ES2269004B2 - Uso de arthrobacter oxidans bb1 como protector frente a estres salino. - Google Patents
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Classifications
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
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Abstract
Cepa bacteriana Arthrobacter oxidans BB1 (CECT 7170), microorganismo del grupo de las bacterias Gram +, genero Arthrobacter, estimulante del metabolismo secundario y el crecimiento vegetal y protector frente a patógenos y estrés salino. Esta cepa ha sido aislada a partir de la rizosfera de Pinus pinaster Aiton y Pinus pinea (L.), y de la micosfera del hongo micorrizógeno asociado a ambos Lactarius deliciosus (Fries) S.F. Gray, en agar nutritivo (PCA), y ha sido caracterizada desde el punto de vista morfológico, bioquímico y genético. Puede ser utilizada con objeto de incrementar el crecimiento y vigor de plantas cultivables, tanto herbáceas como hortícolas, así como con fines fitosanitarios frente al ataque de agentes biológicos patógenos y frente a situaciones de estrés hídrico-salinas, y también con fines farmacológicos, al inducir la síntesis de moléculas del metabolismo secundario en plantas con esa aplicación.
Description
Uso de Arthrobacter oxidans BB1 como
protector frente a estrés salino.
La presente invención se refiere al uso de una
cepa de Arthrobacter oxidans (BB1, código interno del
laboratorio) en el tratamiento de plantas cultivables con el objeto
de incrementar su crecimiento y vigor en ambientes de estrés
salino.
Esta cepa ha sido depositada con fines de
patente en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT;, con fecha
18 de mayo de 2006, donde se le ha asignado el número 7170. La
CECT tiene su sede en el edificio de investigación de la
Universidad de Valencia, sito en el campus de Burjassot (DP 46100 -
Valencia, España).
La invención se encuadra dentro de los campos de
la biotecnología y la química fitosanitaria, al disponer de una
cepa bacteriana que puede servir de base para la preparación de
diferentes tipos de productos para el tratamiento de las plantas
cultivables en medios con indeseable grado de salinidad, a fin de
potenciar su crecimiento vegetal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mecanismos de acción de las bacterias
promotoras del crecimiento vegetal, se pueden resumir en dos:
directos, cuando los metabolitos producidos alteran el metabolismo
de la planta (actividad hormonal, estimulación de los mecanismos
defensivos..), e indirectos, cuando sintetizan compuestos que
facilitan la captación o movilización de nutrientes o evitan el
crecimiento de microorganismos patógenos sobre la planta, sin
alterar el metabolismo de la
planta.
planta.
Arthrobacter oxidans pertenece al grupo
de las bacterias Gram +, no esporulados. El género
Arthrobacter es común entre bacterias del suelo y son
aerobios obligados (Conn and Dimmick 1947 (Approved Lists 1980)
emend. Koch et al. 1995), quedando incluido en él la especie que se
describe en esta memoria. Siguiendo la taxonomía del Manual
Bergeys, edición marzo de 2001, esta bacteria se encuadra dentro
del Dominio Bacteria, Phylum Actinobacteria phy. nov, Clase
Actinobacteria, Subclase Actinobacteridae, Orden Actinomycetales,
Suborden Micrococcineae, Familia Micrococcaceae. El género
Arthrobacter es muy común en el sistema edáfico, y se ha
descrito en repetidas ocasiones como rizobacteria promotora del
crecimiento vegetal. Los efectos de esta cepa sobre la fisiología
de la planta de la que se aisló y sobre otras plantas, indican que
si bien no son mayoritarias en número, la planta las selecciona en
su beneficio.
Realizando una búsqueda retrospectiva de
patentes a nivel mundial en la base de datos Worlwide, a través del
sistema Esp@cenet, no se ha encontrado ningún documento relativo a
la especie bacteriana Arthrobacter oxidans como estimulante
del crecimiento vegetal, como protectora frente a patógenos o
estrés salino. Sólo se han encontrado una serie de documentos de
patentes derivados de cuatro invenciones que hacen referencia a
cepas de Arthrobacter oxidans, pero como fuente de obtención
de diverso tipos de enzimas que son utilizados con diferentes
fines.
