aisló una cepa perteneciente al género Pseudomonas cuyo análisis genético no permitió situarla en ninguna de las especies conocidas de este género.
Una vez aislada se realizó una caracterización del repertorio de genes únicos de Pseudomonas BBB001. En el análisis comparativo de los 254 genomas completos, el programa BPGA identificó un total de 489 genes presentes exclusivamente en
Pseudomonas BBB001, de los cuales 41 genes fueron asociados a un subsistema concreto. De entre los 41 genes únicos de Pseudomonas BBB001 destacan, por su abundancia, los relacionados con la captación y metabolismo del hierro, y los relacionados con la síntesis de aminoácidos y derivados. Estos 41 genes correspondientes a la SEQ ID NO: 1 a 41 de la lista de secuencias, tienen capacidad de codificar formulaciones para la producción de sustancias o compuestos a escala industrial, y pueden ser utilizados para expresión heteróloga en la obtención de productos que contengan materia biológica de la cepa.
Después de su caracterización se realizaron diversas pruebas para poner de manifiesto actividades bioquímicas indicadoras de su potencial capacidad de inducción del metabolismo de adaptación, disminuyendo el estrés oxidativo y promoción del crecimiento vegetal, por una parte, y por otra, su capacidad para mejorar la nutrición férrica. Estas fueron, producción de auxinas, degradación de 1-aminociclopropano-1-carboxilato, solubilización de fosfato y producción de sideróforos y quitinasas, resultando positivo para la
producción de auxinas y sideróforos in vitro. El perfil de BIOLOG Eco indica que es capaz de degradar los ácidos tricarboxilicos málico, hidroxibutírico y ácido glucosamínico, y la degradación de glucosa 1 P, celobiosa, lactosa y N-acetilglucosamina destacan entre los azúcares. Como fuentes de nitrógeno, utiliza putrescina, feniletilamina, serina y ácido glicol- L-glutámico.
Hasta el momento se han realizado experiencias consistentes en la inoculación directa de Pseudomonas palmensis en planta modelo (Arabidopsis thaliana) donde ha caracterizado el perfil metabólico de enzimas relacionados con el control del estrés oxidativo y equilibrio redox de la planta y la modificación de los parámetros fotosintéticos relacionados con la fluorescencia como un indicador del potencial de estimulación del crecimiento y producción vegetal, y también del estado de salud de la planta como resultado de los efectos sobre equilibrio redox de la planta.
Asimismo, se han realizado inoculaciones directas en plantas de mora (Rubus sp. Var Lochness), creciendo en invernaderos de producción. Se ha determinado la producción total acumulada, y se ha determinado el perfil metabólico de enzimas relacionados con el control de estrés oxidativo en hojas de mora, en dos momentos del ciclo (floración y plena producción), realizando dos aplicaciones al mes, durante los 6 meses que dura el ciclo de producción.
Estos dos experimentos realizados en distintas especies vegetales demuestran que la bacteria es capaz de modular el metabolismo implicado en la adaptación de la planta a estrés abiótico, controlando el estrés oxidativo aumentando la capacidad para eliminar los radicales libres de oxígeno (ROS) mediante: 1) un aumento en las actividades de los enzimas de scavenging de ROS, superóxido dismutasa (SOD) o catalasa (CAT), y 2) un aumento de la disipación del exceso de energía fotosintética responsable de la generación de radicales libres ROS (non photochemical quenching, NPQ) en condiciones normales.
Se ha realizado otro experimento para demostrar la capacidad de estimulación del metabolismo adaptativo a condiciones de estrés por salinidad en plantas de tomate. La cepa, induce una mejora sustantiva en el potencial hídrico con respecto al control, incrementando ligeramente el contenido en prolina, un osmolito compatible. El aumento del potencial hídrico en estas condiciones es un claro indicador de la capacidad de esta cepa para inducir un equilibrio hídrico, generando como resultado una mayor capacidad de la planta para resistir condiciones de salinidad o estrés hídrico.
En otro experimento realizado en olivos en producción en un sistema intensivo y con riego, se ha realizado un experimento con BBB001 para evaluar la capacidad de incrementar la producción en condiciones de riego habitual y con un 25% de reducción en el riego. En un muestreo previo a la cosecha, hemos encontrado un aumento de más de un 40% en el peso fresco medio de los frutos con respecto a su control en condiciones de riego estándar, y con reducción de agua. Por otra parte, el peso de los frutos de las plantas tratadas con BBB001 a nivel radical, alcanzaron los mismos valores en ambos regímenes de riego.
Por otro lado, se han realizado experimentos de reversión de la clorosis por deficiencia de hierro en plantas de tomate. Estos experimentos se han realizado mediante la inoculación directa de Pseudomonas palmensis en plantas de tomate en las que se había inducido una deficiencia de hierro y el sustrato se había ajustado a pH básico para asegurar la insolubilización del Fe. Asimismo, se ha ensayado la cepa crecida en un medio especifico de producción de sideróforos (medio succinato modificado), con la cepa, y también ensayamos sólo el líquido metabólico. Se han encontrado resultados similares con todos los tratamientos, destacando el efecto sobre la mejora del contenido en hierro, fósforo y potasio, la mejora de la fotosíntesis, un aumento de pigmentos fotosintéticos y, por tanto, una mejora el en crecimiento (aumento de peso seco).
