CN104928200B

CN104928200B - 对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌及应用

Info

Publication number: CN104928200B
Application number: CN201410106725.9A
Authority: CN
Inventors: 田黎
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: CN104928200A

Abstract

本发明公开了对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌，从海洋生境获得海洋芽孢杆菌BY‑1188菌株(Bacillus marinus)，经人工诱变育种和培养条件优化，以其保藏编号为：CGMCC No.6187的BY‑1188菌株，菌株经培养基优化测试，其适宜的发酵培养液的配方为：蛋白胨2‑5g，酵母粉1‑3g，NaCl，25‑30g，KCl0.3‑0.5g，MgCl₂·7H₂O1.9‑2.5g，FePO₄O.01‑0.02g，水1000ml，pH7.0‑7.5，上述为培养液，加琼脂16‑19g为固体培养基。本发明优点生物学特性和农药活性稳定，对环境没有污染。

Description

对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌及应用

技术领域

本发明属于海洋微生物领域，具体的说是由海洋生境获得的芽孢杆菌，种名：海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)，通过人工诱变育种及培养发酵，活菌制剂对栽培植物具有防病、促生长、诱导抗寒抗盐的作用。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2012年6月5日，保藏编号CGMCC No.6187，分类命名Bacillus marinus。

背景技术

农产品安全是所有食品安全的的源头，研发和使用高效低毒的生物农药是保证农产品安全的基本措施，活菌制剂是生物农药的一大种类，这些有益菌通过定殖在植物体或寄生在害虫体内，发挥抑菌和杀虫等作用。芽孢杆菌是其中最著名的益生菌，作为各种酶的产生菌广泛应用于工业生产；作为饲料添加剂和医药，可抑制常见肠道病原菌，提高动物抗病能力，降低抗生素用量；其无毒、成本低、杀虫、抑菌能力强的特点，也为国内外研发生物农药所关注，是世界产量最大的生物农药，新资源、新用途的发现更是国内外农药领域争夺的对象。

我国是土壤盐渍化严重的国家之一，盐渍化土壤总面积达3460万公顷，相当于耕地的1／3，鉴于人多地少的特点，这些盐渍化土壤仍被人们所利用栽种耐盐作物，同时，早春和晚秋的倒春寒每年也造成农作物巨大损失。目前国内外开发微生物农药由于生防菌都来源于陆地，在含盐量较高的土壤中难以存活、定殖，在盐渍地土传病害的防治效果较差；陆地生防菌由于生境原因，较低的环境温度限制了其发挥作用。近几年受到国内外关注的新资源-海洋微生物，由于其原始生境的低温高盐特性，使其更易在盐渍土壤和低温环境发挥作用，在新农药开发领域显现其生境优势。

发明内容

本发明目的是提供一株在防治植物病害的同时又可诱导植物抗盐，促进植物生长的海洋芽孢杆菌，及在农业生产应用。发明充分利用了海洋微生物这一特殊生境的天然资源，野生菌株已通过人工诱变育种，生物学特性和农药活性稳定，容易培养，培养周期短，操作方法简便可行，对环境没有污染，所用原料廉价，生产成本低，开发前景好，容易实现产业化。

本发明的目的是由以下技术方案实现的，由海洋生境获得了海洋芽孢杆菌BY-1188菌株(Bacillus marinus)，经人工诱变育种和培养条件优化，其适宜的人工培养发酵的条件为：

1)以其保藏编号为：CGMCC No.6187的BY-1188菌株，菌株经培养基优化测试，其适宜的发酵培养液的配方为：蛋白胨2-5g，酵母粉1-3g，NaCl，25-30g，KCl0.3-0.5g，MgCl₂·7H₂O1.9-2.5g，FePO₄0.01-0.02g，水1000ml，pH7.0-7.5，上述为培养液，加琼脂16-19g为固体培养基；