Una de estas invenciones es la del profesor
Pohlenz Hans-Dieter (patentes US5948670, US5846803
y US5543306) que tiene por objeto un proceso para el aislamiento y
caracterización de un sistema enzimático genético para la
inactivación del herbicida phenmedipham, en donde la enzima es una
carbamata hidrolasa de una cepa de Arthrobacter oxidans, que
es responsable de la ruptura del enlace de la carbamata entre los
anillos de benceno del phenmedipham. Otra invención es la de Sakai
Takeshi y Usui Kanako (patente japonesa JP4304883), cuyo objetivo
es obtener un enzima útil para la determinación cuantitativa de
L-fucosa en una escala industrial a bajo costo, a
partir de un cultivo de una cepa microbiana del género
Arthrobacter, como por ejemplo Arthrobacter oxidans F1 (FERM
BP-3674). Las otras dos invenciones, protegidas por
las patentes JP1108982 y JP1108980, están en la misma línea que las
anteriores, es decir, si bien utilizan un cultivo de
Arthrobacter oxidans, lo hacen con la finalidad de aislar y
caracterizar a partir del mismo un enzima para ser utilizada con
objetivo distinto al de potenciación del crecimiento
vegetal.
vegetal.
En cuanto a la literatura no patente, se ha
constatado que el único trabajo publicado relativo a la especie
bacteriana Arthrobacter oxidans como estimulante del
crecimiento vegetal es un artículo del propio equipo inventor:
BARRIUSO, J. et al. Screening for putative PGR to improbé
establishment of the symbiosis Lactarius
deliciosus-Pinus sp. Microbial ecology, 2005, vol.
50, páginas 82-89, tabla 3.
Este artículo tiene por objeto el aislamiento y
caracterización de bacterias (rizobacterias) precursoras del
crecimiento vegetal a partir de la micrcrrizosfera y micosfera
asociada de dos especies del género Pinus, siendo una de estas
bacterias el Arthrobacter oxidans, caracterizado por su
actividad productora de auxinas y sideróforos (véase la tabla 3,
pag. 88), que es donde radica su capacidad de incrementar el vigor
y crecimiento de plantas leñosas y herbáceas.
Sin embargo, con la presente invención se han
descubierto y desarrollado un nuevo uso a la referida cepa
bacteriana, previamente aislada y caracterizada por el inventor,
que se pasa a exponer a continuación.
El objeto de la invención que aquí se describe y
que, a la vista del estado de la técnica anterior, se entiende
cumple con las condiciones de novedad y actividad inventiva
necesarias para poder ser patentada, es el uso de la cepa
bacteriana Arthrobacter oxidans BB1 (CECT 7170), que es un
microorganismo del grupo de las bacterias Gram +, género
Arthrobacter, a los efectos de promover el crecimiento vegetal en
medios con un indeseado grado de salinidad, protegiendo a las
plantas leñosas y herbáceas frente a situaciones de estrés
hídrico-salino.
Las características fisiológicas y el análisis
genético de esta cepa permite identificarla inequívocamente, no
sólo de otras especies del genero Arthrobacter, sino también de
otras cepas de la misma especie, como las utilizadas en las
invenciones anteriores para otros fines.
Es sabido que, una vez aislada y caracterizada,
Arthrobacter oxidans BB1 presenta una actividad bioquímica
indicadora de su potencial capacidad de promoción del crecimiento
vegetal, como la producción de auxinas (6.28 ppm, cuando crece en
caldo nutritivo deurante 24h a 28ºC) y la producción de
sideróforos, lo que hace que la cepa tenga la capacidad de
estimular el crecimiento vegetal, incrementando el vigor y
desarrollo de las plantas. Lo que se ha demostrado ahora es que
Arthrobacter oxidans BB1 presenta también la capacidad de
inducir una respuesta metabólica defensiva en las plantas
inoculadas, que las protege frente a situaciones de estrés
hícrico-salinos, además de frente al ataque de
agentes biológicos patógenos.
