JP4955431B2

JP4955431B2 - 根粒菌

Info

Publication number: JP4955431B2
Application number: JP2007068007A
Authority: JP
Inventors: 孝佐藤; さゆり善本; 吉弘金田; 敦佐藤
Original assignee: Akita Prefectural University
Current assignee: Akita Prefectural University
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2027-03-16
Also published as: JP2008228572A

Description

本発明は、新規な微生物及びその利用方法に関するものであり、特に有機農法に用いられる植物であるヘアリーベッチの生育を促進する根粒菌に関する。

有機農業では、従来の無機的な化学合成肥料の代わりに、緑肥（りょくひ）がよく用いられる。緑肥とは、栽培する植物のために、別の植物を栽培して収穫しないで田畑に鋤き込み肥料にすることを言う。すなわち、休閑畑や収穫後の田畑に、緑肥となる作物を植えて生育させ鋤き込むことで、後に播種し栽培する植物の肥料とすることができる。
この緑肥用の植物として、ヘアリーベッチ（ＶｉｃｉａｖｉｌｌｏｓａＲｏｔｈ）が注目されている。ヘアリーベッチは、マメ科ソラマメ属に属する越冬が可能な越年草で、日本名はビロードクサフジ、ナヨクサフジと言う。ヘアリーベッチは、表土の被覆力が強く、栽培には土壌をほとんど選ばず、耐寒・耐雪性に優れているという特徴があるため、緑肥用の植物として世界各地で栽培され、又は野生化している。

また、ヘアリーベッチは、アレロパシー作用（他感作用）も持っている。
アレロパシー作用とは、Ｍｏｌｉｓｃｈにより１９３７年に提唱された、植物相互間の生化学的な関わり合いであり、ある一種の植物が生産する化学物質が環境に放出されることによって、他植物に直接又は間接的に与える作用を指している。この作用として、植物の生育を阻害する場合がある。
アレロパシー作用をもつ植物を緑肥として使用すると、鋤き込まれた後もアレロパシー作用に関する物質が残留するため、次の栽培する作物を植える農作地の雑草を抑制することができる。つまり、ヘアリーベッチを緑肥に使用すると、雑草を抑制できるため農薬の使用を減らすことができるという優れた特性がある。

加えて、ヘアリーベッチは、マメ科植物であるので、土壌微生物である根粒菌との共生器官である根粒を根に形成し、大気中の窒素を固定する共生窒素固定を行う。この共生窒素固定で行われる窒素固定は、年間１０〜２０Ｎ−ｋｇ／１０ａもあるため、緑肥として用いると効果が高い。
緑肥としてヘアリーベッチを作付けする場合、土壌中にヘアリーベッチに親和性が高い根粒菌が少ない場合や、窒素固定活性が低い根粒菌が多い場合は、適切な根粒菌の接種が必要となる。

マメ科植物に根粒を形成する根粒菌としては、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌等が知られている。
これらの根粒菌は接種資材として市販されており、マメ科作物やマメ科牧草の栽培に利用されている（以下、これを従来技術１とする。）。
特開２００３−０７９２４０号公報

しかし、従来技術１の根粒菌は、大豆などの作物用の根粒菌であって、ヘアリーベッチに適用しても、根粒は形成されないし、ヘアリーベッチ用の根粒菌は流通していないという問題点があった。
さらに、ヘアリーベッチは低温（１５℃以下）になると根の窒素吸収活性が低下する。この場合、生育に必要な窒素源を根粒の窒素固定に大きく依存しているため、低温条件下で窒素固定能力が低い根粒菌が感染した根粒では、ヘアリーベッチは窒素欠乏になり、全体が赤みを帯び、やがて枯死していた。
したがって、低温条件下でも共生窒素固定活性が高い低温耐性ヘアリーベッチ根粒菌株が必要とされていた。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。