2)菌株在上述固体培养基置22℃-27℃温箱培养2-3天，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入步骤1中的培养液培养3天为种子液，再将种子液接入40-50L上述培养液中，22℃-27℃转速150rpm，振荡培养3-5天，获得发酵液，并可逐级放大。

所述的海洋芽孢杆菌BY-1188菌株菌落表面粗糙不透明，前期灰白色，后转变为浊红色，边缘缺刻状，表面多褶；菌体呈直杆状，革兰氏染色阳性，0.5-2.5μm×1.2-10μm，无荚膜，周生鞭毛，芽孢中生不膨大，成对或链状排列；生理生化特征：BY-1188菌株能在5％NaCl的环境生长，明胶酶试验阳性，触酶反应阳性，接触酶试验阳性，淀粉水解试验阴性，VP试验阴性，吲哚反应、H₂S反应阴性，氧化葡萄糖产酸不产气，不利用柠檬酸盐，不能水解尿素和卵磷脂。

所述的海洋芽孢杆菌BY-1188菌株采用对峙培养法、96孔板法、抑菌率统计法3种抑菌测试联合测试方法选出，菌株实用性强：

1)对峙培养法、抑菌率统计法为常规方法，对农业常见和危害严重的9种植物病原真菌：稻瘟霉菌Pyricularia oryzae、茄链孢菌Alternaria salani、镰孢霉菌Fusariumoxysporrum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、芽枝霉菌Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、丝核菌Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum进行抑菌测试，对峙培养法中抑菌圈30-35mm，抑菌率统计法中抑菌率73.33-87.60％；

2)96孔板为常规测试基础上创制的改良方法，以发酵液直接测，测试单位为μL／mL，供试靶标病原菌为：稻瘟霉菌Pyricularia oryzae和茄链孢菌Alternaria salani，供试靶标病原菌孢子悬浮液以每孔50μL的量加入到96孔板的第1行各孔(A孔)中，之后将海洋芽孢杆菌BY-1188菌株的无细胞滤液50μL，加入各孔混匀，并依次倍半稀释到第8行最后1孔(H孔)，以加无菌水的孔做为对照，27℃静置培养3小时后观察，观测标准为：对照的病原菌孢子90％以上正常萌发，处理的病原菌孢子死亡或畸形率在90％以上为抑制，每个处理重复3次，处理抑菌浓度越小，表示活性越高，BY-1188的抑菌活性MIC为2，显示强抑菌活性；

所述的海洋芽孢杆菌BY-1188菌株在植物活体上对辣椒疫霉病、番茄灰霉病防治效果分别为88.4％和85.1％，防治效果超过传统化学农药防治水平。

所述的海洋芽孢杆菌BY-1188菌株在普通耕作土及海滨盐渍土栽种的黄瓜、番茄、辣椒、甘蓝、甜瓜、茄子均能正常定殖，浸根栽种5天后根、茎、叶的定殖数分别可达5.98×10³、6.24×10³、3.78×10³，定殖数可维持15-20天。

所述的海洋芽孢杆菌BY-1188菌株对植物种子的萌发和幼苗的生长都具有促进作用，菌液处理的番茄植株苗健壮，叶片大，叶色浓绿，茎秆粗，根毛长，幼苗的株高、根长、茎粗分别增加65.0％-84.4％；叶绿素a、b、总叶绿素分别提高60.0％，-143.9％，植株鲜重、干重增加86.0％-115.8％。

所述的海洋芽孢杆菌BY-1188菌株在盐渍土壤诱导植物抗盐，菌株降低了根、叶Na⁺的积聚39.5％，提高根、叶K⁺含量36.09％，植株含水量提高73.66％，植株盐害症状减轻，盐害指数降低了56.67％。

本发明有益效果：充分利用了海洋微生物这一特殊生境的天然资源，野生菌株已通过人工诱变育种，生物学特性和农药活性稳定，容易培养，培养周期短，操作方法简便可行，对环境没有污染，海洋芽孢杆菌活菌无论在植物离体还是活体情况下，都对植物病原真菌有强抑制作用，菌株可在植物的根茎部及植物体内正常定殖，在防治植物病害的同时，还可促进植物生长和诱导植物抗盐，所用原料廉价，生产成本低，开发前景好，容易实现产业化。