Los referidos experimentos sobre el uso Pseudomonas palmensis BBB001 con capacidad de estimular el metabolismo de adaptación a estrés abiótico de las plantas, disminuyendo el estrés oxidativo, por aumento en la actividad de los enzimas relacionados con el scavenging de ROS, de tal forma que se estimula el crecimiento y producción, además de tener aplicación como biofertilizante porque estimula la movilización de nutrientes, concretamente la nutrición de hierro, fósforo y potasio, se exponen al final de la presente memoria, dentro del apartado forma de realización.
La finalidad que se persigue, en definitiva, con esta invención y que constituye la ventaja técnica aportada con la misma, es disponer de una bacteria (bioestimulante/biofertilizante) que mejore la capacidad de estimular el metabolismo de adaptación a estrés abiótico de las plantas, disminuyendo el estrés oxidativo, de tal forma que se estimula el crecimiento y producción. Por otra parte, tiene aplicación como biofertilizante porque estimula la movilización de nutrientes, concretamente la nutrición de hierro, fósforo y potasio, haciendo entrar en contacto por cualquier medio disponible a dicha bacteria o alguna de sus partes con la planta, mejorando el efecto con determinadas especies bacterianas.
En consecuencia, con la presente solicitud de patente se reivindica el uso de la cepa Pseudomonas palmensis BBB001 , o de los metabolites del caldo de cultivo de la cepa, para su aplicación en cualquier tipo de especie vegetal, con el fin de incrementar la capacidad de adaptación de las plantas a cualquier condición de estrés abiótico, caso por ejemplo de condiciones de salinidad, aumentando la producción, así como para mejorar la nutrición mineral en hierro, fósforo y potasio de las plantas.
Dicho uso de Pseudomonas palmensis BBB001 podrá ser formando parte de cualquier preparado con la cepa, ya sea individualmente o en combinación con otras especies bacterianas u organismos, y por cualquier medio disponible que ponga la bacteria en contacto con la semilla, el sistema radical o aéreo de las plantas.
Particularmente el uso de Pseudomonas palmensis BBB001 es adecuado en combinación con Pseudomonas fluorescens CECT 9015, o formando parte de cualquier preparado con esta otra cepa, para mejorar la respuesta a estrés salino; y también en combinación con Arthrobacter oxydans Código CECT 30231, para mejorar la nutrición mineral en hierro, nitrógeno, fósforo y potasio, tanto en agricultura ecológica como convencional.
FORMA DE REALIZACIÓN. -
La cepa del género Pseudomonas que aquí se reseña se aisló estudiando la rizosfera de poblaciones naturales de Nicotiana glauca en un transecto de la isla de Las Palmas de Gran Canaria (Islas Canarias). Esta especie vegetal (Nicotiana glauca) se seleccionó por ser de la familia Solanaceae, por tener un metabolismo secundario activo y por haber resultado una buena fuente de microorganismos con actividad biológica de interés en agricultura.
Los muéstreos de rizosfera para el aislamiento de la cepa bacteriana se realizaron en poblaciones naturales de Nicotiana glauca en diciembre de 2017. Como resultado de dicho muestreo se coleccionaron 450 cepas entre las que se encontró Pseudomonas palmensis (BBB001 , código interno del laboratorio). El aislamiento de dicha cepa se realizó en agar nutritivo (PCA).
En el laboratorio este microorganismo se mantiene con una elevada tasa de supervivencia en glicerol al 20% en caldo nutritivo (Pronadisa) a -80°C o en glicerol al 15% en agua a -
20°C y se recuperan con facilidad en el medio de cultivo utilizado para el aislamiento tanto en fase sólida como en fase liquida a 28°C.
Características morfológicas, bioquímicas y genéticas de Pseudomonas palmensis BBB001.-
Para la caracterización de la cepa se consideraron diferentes caracteres fenotípicos que se pormenorizan en esta memoria: (i) morfología de las colonias (ii) morfología de las células, (iii) perfil metabólico, iv) Análisis comparativo del genoma de la cepa Pseudomonas BBB001 y los genomas completos disponibles del género Pseudomonas.
En la Tabla 1 se especifica la morfología de las colonias a las 24 h de incubación a 28° en agar para métodos estándar (PCA).
TABLA 1
Creciendo en medio líquido (Caldo nutritivo Pronadisa) el color del medio cambia a amarillo desde la fase exponencial de crecimiento a la fase estacionaria de crecimiento.
Los caracteres morfológicos de Pseudomonas palmensis BBB001 a las 24 h de incubación a 28° en agar para métodos estándar (PCA) corresponden a un bacilo Gram negativo.
Una vez aislada y caracterizada, con código de referencia interno BBB001 , se realizaron diversas pruebas para poner de manifiesto el potencial de esta bacteria. Estas fueron, producción de auxinas, degradación de 1-aminociclopropano-1-carboxilato, solubilización de fosfato y producción de sideróforos y quitinasas, resultando positivo para la producción de sideróforos.