Por tanto, la ventaja técnica aportada con esta
invención es el disponer de la bacteria Arthrobacter oxidans
BB1 en el tratamiento de diversas especies de plantas cultivables,
leñosas y herbáceas, con el objeto de incrementar su resistencia al
estrés salino, haciendo entrar en contacto por cualquier medio
disponible a dicha bacteria con la planta.
En consecuencia, con la presente solicitud de
patente se reivindica el uso de la cepa Arthrobacter oxidans
BB1, o cualquier fracción de la misma, con el fin de ser aplicado
a cualquier tipo de cultivo agrario o forestal, formando parte de
cualquier preparado, ya sea individualmente o en combinación con
otros organismos, para incrementar la producción vegetal, en
ambientes de estrés hídrico-salino, mejorando la
adaptación de las plantas a estos medios.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudiando la rizosfera y micosfera asociada de
dos especies del género Pinus, seleccionadas por su interés
forestal, encontramos la cepa del género Arthrobacter que
aquí se reseña.
La cepa fue aislada de la rizosfera de una
población natural de Pinus pinea L. Durante el aislamiento
de bacterias llevado a cabo en la rizosfera de dos especies de
pino (Pinus pinaster Aiton y Pinus pinea L.) y en la
micosfera del hongo micorrizógeno asociado a ambos, Lactarius
deliciosus (Fries) S.F. Gray., en otoño de 2000, coincidiendo
con el periodo de fructificación de Lactarius deliciosus, en la
sierra de Aracena (Huelva). Como resultado de dicho muestreo se
coleccionaron 720 cepas entre las que se encontró Arthrobacter
oxidans (BB1, código interno del laboratorio). El aislamiento
de dicha cepa se realizó en agar nutritivo (PCA).
En el laboratorio este microorganismo se
mantiene con una elevada tasa de supervivencia en glicerol al 20%
en caldo nutritivo (Pronadisa) a -80ºC o en glicerol al 15% en
agua a -20ºC y se recuperan con facilidad en el medio de cultivo
utilizado para el aislamiento tanto en fase sólida como en fase
liquida a 28ºC.
Para la caracterización de las cepas se
consideraron diferentes caracteres fenotípicos que se pormenorizan
en esta memoria: (i) morfología de las colonias (ii) morfología de
las células, (iii) perfil de ácidos grasos de la membrana (FAMES) y
(iv) secuenciación del gen completo del ADN ribosomal
correspondiente a la subunidad 16S.
\vskip1.000000\baselineskip
La caracterización taxonómica de Arthrobacter
oxidans se realizó en base al perfil de ácidos grasos (FAMEs) y
comparación de este con la base de datos del sistema de
identificación microbiana MIDI (Sherlock Microbial Identification
System, Newark, Ltd, USA), de acuerdo con este test, BB1 es muy
similar a Arthrobacter oxidans con un índice de 0.691. A
continuación, se identificó la cepa mediante secuenciación del ADN
ribosomal 16S, su comparación con las secuencias existentes en las
bases de datos reveló una homología del 98% con una cepa de
Arthrobacter oxidans.
A continuación se especifica la morfología de
las colonias a las 24 h de incubación a 28º en agar para métodos
estándar (PCA).
| BB1 | |
| Tamaño de la colonia | < 1 mm\diameter |
| Forma | circular |
| Borde | Liso |
| Transparencia | No |
| Consistencia | Cremosa |
| Color | Amarillo pálido |
Creciendo en medio líquido (Caldo nutritivo
Pronadisa) el color del medio cambia a amarillo desde la fase
exponencial de crecimiento a la fase estacionaria de
crecimiento.
Los caracteres morfológicos de Arthrobacter
oxidans BB1 a las 24 h de incubación a 28º en agar para métodos
estándar (PCA) corresponden a una corinabacteria, pleomórfica
bacilo-coco y de Gram variable.