本発明の根粒菌は、ヘアリーベッチから単離された根粒菌であって、接種により低温条件下でもヘアリーベッチが健全に生長できる共生窒素固定活性を持つ、ヘアリーベッチ根粒菌（リゾビウム・レグミノサラム・ビーブイ・ビシアエ）Ｙ６２９株（ＮＩＴＥＡＰ−３２３）であることを特徴とする。
本発明の根粒菌は、前記共生窒素固定活性は、昼間１５℃夜７℃において０．３μｍｏｌ／植物・時間以上に維持されることを特徴とする。
本発明の根粒菌は、前記低温条件下においても、昼間２２℃夜１８℃の高温条件下の５割以上の共生窒素固定能力が保たれることを特徴とする。
本発明の根粒菌は、前記根粒菌は、前記低温条件下にヘアリーベッチの根の窒素吸収活性が低下する際でも窒素栄養状態を正常に保つことを特徴とする。

本発明によれば、低温条件下でも共生窒素固定活性が高いヘアリーベッチ根粒菌株を提供することができる。

＜実施の形態＞
本発明の発明者は、鋭意研究を行った結果、低温条件下でも高い窒素固定活性を有するヘアリーベッチ根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍｂｖ．ｖｉｃｉａｅ、リゾビウム・レグミノサラム・ビーブイ・ビシアエ）を土壌から分離し、このヘアリーベッチ根粒菌株をヘアリーベッチ種子に接種することにより、低温条件下（１５℃以下）でも高い窒素固定活性を持つ根粒を形成させることができることを見いだした。
なお、本発明においては、低温条件又は低温条件下とは、日中の平均気温が１５℃で、夜間の平均温度が７℃の環境のことを言う。

上記ヘアリーベッチ根粒菌の分離方法としては、圃場に生育しているヘアリーベッチから分離する。ヘアリーベッチは、土壌から根粒内にヘアリーベッチ根粒菌を取り込んでいるためである。ここでは、粒径が大きく、内部が赤色を呈している根粒を採取する。
ここで根粒の表面を殺菌した後、内部組織液をＹＭ（酵母エキス−マンニトール）寒天培地に塗末し、好気条件下、３０℃で７日間培養する。この培地としては、同業者が使用する細菌培養用の培地ならどのようなものでも使用することができる。得られたコロニーである菌株をＹＭ液体培地に投入し、好気条件下、３０℃で７日間振とう培養して増殖させる。
上述のＹＭ液体培地の組成は以下の表１の通りである。水としては、蒸留水又はイオン交換水を使用するのが望ましい。

このＹＭ液体培地は、そのまま使用すると液体培地となり、１．５％（ｗ／ｖ）のアガーを加えるとＹＭ寒天培地として使用可能である。

次に、培養した菌株をヘアリーベッチに接種して、無窒素培地で１４日間培養する。ここで、ヘアリーベッチに根粒形成が確認された菌株をヘアリーベッチ根粒菌と判定する。根粒が形成されたヘアリーベッチを１５℃で１４日間栽培し、アセチレン還元法により窒素固定活性を測定する。この上で、１５℃でもっとも高い窒素固定活性を示すヘアリーベッチ根粒菌株の１つであるＹ６２９株を得た。

このようにして得られたヘアリーベッチ根粒菌株Ｙ６２９株は、２００７年２月２３日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、その受領番号はＮＩＴＥＡＰ−３２３である。
以下の実施例で、低温条件下でも高い窒素固定活性を有するヘアリーベッチ根粒菌の同定方法と、このヘアリーベッチ根粒菌株Ｙ６２９株の科学的性質についてさらに詳しく説明する。

＜実施例１＞
（ヘアリーベッチ根粒菌の分離）
ヘアリーベッチの最大繁茂期にあたる２００４年６月２９日に、秋田県大潟村の水田土壌である圃場に生育しているヘアリーベッチの根から根粒を採取し、ヘアリーベッチ根粒菌を分離した。図１を参照して説明すると、分離は下記の手順で行った。
１．ヘアリーベッチから根粒を採取し、水道水でよく洗浄した。
２．根粒表面を９５％エタノールで１０秒間殺菌した。
３．０．１％次亜塩素酸で４分間殺菌した。
４．速やかに滅菌蒸留水で繰り返し５回洗浄し、次亜塩素酸を十分に洗い流した。
６．根粒を輪切りにし、根粒内部の赤い部分を白金耳で触れ、根粒菌をＹＭＡ＋ＢＴＢ平面培地に面線接種した。
７．３０℃、暗条件のインキュベーター内で一週間培養した。
８．根粒菌の単一コロニーを取り、新しいＹＭＡ培地に移し変えた。