具体实施方式

本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中，本发明的具体技术步骤如下：

实施例1：BY-1188菌株的人工培养及发酵

以保藏编号为：CGMCC No.6187的BY-1188菌株，经培养基优化测试，其适合的培养发酵液的配方为：蛋白胨2-5g，酵母粉1-3g，NaCl,25-30g，KCl0.3-0.5g，MgCl₂·7H₂O1.9-2.5g，FePO₄0.01-0.02g，水1000ml，pH7.0-7.5，上述为培养液，加琼脂16-19g为固体培养基。

在上述固体培养基上培养，并用常规方法测试其理化特征，该菌株的菌落及菌体特征：菌落表面粗糙不透明，前期灰白色，后转变为浊红色，边缘缺刻状，表面多褶；菌体呈直杆状，革兰氏染色阳性，0.5-2.5μm×1.2-10μm，无荚膜，周生鞭毛，芽孢中生不膨大，成对或链状排列；

生理生化特征：BY-1188菌株能在5％NaCl的环境生长，明胶酶试验阳性，触酶反应阳性，接触酶试验阳性，淀粉水解试验阴性，VP试验阴性，吲哚反应、H₂S反应阴性，氧化葡萄糖产酸不产气，不利用柠檬酸盐，不能水解尿素和卵磷脂。

菌株在固体培养基22℃-25℃培养4-5天，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入培养液培养3-4天为种子液，再将种子液接入40-50L上述培养液中，22℃-25℃，转速150rpm，振荡培养4-5天，获得发酵液，根据需要，同样培养方法可逐级放大。

实施例2：BY-1188菌株对多种植物病原真菌的抑菌活性；

发酵液抑菌活性采用3种(对峙培养法、96孔板法、抑菌率统计法)联合抑菌测试方法，对菌株的抑菌活性进行测试，这种联合测试方法可有效避免人为误差和菌株假阳性，获得的菌株实用性更强。

其中对峙培养法、抑菌率统计法为常规方法，对农业常见和危害严重的9种植物病原真菌：稻瘟霉菌Pyricularia oryzae、茄链孢菌Alternaria salani、镰孢霉菌Fusariumoxysporrum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、芽枝霉菌Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、丝核菌Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum进行抑菌测试；

96孔板法为申请人在常规方法基础上，根据海洋微生物及活菌制剂特点进行改良，常规方法测试最小抑菌浓度MIC单位为μg／mL，需获得抑菌物质纯品，工作量大，成本高，我们原理换算成测试单位为μL／mL，可用发酵液直接测，同时，病原靶标菌选择经多次试验证明的最有代表性的稻瘟霉菌Pyricularia oryzae和茄链孢菌Alternaria salani，大大节省了时间和成本：供试靶标病原菌孢子悬浮液以每孔50μL的量加入到96孔板的第1行各孔(A孔)中，接着将BY-1188的无细胞滤液50μL分别加入到96孔板的第1行各孔中混匀，并依次倍半稀释到第8行最后1孔(H孔)，第1列为对照列，加50μL无菌水。27℃静置培养3小时后，在倒置显微镜下与对照相比观察孢子萌芽情况(对照需90％以上的病原菌孢子正常萌发，处理要90％以上的病原菌孢子死亡或畸形)。每个处理重复3次。处理抑菌浓度越小，表示活性越高。

3种(对峙培养法、96孔板法、抑菌率统计法)联合抑菌测试结果显示如下：

表1 BY-1188对植物病原菌抑菌活性

注释：植物病原菌：Po：Pyricularia oryzae； As：Alternaria salani；

Fo：Fusarium oxysporum； Bc：Botrytis cinerea；

Vd：Verticillium dahliae； Cf：Cladosporium fulvum；

Pc：Phytophthora capsici； Rs：Rhizoctonia solani；

Fg：Fusarium graminearum “-”表示未测

Test1，简称T1：对峙培养测试，以抑菌圈大小表示菌株活性，“+”表示抑菌圈为20-25mm“++”表示抑菌圈为26-30mm“+++”表示抑菌圈为30-35mm；