El perfil metabólico (BIOLOG Eco, www.biolog.com/products-portfolio-overview/microbial- community-analysis-with-ecoplates/) indica que es capaz de degradar los ácidos: tricarboxilicos mélico, hidroxibutírico y ácido glucosamínico, y la degradación de glucosa 1 P, celobiosa, lactosa y N-acetilglucosamina destacan entre los azúcares. Como fuentes de nitrógeno, utiliza putrescina, feniletilamina, serina y ácido glicol-L-glutámico.
Para investigar la relación filogenética de la cepa Pseudomonas palmensis BBB001 con respecto a las demás especies del género Pseudomonas y definir su asignación taxonómica se comparó su genoma completo con los 254 genomas de Pseudomonas que se encuentran disponibles y completos en las bases de datos. Se utilizaron tres estrategias principales, según los siguientes criterios definitorios de una nueva especie de bacteria:
1. Estimas del grado de similitud entre genomas: identidad nucleotídica promedio (ANI), identidad aminoacídica promedio (AAI), hibridación ADN-ADN in sílico o dDDH (digital DNA- DNA hybridisation), diferencia en el contenido en guanina-citosina (G+C) y frecuencia de uso de tetranucleótidos (TETRA):
Los valores de ANI y AAI representan una medida robusta de la distancia evolutiva entre dos genomas; cuando estos valores son inferiores al 95%, se asume que se trata de una nueva especie. Se ha comprobado empíricamente que valores ANI y AAI del 95-96 % equivalen a un valor DDH (hibridación ADN- ADN) del 70 %, otro parámetro comúnmente utilizado para delimitar especies procariotas (e.g., Konstantinidis y Tiedje 2005, PNAS 102:2567-2572; Richter y Rosselló-Mora 2009, PNAS 106:19126-19131; Kim et al.2014, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64:346-351).
Las diferencias en el contenido en G+C dentro de una misma especie no son generalmente superiores al 1 %; Meier-Koltho et al. 2014, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64:352-356).
El índice dDDH, ha mostrado una mayor correlación con los valores de DDH tradicionales (Auch et al. 2010, Standards in Genomic Sciences 2:1). Por ello, se considera que valores de dDDH superiores al 70 % son indicativos de que los genomas comparados pertenecen a la misma especie.
Los valores TETRA entre el genoma de Pseudomonas BBB001 y los 26 genomas más relacionados. Los genomas de cepas estrechamente relacionadas mostrarán, previsiblemente, frecuencias de uso de tetranucleótidos semejantes, con índices de correlación (TETRA) iguales o superiores a 0.99, por tanto,
valores de TETRA inferiores a 0.99, son indicadores de una nueva especie (Teeling et al. 2004, Environmental Microbiology 6:938947; Richter y Rosselló- Mora 2009, PNAS 106:19126-19131).
2. Análisis filogenético y delimitación de especies en base al análisis de secuencias multilocus (MLSA: multilocus sequence analysis):
La secuenciación del gen ribosomal 16S (16S rRNA) es la herramienta básica en los sistemas actuales de clasificación de especies bacterianas. Generalmente, se acepta que dos especies diferentes presentarán valores de similitud para el gen 16S rRNA inferiores al 98.65-99 % (Kim et al. 2014, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64:346-351). Sin embargo, en muchos casos, el gen 16S rRNA puede ofrecer un poder de resolución limitado. Por una parte, este gen puede presentar una baja capacidad de discriminación entre especies estrechamente relacionadas. Por otra parte, algunas especies pueden mostrar secuencias de 16S rRNA muy similares (<99 %), a pesar de ser claramente diferentes en base a los valores de DDH (Ash et al. 1991, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 41:343-346; Rosselló-Mora y Amann 2001, FEMS Microbiology Reviews 25:39- 67). En el caso concreto del género Pseudomonas, Mulet y colaboradores han recomendado el análisis de tres genes adicionales (gyrB, rpoB y rpoD) para delimitar especies, identificar nuevas cepas, o resolver las relaciones filogenéticas dentro de este grupo (Mulet et al. 2012a, Systematic and Applied Microbiology 35:455-464; Mulet et al. 2012b, Systematic and Applied Microbiology 35:145-149; Sánchez et al. 2014, Systematic and Applied Microbiology 37:89-94). Mulet y colaboradores establecieron una similitud media del 97 % como criterio para la delimitación de especies en base al MLSA de estos cuatro genes dentro del género Pseudomonas (Mulet et al. 2010, Environmental Microbiology 12:1513-1530).
3. Análisis filogenético a nivel de genoma completo, basado en la identificación de variantes (single nucleotide polymorphisms, SNPs) en la fracción conservada del genoma (core genome) y en la presencia / ausencia de genes en el pan-genome:
° Filogenia de SNPs (single nucleotide polymorphism) en el conjunto de genes compartidos por todos los genomas de Pseudomonas (core genome), y filogenia basada en la presencia o ausencia de familias de genes homólogos en el pan-
genome. Los avances en la secuenciación y comparación de genomas bacterianos han revelado una inesperada variabilidad en el contenido génico de las distintas especies de un mismo género, e incluso de las distintas cepas de una misma especie. Los genomas de cepas de Escherichia coli por ejemplo, comparten tan solo el 40 % de sus genes (Rasko et al. 2008, Journal of Bacteriology 190:6881-6893). Esto ha llevado a formular el concepto de core genome o genoma básico, para definir al conjunto de genes compartido por todas las especies bacterianas de un determinado grupo. Los genes que están ausentes en uno o más miembros del grupo y que, por tanto, no forman parte del core genome, se denominan genes accesorios. Por último, el repertorio de genes completo (es decir, la suma del core genome y de los genes accesorios) se ha denominado pan-genome.