上述のＹＭＡ＋ＢＴＢ培地は、マンニトール（Ｃ₆Ｈ₁₄Ｏ₆）１０ｇ、リン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物（ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）０．２ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）０．１ｇ、酵母エキス（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ）１ｇを蒸留水１Ｌに溶かし、０．１Ｎ−ＨＣｌでｐＨ６．８に調整し、寒天１５ｇ及び０．５ｇ／１００ｍＬＢＴＢ（ＢｒｏｍｔｈｙｍｏｌＢｌｕｅ）溶液を５ｍＬを加え、オートクレーブで滅菌して使用した。

（分離根粒菌の同定）
分離した根粒菌の全ゲノムＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（プロメガ社製、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ）を用いて、抽出した。
１６ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたユニバーサルプライマーを用いて、分離した根粒菌の１６ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子のほぼ全塩基配列をＰＣＲ増幅した。このユニバーサルプライマーは、学術誌（Ｗｅｉｓｂｕｒｇ，Ｗ．Ｇ．，Ｂａｒｎｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｄ．Ａ．＆Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｊ．（１９９１）．１６ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓｔｕｄｙ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１７３，６９７−７０３）に記載の配列を使用した。
ＰＣＲ反応にはＰＣＲ用混合液（プロメガ社製、ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）を使用した。このＰＣＲ用混合液の組成は、１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ、２００μｍｏｌ／ＬｄｎＴＰ、０．６２５ＵＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ等でｐＨ８．５である。
図２を参照して説明すると、ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ用混合液１２．５μＬ、１０μＭプライマー各１．５μＬ、ＤＮＡ抽出液（３０ｎｇ／μＬ）１．０μＬ、Ｎ−ＦＷａｔｅｒ８．５μＬを混合して、図２に記載の条件でＰＣＲ反応を行った。
このＰＣＲ反応によって生成されたＰＣＲ産物をマイクロチップ電気泳動装置（Ａｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ社製、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒＤＮＡ７５００Ａｓｓｙ）により電気泳動を行い、増幅の確認と塩基数を調べた。

次に、ＰＣＲ産物はプロメガ社製、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ｕｐＳｙｓｔｅｍにより精製後秋田県立大学生命科学研究支援センターのＤＮＡシークエンス解析により塩基配列を決定した。この配列を、配列表にて示す。
その後、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）の配列相同性検索ソフトであるＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｂｌａｓｔ−ｊ．ｈｔｍｌ）により、塩基配列の相同性検索を行ったところ、９８％の相同性があった。これにより、菌の種類をヘアリーベッチ根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍｂｖ．ｖｉｃｉａｅ、リゾビウム・レグミノサラム・ビーブイ・ビシアエ）と同定した。
なお、この同定法は、１６ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の全領域の解読結果から同定しているので信頼性が高く、微生物の系統と種類を十分に特定できる。
このヘアリーベッチ根粒菌株を、ヘアリーベッチ根粒菌Ｙ６２９株と命名した。以下の表２を参照して、ヘアリーベッチ根粒菌Ｙ６２９株の菌学的性質を述べる。

表２に示したように、ヘアリーベッチ根粒菌Ｙ６２９株は、ヘアリーベッチ根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）である。この菌はグラム陰性の桿菌で、大きさは１〜３μｍ。ＹＭ液体培地中で、一般的なＲｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ属と同様の増殖速度を示す。ＹＭ寒天培地上では表面が滑らかな白色・球状のコロニーを形成する。また、ＹＭ寒天培地上で酸を生成し、コンゴレッド含有培地では色素を吸収して赤色のコロニーを形成する。ｐＨ５．５以上・１５℃〜３５℃で増殖が可能である。単生条件ではインドール酢酸、硫化水素の産生は認められない。
さらに、Ｙ６２９株はヘアリーベッチと親和性が高く、根粒を形成して共生窒素固定する。また、共生状態において低温条件下（１５℃）でも高い窒素固定活性を有する。その他の性質については、一般的なヘアリーベッチ根粒菌の性質と相同である。
根粒菌の場合は、特定の宿主植物（ヘアリーベッチ）に目的の菌株を接種して、根粒が形成されれば間違いなく根粒菌であり、他の菌より簡易に同定が可能である。以下で、根粒が間違いなく形成されていることと、Ｙ６２９株の優れた性質について実験を基に説明する。