Test2，简称T2：96孔板测试，反应固定的培养时间，菌株释放在胞外的最低抑菌浓度MIC，采取倍半稀释法，第一孔最高浓度500μl／ml，第二孔250μl／ml，依次递减，取整数，MIC越小抑菌活性越强；

Test3，简称T3：对病原菌的抑制率，抑制率=(对照菌落半径-处理菌落半径)／对照菌落半径×100％

由上表数据可知，BY-1188菌株对9种农业常见和危害严重的病原真菌，具有很好的抑菌效果，在对峙培养法中，除一株病原菌都达到最强抑制的抑菌圈30-35mm，抑菌率统计法中，抑菌率73.33-87.60％，显示很高的抑菌率；96孔板测试抑菌活性MIC为2，显示强抑菌活性具有研制新杀菌剂的潜力。

实施例3：在BY-1188菌株在植物活体的定殖

所试方法均为植物定殖常规测试方法：BY-1188做利福平标记后实施例1方法培养发酵，测试的植物苗浸入发酵菌液，分别栽入普通耕作土和海滨盐渍土(NaCl含量0.5％)的盆钵，分别在1、3、5、7、10、15天将苗各组织研磨，取样在添加利福的平板培养基上培养观察，并折算成每克检样细菌菌落个数(cfu／g)，结果证明见表2，BY-1188菌株无论在普通耕作土还是海滨盐渍土，栽种的黄瓜、番茄、辣椒、甘蓝、甜瓜、茄子都可以正常定植，浸根栽种5天后根、茎、叶的最高定殖数分别可达5.98×10³、6.24×10³、3.78×10³，定殖数可维持15-20天.

表2浸根栽种5天后CT-2628在植物体内定殖情况

实施例4：BY-1188菌株对植物的促生长作用：

采用常规方法测试BY-1188菌株对植物的促生长作用，分别用稀释500倍的BY-1188菌株发酵液和清水浸番茄种(对照)，栽种在装有灭菌土的盆钵中，每个处理12盆，3个重复，2片子叶时，用同浓度发酵液灌根1次，培养25天，连根拔出，常规方法统计根长、株高、鲜重、干重，与对照相比计算增长率。同时取叶片0.5g加入4倍体积的丙酮研钵中，加入少量石英砂，研成匀浆，常规方法测试BY-1188菌株处理和清水对照的番茄叶片叶绿素含量。

表3 BY-1188菌株对番茄的促生长作用

由表2可以看出，经BY-1188菌株对番茄种子的萌发和幼苗的生长都具有明显促生作用，菌液处理的番茄植株苗比清水处理的健壮，叶片大，叶色浓绿，茎秆粗，根毛长，幼苗的平均株高增长65.0％；根长增长84.4％；茎粗增长83.3％，芽孢杆菌处理的番茄叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素分别比对照分别提高了60.0％，143.9％，81.2％，平均鲜重增加86.0％，干重增长115.8％。

实施例5：BY-1188菌株对盆栽植物疫霉病、灰霉病的防治作用；

盆栽辣椒、番茄苗培养至3-4片真叶，用新配的孢子悬浮液常规方法接种疫霉病和灰霉病，BY-1188菌株发酵液稀释500倍。选取3叶期感染疫霉病或灰霉病且长势一致的盆栽辣椒和番茄苗，用上述化合物稀释液进行防治，以农业生产防治该病常用的传统农药做为阳性对照，同浓度的发酵液处理做为空白对照。每处理12株幼苗，3个重复，7d后调查病情，计算防治效果。