Por último, como resultado obtenido del análisis del pan-genoma de Pseudomonas, se caracterizó el repertorio de genes únicos presentes en la cepa Pseudomonas BBB001.
1. Estimas del grado de similitud entre genomas. -
1.1. Parámetros identidad nucleotídica promedio (ANI) e identidad aminoacídica promedio (AAI):
La primera etapa de este análisis consiste en la comparación a nivel nucleotídico y aminoacidico del genoma de Pseudomonas BBB001 respecto a los todos los genomas completos disponibles en la base de datos RefSeq (NCBI Reference Sequence database) para el género Pseudomonas.
Las estimas de los índices de identidad nucleotídica (ANI) fueron calculadas con el programa OAU.jar.
Para la comparación del contenido aminoacídico (AAI) se utilizó la herramienta CompareM vO.O.23 (https://github.com/dparks1134/CompareM). Esta herramienta identifica los genes homólogos y calcula la identidad entre ambos.
1.2. La hibridación ADN-ADN in sílico (dDDH) y contenido en G+C:
En base a los resultados del apartado anterior, se seleccionaron los 26 genomas situados en el cuarto cuartil de la distribución de los valores de ANI (i.e., previsiblemente, los más estrechamente relacionados con Pseudomonas BBB001), para calcular las distancias intergenómicas y los índices dDDH, utilizando el servidor web GGDC (Genome-to-Genome Distance Calculator. Este servidor también calcula la diferencia del contenido en G+C de los genomas analizados.
1.3. Frecuencias de uso de tetranucleótidos (TETRA):
Se utilizó el software JSpecies (Richter y Rosselló-Mora 2009, PNAS 106:19126-19131) para calcular las diferencias en los perfiles de uso de tetranucleótidos entre el genoma de Pseudomonas BBB001 y los 26 genomas más relacionados.
2. Análisis filogenético y delimitación de especies en base al análisis de secuencias multilocus (MLSA: multilocus sequence analysis). -
En el análisis multilocus, realizado también en el subconjunto de 26 genomas, se incluyeron los cuatro genes housekeeping recomendados para la delimitación de especies en el género Pseudomonas: 16S, gyrB, rpoD y rpoB (e.g., Mulet et al. 2012a, Systematic and Applied Microbiology 35:455-464).
-16S: Se utilizó un pipeline casero de scripts en lenguaje bash para extraer las múltiples copias de este gen en cada uno de los genomas completos analizados. Estas copias fueron colapsadas en un consenso en el que cada posición variable fue representada como una ambigüedad.
-gyrB, rpoD y rpoB: Los genes gyrB, rpoD y rpoB se extrajeron de los genomas completos en cuestión mediante un mapeo contra referencia utilizando BWA 0.7.12 (Li y Durbin 2010, Bioinformatics 26:589- 595).
Además, para poder comparar la filogenia resultante con la obtenida por Mulet y colaboradores al investigar la posición filogenética de Pseudomonas alkylphenolica (Mulet et al. 2015, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 65:4013-4018), se incluyeron en el análisis las secuencias de otras 13 especies o cepas utilizadas en ese trabajo, sin genomas completos publicados.
Para cada uno de los genes mencionados se realizó un alineamiento de todas las secuencias utilizando el programa Mafft v7.310 (Katoh et al. 2002, Nucleic Acids Research 30:3059-3066). En cada uno de los 4 alineamientos se eliminaron aquellas regiones que fueran ambiguas (i.e. regiones ausentes en algunas secuencias y/o mal alineadas).
Por último, se concatenaron los 4 genes y se estimaron los modelos de sustitución nucleotídica que mejor se ajustaban a cada uno de ellos utilizando PartitionFinder 2 (Lanfear el al. 2012, Molecular Biology and Evolution 29:1695-1701). Para la obtención del árbol filogenético se utilizó MrBayes v3.2 (Ronquist et al. 2012, Systematic Biology 61 :539-542).
También se realizó un estudio de la similitud de estos 4 genes entre Pseudomonas BBB001 y el resto de las especies o cepas, utilizando un módulo de Biopython llamado Distancecalculator. En el caso del gen 16S, al ser de copia múltiple, se calculó la media de la similitud obtenida para cada copia.
3. Análisis filogenéticos basados en las secuencias de genomas completos.
El software BPGA (Chaudhari et al. 2016, Scientic Reports 6:24373) se utilizó para realizar una agrupación por homología de los genes anotados en los 253 genomas completos de Pseudomonas y en Pseudomonas BBB001. El umbral de agrupación fue del 50% de homología, agrupándose así genes homólogos y también genes que puedan pertenecer a una misma familia. BPGA identifica las familias de genes compartidas por todos los genomas analizados (core genome), los genes accesorios y, además, las funciones únicas, es decir genes que no se han agrupado en ninguno de los clusters creados.