（ポット栽培によるヘアリーベッチ根粒菌接種試験）
［栽培条件］
図３を参照して、ポット栽培によるヘアリーベッチ根粒菌接種試験について説明する。
まず、分離したヘアリーベッチ根粒菌の窒素固定能力を調べるため、ポットによる接種試験を行った。栽培土は一般的なバーミキュライトを水でよく洗浄し、培養液を含ませた後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。
処理区として、ヘアリーベッチ根粒菌Ｙ６２９株を接種したＹ６２９株接種区と、大潟村の水田土壌１００ｇを蒸留水１０００ｍＬとよく混合した土壌懸濁液を接種した土着根粒菌区を設定した。

具体的な接種方法としては、Ｙ６２９株接種区においては、Ｙ６２９株をＹＭ液体培地１０００ｍＬにて３０℃で５日間、振とう培養し、ＯＤ（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ、光学濃度）６２０ｎｍ＝１．４となった状態で、ピートモス・パーミキュライト５ｋｇに振りかけた。このピートモス・パーミキュライト５００ｇを、ヘアリーベッチ種子２０ｋｇとよく混ぜ合わせ、接種した。
土着根粒菌区においては、上述の土壌懸濁液１００ｍＬをそのまま、ヘアリーベッチ種子とよく混ぜ合わせ、接種した。

栽培は統計処理のため、４反復で行った。ヘアリーベッチは種子殺菌した後、１ポットあたり４粒ずつ播種し、発芽後（一週間後）２株とした。栽培条件として昼２２℃、夜１８℃の高温条件および、昼１５℃、夜７℃の低温条件を設けた。
光条件は高温条件、低温条件ともに、明期は照度２５０００ｌｘ（ルクス）で１２時間、暗期は照度０ｌｘで１２時間とした。

上述の種子殺菌は、７０％エタノールに浸して１０秒間表面殺菌し、水でエタノールをよく洗い流した。次に０．５％次亜塩素酸ナトリウムに３分間浸した後、水でよく洗浄流水し、次亜塩素酸ナトリウムを完全に除去することで行った。

ヘアリーベッチは播種２週間後に高温処理、低温処理を開始し、さらに２週間栽培した。栽培期間中は窒素以外の栄養塩類を補うため、無窒素培養液を適宜与えた。以上の条件で栽培した後、ヘアリーベッチの根粒着生数を計数し、感染した根粒菌の窒素固定活性を、アセチレン還元法を用いて評価した。
上述の無窒素培養液の組成を以下の表３に示す。

（着生根粒数の調査）
各栽培条件のＹ６２９接種区、土着根粒菌区におけるヘアリーベッチに形成された根粒数を計数した。
この結果を図４に示す。Ｙ６２９株は、高温条件下においては、土着根粒菌区に比べて半分ほどの数の根粒を着生した。低温条件下においては、Ｙ６２９株は土着根粒菌と同様の着生根粒数を示した。なお、着生根粒数と共生窒素固定活性は必ずしも比例しない。
結果として、Ｙ６２９株は、確かにヘアリーベッチに根粒を形成させる能力があることが分かった。

（ヘアリーベッチに着生した根粒の観察）
低温条件における、ヘアリーベッチに着生した根粒を、カミソリを用いて輪切りにし、根粒内部の様子を実体顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＳＺ４０）により観察した。
この結果である図５を参照すると、土着根粒菌とＹ６２９株が感染した根粒には、しっかりと根粒組織が形成されていた。しかし、土着根粒菌の根粒は緑色をしていたが、Ｙ６２９株の根粒は赤色を呈していた。この理由として、Ｙ６２９株が感染した根粒では、宿主との親和性が高いため、赤色のレグヘモグロビンの存在が確認され、高い窒素固定活性を示していると推察できる。
レグヘモグロビンは酵素ニトロゲーナーゼの酸素による失活を防ぐ働きがあり、根粒中に鮮明赤色のレグヘモグロビンが存在することがＹ６２９株の高効率窒素固定の要因の一つとなっていると考えられる。