Se realizó un análisis de Ácidos grasos (Fatty
Acid Methyl Esters, FAMEs) a fin de establecer su perfil lipídico
de membrana. Para ello se siguió el protocolo establecido por el
sistema de identificación microbiana MIDI (Sherlock Microbial
Identification System, Newark, Ltd, USA), con el objeto de poder
comparar los resultados con la base de datos de dicha compañía.
| RT | FAME | % |
| 2.045 | i14:0 | 3.24 |
| 2.125 | 14:w5c | 0.32 |
| 2.149 | 14:0 | 2.36 |
| 2.298 | 14:013:0 3OH / i15:1 H | 0.65 |
| 2.337 | i15:0 | 12.09 |
| 2.364 | a15:0 | 47.13 |
| 2.409 | 15:1 w6c | 1.17 |
| 2.447 | 15:0 | 0.88 |
| 2.594 | I16:1 H | 4.82 |
| 2.641 | i16:0 | 7.76 |
| 2.703 | 16:1 w7c/16:1 w6c | 6.83 |
| 2.754 | 16:0 | 2.59 |
| 2.890 | i17:1 w9c | 0.74 |
| 2.925 | a17:1 w9c | 3.48 |
| 2.951 | i17:0 | 0.45 |
| 2.981 | a17:0 | 3.46 |
| 3.006 | 17:1 w8c | 0.27 |
| 3.325 | 18:1 w7c | 1.74 |
Nomenclatura PLFAs: número total de átomos de
carbono: número de dobles enlaces, seguido de la posición de doble
enlace respecto al metilo terminal (w) de la molécula. Las
configuraciones cis y trans se indican con las letras c y t
respectivamente. Los prefijos a e i, indican ramificación en
anteiso e iso respectivamente. El número delante del grupo OH
indica la posición de éste con respecto al grupo carboxilo.
A continuación, se procedió al análisis genético
de la cepa para su identificación, para ellos se siguieron los
siguientes pasos:
Para la extracción del ADN, las colonias
crecieron durante 24 horas en caldo nutritivo (Pronadisa) a 28ºC en
agitación. Transcurrido este tiempo, Se extrajo el ADN genómico de
cada bacteria con el kit Ultraclean^{TM} Microbial DNA isolation
(MoBio, CA, EE.UU.), según las indicaciones del fabricante.
Se amplificaron mediante PCR los 1500 pb
correspondientes a esta región con los siguientes cebadores:
directo 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC
AG-3' y reverso 5'-AAG GAG GTG ATC
CAG CCG CA-3' (Devereux y Willis, 1995), en una
reacción de 50 mL con 10 mM TrisHCl pH 8,3, 4 mM MgCl2, 50 mM ClK,
0,01% gelatina, 200 mM de cada DNTP, 1,875 unidades de ADN
polimerasa (Roche Expand HighFidelityTM PCR system) y 100 ng de ADN
bacteriano. La amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp
2700 (Applied Biosystems) con las siguientes condiciones: 95ºC 5
minutos, seguido de 25 ciclos de 94ºC 30 segundos, 65,5ºC 30
segundos y 72ºC 30 segundos, finalizando con 7 minutos a 72ºC.
Los productos de PCR se resolvieron en gel de
agarosa al 1% (p/v) en tampón
Tris-Acetato-EDTA (TAE 1') con
bromuro de etidio (0,5 mg/mL) y se visualizaron en un analizador de
imagen GelDoc2000TM 170-8126 (Biorad, CA,
EE.UU).
Una vez comprobada la amplificación, los
productos de PCR, se purificaron con el kit UltraClean^{TM} PCR
Clean-up DNA purification (MoBio, CA, EE.UU.), y la
secuenciación se realizó en el Servicio de Secuenciación de la
Facultad de Farmacia (Universidad Complutense de Madrid) y en
Sistemas Genómicos S.L. (Valencia, España). La secuenciación se
llevó a cabo en los aparatos DNA Analyzer 3730 (Applied Biosystems)
y ABI PRISM® 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems),
respectivamente. Se utilizaron los mismos cebadores empleados en la
amplificación y un cebador intermedio directo
(5'-CGG CTA ACT NCG TGC CAG CAG-3')
diseñado específicamente por nosotros (Oligos\tilde{a} v.9.9.11.)
para poder secuenciar la zona interna del ADNr 16S desde la base
500 hasta la 1000.