3.1. Filogenia de SNPs (single nucleotide polymorphisms) presentes en los genes core:
En primer lugar, se diseñó un pipeline casero de scripts en lenguaje bash para extraer las secuencias nucleotídicas asociadas a los genes identificados como core genome por BPGA.
Se analizó la distancia genética de estas secuencias utilizando Distancecalculator y se generó un alineamiento para cada uno de los genes core utilizando Mafft v7.310 (Katoh et al. 2002, Nucleic Acids Research 30:3059-3066). Finalmente, se extrajo la información del contenido de gaps en los alineamientos generados para identificar alineamientos de mala calidad.
Para el estudio de los SNPs, es necesario asegurar que todas las posiciones extraídas son posiciones homologas, por lo que se eliminaron aquellos genes que incluían secuencias con una distancia mayor al 50% y que además incluían un contenido de gaps superior al 10% de la longitud de secuencia.
Geneious v10.2.2 (Kearse et al. 2012, Bioinformatics 28:1647-1649) se utilizó para eliminar las posiciones en las que más de un 10% de las secuencias tuvieran un gap y, finalmente, extraer los SNPs en formato PHYLIP.
El software RAxML v8.2.9 (Stamatakis 2014, Bioinformatics 30:1312-1313) se utilizó para generar el árbol filogenético de máxima verosimilitud de todos los SNPs concatenados. El soporte de cada nodo se calculó realizando 1000 réplicas de bootstrap.
3.2 Filogenia de la matriz presencia / ausencia de genes o familias de genes en el pan- genome:
La matriz de presencia / ausencia de genes producida por BPGA se utilizó para reconstruir un árbol filogenético de máxima verosimilitud utilizando IQTREE (Chernomor et al. 2016, Systematic Biology 65:997-1008). El soporte de cada nodo se calculó realizando 1000 réplicas de bootstrap.
4. Caracterización del repertorio de genes únicos de Pseudomonas BBB001.-
Para determinar si las funciones exclusivas identificadas no habían sido descritas previamente, se creó una base de datos local de la base de datos de proteínas nr (non- redundant) disponible en la colección de bases de datos del NCBI/EMBL/DDBJ para realizar una búsqueda de estas utilizando el programa BLAST+ 2.6.0 (Camacho et al. 2008, BMC Bioinformatics 10:421).
Se utilizó un pipeline casero de scripts escritos en lenguaje bash para extraer la información relevante de la primera correspondencia obtenida en la búsqueda realizada. Los genes exclusivos se presentan en archivo adjunto.
5. Discusión de resultados.-
Los resultados obtenidos al comparar nuestra cepa con 254 genomas de Pseudomonas y que han permitido dirimirla como una nueva especie, Pseudomonas palmensis BBB001 , se indican a continuación; todos los valores son el resultado de la comparación con la especie más parecida disponible. Así sus características genéticas únicas son: con respecto a
Pseudomonas alkylphenolica, valores de ANI y AAI de 83.39% y 85.11%, respectivamente
(tabla 2), los valores estimados de dDDH de 27.10 %, contenido en G+C, que muestra una diferencia de 3.43 % (tabla 2). Asimismo, presenta unos valores de TETRA de 0.983, frente a la especie más semejante en este análisis Pseudomonas sp.NZ CP024478.1 (cepa HLS-
6) (tabla 2).
La Tabla 2 muestra los resultados de las estimas del grado de similitud entre genomas. Para cada genoma, se especifica su longitud (en pares de bases, pb), el número de genes anotados, y los valores de ANI, AAI, dDDH, distancia intergenómica, diferencia en el contenido en G+C e índice TETRA estimados en la comparación con el genoma de
Pseudomonas BBB001. En la columna 1 , tras el nombre de la especie, se indica el número de acceso del genoma en RefSeq.
TABLA 2
Las estimas de similitud en el análisis de MLSA para el gen 16S rRNA (secuencia depositada en Genebank MW009702) arrojaron valores de entre 98.52 % y 99.42 %, próximos o por encima del valor umbral para ser incluidas en la misma especie, sin embargo, los valores de similitud para los otros tres genes incluidos en el MLSA son, sin embargo, considerablemente inferiores <97% (91.52%, con respecto a Pseudomonas japónica, especie más semejante en este análisis, Tabla 3) establecido por Mulet y
colaboradores para la delimitación de especies en base al MLSA de estos cuatro genes dentro del género Pseudomonas.
La Tabla 3 muestra el porcentaje de similitud para cada uno de los cuatro genes incluidos en el MLSA y similitud media calculada para los cuatro genes conjuntamente.
TABLA 3
Filogenia de SNPs en el conjunto de genes compartidos por todos los genomas de Pseudomonas (core genome). La comparación de los 254 genomas completos disponibles para el género Pseudomonas y del genoma de Pseudomonas BBB001 , realizada con el software BPGA, reveló que su core genome consta de 585 familias génicas, representando tan solo el 0.05 % del contenido total de familias génicas de este grupo. La gran mayoría de las familias que constituyen el core genome están asociadas a funciones de traducción y biogénesis de ribosomas, o de metabolismo y transporte de aminoácidos.