（アセチレン還元法による、窒素固定活性の測定）
窒素固定酵素ニトロゲナーゼは、窒素分子（Ｎ₂）をアンモニア（ＮＨ₄）にする反応を触媒する。この酵素はアセチレン（Ｃ₂Ｈ₂）をエチレン（Ｃ₂Ｈ₄）する反応も触媒するため、根粒にアセチレンを投与して生成するエチレンの量を測定することにより、ニトロゲナーゼの活性を評価することが可能である。
ヘアリーベッチに付着したバーミキュライトを洗い流した後、地上部と地下部に分け（種子の下で切断）、地下部をあらかじめ容量を正確に測っておいた１００ｍＬ三角フラスコに入れた。シリコン栓で密閉し、三角フラスコ内の気体容積の１０％を、シリンジを用いてアセチレンガスに置換した。２０分間インキュベート（１５℃）した後、三角フラスコ内の気体を、１ｍＬシリンジで０．５ｍＬ採取した。採取した気体中のエチレンをガスクロマトグラフィーにより定量した。
この結果を示す図６を参照すると、Ｙ６２９株が着床した根粒は、昼間２２℃の高温条件下と昼間１５℃の低温条件下共に土着根粒菌の根粒に比べて２倍以上の窒素固定能力を示した。
また、低温条件下においても、高温条件下の５割以上の共生窒素固定能力が保たれ、土着根粒菌の２２℃での窒素固定能力を上回る窒素固定能力があった。

さらに、図７を参照して説明する。ヘアリーベッチ種子を低温条件下で育てた際の土着根粒菌区とＹ６２９株接種区のヘアリーベッチの状態について、それぞれ４ポットのうち２ポットを並べて比較すると、土着根粒菌区のヘアリーベッチは赤みを帯びて生育状態が悪いが、Ｙ６２９株接種区のヘアリーベッチは葉が緑で艶があり順調に生育している。
すなわち、Ｙ６２９株接種区のヘアリーベッチは健全に生育している。なお、本発明において健全に生育するとは、ヘアリーベッチの生育状態が良いことを言う。

このように、低温耐性があるヘアリーベッチ根粒菌Ｙ６２９株が感染した根粒は、低温条件（約１５℃）でも窒素固定活性を高く維持することができる。これにより、ヘアリーベッチ植物体の窒素栄養状態を正常に保つことができるため、低温でもヘアリーベッチを健全に生育させることができる。

なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。

本発明の実施の形態の実施例に係るヘアリーベッチ根粒菌の分離方法の概念図である。本発明の実施の形態の実施例に係るヘアリーベッチ根粒菌の菌種を同定するためのＰＣＲ法のプロトコルを示す図である。本発明の実施の形態の実施例に係るポットによるヘアリーベッチ根粒菌接種試験の栽培概要を示す図である。本発明の実施の形態の実施例に係る着生根粒数の調査の結果を示すグラフである。本発明の実施の形態の実施例に係るヘアリーベッチに着生した根粒内部の様子を実体顕微鏡で観察した図である。本発明の実施の形態の実施例に係る低温での窒素固定活性の結果を示すグラフである。本発明の実施の形態の実施例に係る土着根粒菌区とＹ６２９接種区のポット栽培例を示す図である。

Claims

ヘアリーベッチから単離された根粒菌であって、接種により低温条件下でもヘアリーベッチが健全に生長できる共生窒素固定活性を持つ、
ヘアリーベッチ根粒菌（リゾビウム・レグミノサラム・ビーブイ・ビシアエ）Ｙ６２９株（ＮＩＴＥＡＰ−３２３）である
ことを特徴とする根粒菌。
前記共生窒素固定活性は、昼間１５℃夜７℃において０．３μｍｏｌ／植物・時間以上に維持される
ことを特徴とする請求項１に記載の根粒菌。
前記低温条件下においても、昼間２２℃夜１８℃の高温条件下の５割以上の共生窒素固定能力が保たれる
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の根粒菌。
前記根粒菌は、前記低温条件下にヘアリーベッチの根の窒素吸収活性が低下する際でも窒素栄養状態を正常に保つ
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１つに記載の根粒菌。