El ensamblaje y alineamiento de las secuencias
se realizó con el programa Bioedit Secquence Alignment editor
5.0.3. (Tom Hall\tilde{a}, 1997-2001) mediante
Contig Assembly Program (Xiaoqui Huang\tilde{a}, 1991) y Clustalw
1.4 respectivamente. Posteriormente se compararon en el GeneBank
por BLASTN 2.2.6 (Altschul et al., 1997) en las bases de
datos del GeneBank, el EMBL y el DDBJ (NCBI BLASTR Home page. Basic
Local Alignement Search Tool) estableciendo el grado de homología
de la cepa con las presentes en las base de datos. Resultando la
mayor homología: Arthrobacter oxydans (X83408)
(Reclasificación de Micrococcus agilis al género
Arthrobacter), y quedando depositada la secuencia en el GeneBank
con el número de acceso AY307363.
Una vez aisladas y caracterizadas, a las cepas
de Arthrobacter oxidans se le practicaron diversas pruebas
para poner de manifiesto actividades bioquímicas indicadoras de su
potencial capacidad de promoción del crecimiento vegetal. Estas
fueron, producción de auxinas, degradación de
1-aminociclopropano-1-carboxilato,
solubilización de fosfato y producción de sideróforos. Resultando
positiva para la producción de auxinas (6.28 ppm) cuando crece en
caldo nutritivo (Pronadisa) y la producción de sideróforos.
Hasta el momento se han realizado experiencias
consistentes en la inoculación de suspensiones bacterianas de
Arthrobacter en las raíces de la planta de la que se aisló
(Pinus pinea). En estos experimentos se ha detectado un
notable aumento de la biomasa, un mayor vigor en las plantas
tratadas y una mayor micorrización. Así mismo se ha ensayado la
inoculación directa de la cepa en planta modelo (Arabidopsis
thaliana) donde ha inducido un efecto de resistencia sistémica
frente a infecciones por bacterias y una protección en situaciones
de estrés salino. También se ha inducido la síntesis de metabolitos
secundarios en plantas de Hypericum perforatum aplicando
lipopolisacáridos de esta bacteria.
1º. En los primeros experimentos realizados, se
inocularon plántulas de Pinus pinea L., crecidas en turba
rubia (Kekkila S.L) sin esterilizar durante 4 meses, con la cepa de
Arthrobacter oxidans BB1 a razón de 10^{7} bacterias/ml de
sustrato en el medio líquido de crecimiento. Las plántulas se
mantuvieron en vivero durante todo el experimento con riego
mediante microaspersión en pivotes. Tras 7 meses se recolectaron
las plantas y una vez secas se midió altura de la parte aérea,
diámetro del cuello, peso seco de la parte aérea y peso seco de la
raíz. Los resultados indicaron una mejora en el crecimiento de la
planta reflejados en un aumento del 19% de la altura de la parte
aérea, un 7% en el diámetro del cuello, del 24% en el peso seco de
la parte aérea y un 17% en el peso seco de la raíz, con respecto a
las plantas control inoculadas con medio nutritivo. Así mismo se
estudió la perturbación producida en las comunidades microbianas
rizosféricas mediante análisis de PLFAs.
2º. Plantulas de Pinus pinea L. de dos
semanas, pregerminadas en bandejas de vermiculita, se trasplantaron
a macetas de 2 litros de volumen utilizando como substrato tierra
de pinar de la Urbanización Montepríncipe (Boadilla del Monte,
Madrid). La inoculación se realizó previamente al transplante, las
raíces de los pinos pregerminados se sumergieron durante una hora
en una solución bacteriana de 108 bacterias/ml,. Una vez
transplantados los pinos, se inocularon mediante pipeteo a razón de
107 bacterias/g de sustrato; a las plantas control se les aplicó el
mismo volumen de tampón SO_{4} Mg 10 mM. Las plantas se
mantuvieron en invernadero con condiciones de agua, luz,
temperatura y humedad controladas durante 3 meses. Transcurrido
este periodo se trasladaron a parcelas de experimentación con
riego controlado y condiciones de luz, temperatura y humedad
ambientales. La toma de muestras de estas plantas se realizó
transcurridos 5 meses desde su germinación y se analizó el número
de puntas radicales totales y el número de puntas radicales
micorrizadas. Para determinar el grado de micorrización de las
plantas. Los resultados obtenidos demostraron un claro efecto
activador del crecimiento de la parte radical, contándose en las
plantas tratadas hasta un 69,5% más de puntas radicales que en las
plantas control, así como un 145% más de puntas radicales
micorrizadas.