Tras extraer del grupo de familias del core genome los genes ortólogos (275 genes), se identificaron un total de 164394 posiciones polimórficas (single nucleotide polymorphisms, SNPs) en los 254 genomas. En base a las SNPs se obtienen cinco grandes grupos bien diferenciados, que concuerdan en general con la filogenia del género Pseudomonas presentada en Gomila et al. 2015 (Frontiers in Microbiology 6:214):
° Grupo de P. aeruginosa, P. denitrificans, P. knackmussii y P. citronellolis. (102 genomas)
° Grupo de P. stutzeri, al que pertenece también P. baleárica. (11 genomas)
° Grupo de P. syringae, en el que se encuentran también P. amygdali, P. savastanoi, P. viridiava y P. cichorii. (22 genomas)
° Grupo de P. fluorescens, que incluye a otras especies como P. mandelii, P. koreensisis, P. brassicacearum, P. protegens o P. fragi. (57 genomas)
° Grupo de P. putida, dentro del que se encuentra Pseudomonas BBB001. (43 genomas)
° Otros grupos: (19 genomas)
El grupo de P. putida engloba a un total de 43 de los 254 genomas analizados completos y disponibles en bases de datos. Además de todos los genomas pertenecientes a P. putida, en este grupo se encuentran otras especies como P. monteilii o P. parafulva. En concordancia con los resultados del MLSA, Pseudomonas BBB001 forma un subgrupo estadísticamente bien apoyado con la especie P. alkylphenolica y Pseudomonas sp. NZ CP024478.1 (cepa HLS-6). Dentro de este subgrupo no es posible hacer una comparación directa con los resultados del MLSA, ya que las especies P. japónica y P. vranovensis no
disponen de genomas completos publicados y, por tanto, no están incluidas en el análisis del core genome. Sin embargo, si bien la filogenia del MLSA no permitió resolver la posición filogenética de Pseudomonas BBB001 con respecto a las demás especies, la filogenia de SNPs proporcionó mayor resolución, recuperando a Pseudomonas BBB001 como el linaje basal de este subgrupo (es decir, Pseudomonas BBB001 fue la primera en separarse de P. alkylphenoiica y Pseudomonas sp. cepa HLS-6).
Filogenia basada en la presencia o ausencia de familias de genes homólogos en el pan- genome. El análisis comparativo de los 254 genomas reveló la presencia de un total de 65137 familias de genes accesorios en el pan-genome. La información sobre la presencia o ausencia de genes en cada genoma fue transformada en una matriz binaria.
En general, la filogenia obtenida a partir de la información sobre la presencia / ausencia de genes en el pan-genome fue similar a la obtenida en base al análisis de SNPs, aunque se observó alguna diferencia significativa. Por ejemplo, el grupo de P. stutzerí, que según la filogenia de SNPs es más cercano al grupo de P. pulida que P. aeruginosa, aparece como el grupo basal, el más divergente de todos los analizados, en base a su contenido de genes accesorios.
En la filogenia del pan-genome, Pseudomonas BBB001 forma parte también del grupo de P. pulida, constituyendo un subgrupo bien diferenciado junto a P. aikyiphenolica y Pseudomonas sp. NZ CP024478.1 (cepa HLS-6). En este caso, al contrario que en la filogenia de SNPs, el análisis establece, con un valor de apoyo significativo, una relación más estrecha entre Pseudomonas BBB001 y Pseudomonas sp. (cepa HLS-6). Es probable, por tanto, que el repertorio de genes accesorios de Pseudomonas BBB001 sea más similar al de Pseudomonas sp. (cepa HLS-6) que al de P. aikyiphenolica.
II. Pruebas de Pseudomonas paimensis como estimulante del metabolismo adaptativo de las plantas frente a estrés abiótico y mejoradora de la nutrición de hierro. -
1° Experimento de inoculación directa de Pseudomonas palmensis en planta modelo (Arabidopsis thaliana). Experimento realizado en cámara de experimentación en condiciones controladas de luz humedad y temperatura sobre un total de 42 plantas y un N = 3, con un modelo de bloques aleatorios- se inoculó una suspensión celular de la cepa en plántulas pregerminadas de A.thaiiana a las 2 y 5 semanas de la germinación. A las 6 semanas se
midieron los parámetros fotosintéticos de fluorescencia (F0, Fv/Fm, PSII, NPQ) se cosecharon las plantas, y se pesaron y se analizaron las actividades enzimáticas relacionadas con el scavenging de ROS (SOD, APX, CAT), y ciclo del Ascorbato glutathion (dehidroascorbato reductasa - DHR, monodehidroascorbato reductasa-MDHR, glutatión reductasa-GR). Se observó un aumento significativo de la capacidad de disipar energía (Non photochemical quenching-NPQ) y el perfil metabólico de enzimas relacionados con el control del estrés oxidativo consiste en un aumento significativo de la actividad catalasa (CAT)y glutatión reductasa (GR), y una disminución de la actividad APX. Se registró un aumento de peso fresco.
2° Experimento de inoculación directa de Pseudomonas palmensis en mora (Rubus var. Lochness) en invernaderos de producción. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 120 plantas y n=3, con un modelo experimental de bloques aleatorios. Se aplicaron suspensiones celulares de la cepa a nivel radical durante los 6 meses que dura el ciclo de producción, dos veces al mes de octubre a marzo. Se recogió la producción total y se determinaron dos momentos de muestreo, el floración y fructificación plenas. En cada momento se midieron los parámetros fotosintéticos de fluorescencia(F0, Fv/Fm, PSII, NPQ)y se cogieron hojas, donde se analizaron los pigmentos fotosintéticos y las actividades enzimáticas relacionadas con el scavenging de ROS (SOD, APX, CAT), y ciclo del Ascorbato-glutation (dehidroascorbato reductasa-DHR, monodehidroascorbato reductasa-MDHR, glutatión reductasa-GR); se valoró el potencial antioxidante (capacidad de inhibir la oxidación del B-caroteno) y los niveles de malondialdehido-MDA, indicador del estado oxidativo de la célula. Se observó un aumento significativo de la capacidad de disipar energía (Non photochemical quenching-NPQ)y una disminución en clorofila B en ambos momentos de muestreo; el perfil metabólico de enzimas relacionados con el control del estrés oxidativo consiste en un aumento significativo de la actividad superóxido dismutasa (SOD)y monodehidroascorbato reductasa (MDHA), y una disminución de la actividad ascorbato peroxidasa (APX), asociado a una mejora en el potencial antioxidante y un nivel de malondialdehido ligeramente inferior al control en fructificación. Se registró un aumento en la producción de fruta.
3° Experimento de estimulación del metabolismo adaptativo en condiciones de salinidad en tomate (var Casillas). Este experimento se realizó en invernadero en condiciones controladas de luz humedad y temperatura sobre un total de 336 plantas, 4 tratamientos, 3R por tratamiento, n=28, organizado en bloques aleatorios. Se germinaron las semillas de tomate en macetas, realizando 3 aplicaciones con una suspensión bacteriana a las 2, 4 y 6
semanas de la germinación; se aplicó una solución de NaCI 500 mM en el riego durante una semana, se mantuvo el riego normal durante una semana más, tras la cual se midió el potencial hídrico con cámara Scholander y se determinó el peso seco de raíz, de parte aérea y altura. Se observó una disminución significativa de la altura y el peso aéreo, un aumento del potencial hídrico y un aumento de prolina, osmolito relacionado con la resistencia a estrés hídrico. En este experimento se ensayó también la combinación de P.palmensis con otra pseudomonas P.fluorescens CECT9015. Se observó que la combinación de ambas producía aumentos significativos en altura y peso seco de raíz, así como un aumento en el potencial hídrico y un aumento significativo en la prolina, siendo este efecto sinérgico según Colby (http://www.jstor.org/stable/4041058) ya que la cepa CECT9015 de forma individual no era responsable de estos incrementos.
4° Se realizó un experimento en olivo superintensivo de regadío, reduciendo el riego un 25% sobre lo habitual (eliminando un riego de cada 4). Se ensayó la cepa de Pseudomonas BBB001 en aplicación radical. Las aplicaciones se realizaron cada 15 días desde abril hasta septiembre (12 aplicaciones). El número de plantas en el ensayo eran 20 por tratamiento (3) más el control, con los dos regímenes de riego, (100% agua y 75% agua). El muestreo de seguimiento (septiembre) previo a la cosecha indicó que la cepa BBB001 aplicada a nivel radical provocaba un incremento de peso fresco en las aceitunas del 44.52% sobre el control con agua (peso medio de 20 frutas, n=3), y de un 45.96% sobre el control con reducción de agua, alcanzando el mismo peso las aceitunas tratadas con BBB001 en los dos regímenes de riego.
5° Experimento de reversión de clorosis férrica en plantas de tomate (var. Casillas). Experimento realizado en invernadero en condiciones controladas de luz humedad y temperatura sobre un total de 216 plantas, 9 tratamientos, 24 plantas por tratamiento organizadas en 3 réplicas, siguiendo un modelo experimental de bloques aleatorios. El sustrato se mantuvo a pH básico con tampón bicarbonato sódico 5mM durante todo el experimento. Se germinaron las semillas en macetas de sustrato, regando con solución de Hoagland sin hierro una vez a la semana, durante 8 semanas, hasta que apareció la clorosis. Desde que apareció la clorosis, se empezaron a regar con Hoagland con Fe, aportando el Fe en forma insoluble (CI3Fe), manteniendo un control con solución de Hoagland completo con Fe soluble; se aplicaron 3 dosis de bacterias con una diferencia de 4 días entre aplicaciones. A las 2 semanas, se había revertido la clorosis, se midieron los parámetros fotosintéticos de fluorescencia (F0, Fv/Fm, PSII, NPQ) y se cosecharon las plantas. Se analizó el peso seco, pigmentos fotosintéticos, y análisis foliar de nutrientes. Se
observó un aumento en Fo, Fv/Fm y éPSR, y una disminución en la disipación energética (NPQ), junto con un aumento en pigmentos fotosintéticos (clorofila a, b y carotenos) indicando una mejora en el fitness de la planta. El análisis de nutrientes indicó un aumento en la concentración de hierro de un 25%, así como una mejora en el contenido en Zinc, y un aumento del 8,46% y 1 ,3% en el análisis de la absorción del fósforo y potasio, respectivamente.