1º. Experimento de inducción de resistencia
sistémica.- Para comprobar el efecto de protección de la cepa de
Arthrobacter oxidans frente a patógenos y estrés salino, se
inocularon plántulas de Arabidopsis thaliana con la cepa de
Arthrobacter oxidans a razón de 108 bacterias/ml de
sustrato, por 2 veces, una en el momento del transplante y otra
transcurridas 3 semanas. El sustrato empleado fue
turba-arena (2:1). Transcurrida una semana desde la
última inoculación, se sumergieron las hojas de cada planta en una
solución de la bacteria patógena Pseudomonas syringae DC3000
a una concentración de 107 bacterias/ml y se mantuvieron las
plántulas durante 24 horas con una humedad relativa de un 100%,
para comprobar el efecto sobre la patogenicidad. Para comprobar el
efecto frente al estrés salino se añadió cloruro sódico en el
sustrato hasta una concentración equivalente a una solución salina
50 mM. Tras dos semanas se contabilizaron el número de lesiones
producidas en las hojas por la bacteria o el número de hojas
cloróticas provocadas por la sal. Las plantas inoculadas con
Arthrobacter oxidans tenían un 52,3% menos lesiones
producidas por el patógeno que las plantas control no inoculadas,
así como las plantas inoculadas con Arthrobacter oxidans
tenían un 57,8% menos de hojas cloróticas producidas por el efecto
de la sal que las plantas control no inoculadas, lo que prueba la
inducción de resistencia sistémica en la planta. En estos
experimentos se demuestra la capacidad de esta cepa para inducir
una respuesta metabólica defensiva, lo que permite desarrollar una
estrategia para la defensa de la planta antes de que se produzca el
ataque del patógeno y una mejor defensa frente al estrés
hídrico-salino.
Dadas las propiedades arriba apuntadas de
Arthrobacter oxidans BB1 como promotor del crecimiento
vegetal en medios salinos, las cepas de esta bacteria tienen una
aplicación específica en la industria agropecuaria y farmacéutica,
al poder ser utilizadas, formando parte de cualquier preparado (de
forma individual o en combinación con otros microorganismos) y
haciéndolas entrar en contacto con el sistema radical o aéreo de
las plantas por cualquier medio disponible, en todo tipo de cultivo
agrario o forestal o cultivo in vitro, para incrementar la
producción vegetal frente al estrés
hídrico-salino.
Claims (1)
1. Uso de Arthrobacter oxidans BB1 (CECT
7170), microorganismo del grupo de las bacterias Gram +, género
Arthrobacter, para su aplicación en cualquier tipo de cultivo
agrario o forestal, con el fin de protegerlo frente a situaciones
de estrés hídrico-salino, al inducir una respuesta
metabólica defensiva en las plantas inoculadas.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200601909A ES2269004B2 (es) | 2006-07-18 | 2006-07-18 | Uso de arthrobacter oxidans bb1 como protector frente a estres salino. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200601909A ES2269004B2 (es) | 2006-07-18 | 2006-07-18 | Uso de arthrobacter oxidans bb1 como protector frente a estres salino. |
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| ES2269004A1 ES2269004A1 (es) | 2007-03-16 |
| ES2269004B2 true ES2269004B2 (es) | 2008-05-16 |
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| ES2902976B2 (es) * | 2021-09-21 | 2022-09-29 | Biobab R&D S L | Pseudomonas atacamensis CECT 30419 mejoradora de la producción vegetal y estimulante del metabolismo secundario de plantas. |
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2006
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| ES2269004A1 (es) | 2007-03-16 |
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