En este mismo experimento, se ensayaron 1) P.palmensis crecida en caldo nutritivo (resultados indicados arriba), y 2) P. palmensis crecida en medio de producción de sideróforos, 3) metabolites bacterianos contenidos en el medio de cultivo responsables de la movilización de Fe insoluble (medio de sideróforos). En general, los resultados fueron similares para peso seco y pigmentos a los indicados en el párrafo anterior, destacando siempre P. palmensis. También se ensayaron todos estos tratamientos, combinados con una cepa de la especie Arthrobacter oxydans Código CECT 30231 productora de auxinas. En general, los resultados fueron similares para peso seco y pigmentos, destacando siempre P. palmensis sola; sin embargo, la combinación P. palmensis con Arthrobacter oxydans Código CECT 30231 tuvo uunn efecto sinérgico según Colby (http://www.jstor.org/stable/4041058) en la absorción de Fe, incrementando un 36.4% el contenido en Fe con respecto al control y al efecto de cada cepa de forma individual. Así mismo se observó un aumento del 1,5%, 9,7% y 9,5% en el análisis de la absorción del nitrógeno, fósforo y potasio.
APLICACION INDUSTRIAL -
Dadas las propiedades arriba apuntadas de Pseudomonas palmensis BBB001 como estimulador del metabolismo adaptativo a estrés abiótico mejorando el balance oxidativo de la planta, modulando la actividad de los enzimas relacionados con el scavenging de ROS y por su capacidad de movilizar nutrientes, concretamente hierro, nitrógeno, fósforo y potasio, esta cepa bacteriana tiene una aplicación específica en la industria agroalimentaria, química y farmacéutica, al poder ser utilizada formando parte de cualquier preparado (de forma individual o en combinación con otros microorganismos) y haciéndolas entrar en contacto (a la cepa o cualquier parte de ella) con la semilla, el sistema radical o aéreo de las plantas por cualquier medio disponible, en cualquier especie vegetal, o en cualquier forma de cultivo in vitro, para incrementar la capacidad de adaptación de la cepa a condiciones de estrés abiótico y mejorar la nutrición mineral, concretamente hierro, nitrógeno, fósforo y potasio.
Claims
1. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, microorganismo del grupo de las bacterias Gram -, género Pseudomonas, caracterizada por comprender las secuencias de nucleótidos correspondiente a la SEQ ID NO: 1 a 41.
2. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, según reivindicación 1 , caracterizada por su capacidad estimulante del metabolismo adaptativo a estrés abiótico en especies vegetales, modulando la respuesta oxidativa mediante inducción del metabolismo implicado en la eliminación de los radicales libres producidos en la situación de estrés, mejorando el crecimiento y la producción vegetal.
3. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, según reivindicación 2, caracterizada por su capacidad de aumento de la actividad de los enzimas de scavenging de ROS en especies vegetales.
4. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, según reivindicación 2, caracterizada por su capacidad de aumento de la disipación del exceso de energía fotosintética responsable de la generación de radicales libres ROS (NPQ) en especies vegetales.
5. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, según reivindicación 1, caracterizada por su capacidad estimulante de la absorción de hierro, fósforo y potasio, mejorando la nutrición mineral.
6. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, o de los sideróforos presentes en el sobrenadante del caldo de cultivo de la cepa responsables de la movilización de Fe insoluble, según reivindicaciones 1 y 2, para su aplicación en cualquier tipo de cultivo agrario o forestal, a fin de mejorar la adaptación de la planta a cualquier condición de estrés abiótico.
7. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, o de los sideróforos presentes en el sobrenadante del caldo de cultivo de la cepa responsables de la movilización de Fe insoluble, según reivindicaciones 1
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
y 2, para su aplicación en cualquier especie vegetal en condiciones de alta salinidad en suelos o en agua de riego.
8. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, según reivindicaciones 1 y 2, para su aplicación en cualquier especie vegetal, con el objeto de aumentar la producción de vegetales, como plantas tipo Arabidopsis thaliana, y de frutos de las plantas, como moras, olivas o tomates.
9. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, o de los sideróforos presentes en el sobrenadante del caldo de cultivo de la cepa responsables de la movilización de Fe insoluble, según reivindicaciones 1 y 5, para su aplicación en cualquier especie de plantas para mejorar la nutrición mineral, en hierro, fósforo y potasio.
10. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, según reivindicaciones 6 a 9, formando parte de cualquier preparado bacteriano, ya sea individualmente o en combinación con otros organismos, y por cualquier medio disponible que ponga la bacteria en contacto con la semilla, el sistema radical o aéreo de las plantas.
11. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas palmensis con número de depósito CECT 30222, según reivindicación 10, en combinación con Pseudomonas fíuorescens (CECT 9015), o formando parte de cualquier preparado con Pseudomonas fluorescens (CECT 9015), para mejorar la respuesta a estrés salino.
12. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas paknensis con número de depósito CECT 30222, según reivindicación 10, en combinación con Arthrobacter oxydans (CECT 30231), o formando parte de cualquier preparado con Arthrobacter oxydans (CECT 30231), para mejorar la nutrición mineral en hierro, nitrógeno, fósforo y potasio, tanto en agricultura ecológica como convencional.
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
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