表4 BY-1188对辣椒疫霉病的防治效果

LSD检验P=0.05

表4、5数据证明，盆栽植物活体测试，活菌制剂对辣椒疫霉病、番茄灰霉病和均有很好的防治效果，分别为88.4％和85.1％；其防治效果超过传统化学农药防治水平。

实施例6：BY-1188菌株诱导植物抗盐试验

将番茄苗栽种在沿海取的自然盐渍土壤(生长耐盐植物，NaCl浓度为0.5％)，正常栽培土壤(NaCl浓度低于0.2％)作为对照，于处理2、4、6、8、10、12天后，传统方法测试种子的发芽数及胚根长、胚轴长，计算发芽指数；幼苗生长25天，收获完整的植株，传统方法测定幼苗茎粗，株高、根长、展开叶片数等计算壮苗指数，同时测试叶绿素含量和植物根、叶内Na+、K+含量。

结果证明，番茄的种子在土壤NaCl浓度为0.5％土壤中萌发受到抑制，加入海洋芽孢杆菌对番茄种子萌发促进作用较大，加入芽孢杆菌的发芽指数明显高于对照，提高58.3％

表6海洋芽孢杆菌处理对盐胁迫下番茄种子胚根、胚轴及发芽指数的影响

*小写英文字母表示多重比较a=0.05的差异显著性，无相同字母的同列数据间差异显著。

如下表7所示，与对照相比，芽孢杆菌处理株高、叶长、展开叶数、茎粗分别提高82.2％、66.7％、30.7％和50.0％，与CK相比差异显著(P＜0.05)。

表7海洋芽孢杆菌处理对盐胁迫下番茄幼苗形态的影响

表8盐胁迫下经海洋芽孢杆菌处理对番茄根叶内Na+、K⁺含量的影响

从表8可以看出，在盐胁迫下，与对照相比，经海洋芽孢杆菌处理后，番茄根、叶内Na⁺含量都有不同程度的降低，Na⁺在根内的积聚，与对照相比，降低了39.5％，根和叶片中K⁺含量升高，与对照相比，叶片中K⁺含量提高了36.09％。番茄生长25天后，对照的干重含水量为949.30％，经菌株处理干重含水量分别为1022.96％，处理能够促进番茄植株对水分的吸收，保持体内较高的水分含量，降低Na⁺在植物体内的积聚，提高植物体内K+含量，从而不同程度地减轻或缓解盐伤害，番茄苗生长情况也显示，对照番茄苗叶片失水干枯面积较大，显现出重度盐害症状，经菌株处理的番茄苗，第叶片盐害症状明显减轻，比对照盐害指数降低了56.67％。

尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动，都在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1.对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌，从海洋生境获得海洋芽孢杆菌BY-1188菌株(Bacillus marinus)，经人工诱变育种和培养条件优化，其适宜的人工培养发酵的条件为：

1)以其保藏编号为：CGMCC No.6187的BY-1188菌株；

2)菌株在上述固体培养基置22℃-27℃温箱培养2-3天，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入步骤1中的培养液培养3天为种子液，再将种子液接入40-50L上述培养液中，22℃-27℃，转速150rpm，振荡培养3-5天，获得发酵液，并可逐级放大。

2.根据权利要求1所述的对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌的应用，其特征在于：海洋芽孢杆菌BY-1188菌株采用对峙培养法、96孔板法、抑菌率统计法3种抑菌测试联合测试方法选出，菌株实用性强：

2)96孔板为常规测试基础上创制的改良方法，以发酵液直接测，测试单位为μL/mL，供试靶标病原菌为：稻瘟霉菌Pyricularia oryzae和茄链孢菌Alternaria salani，供试靶标病原菌孢子悬浮液以每孔50μL的量加入到96孔板的第1行各孔(A孔)中，之后将海洋芽孢杆菌BY-1188菌株的无细胞滤液50μL，加入各孔混匀，并依次倍半稀释到第8行最后1孔(H孔)，以加无菌水的孔做为对照，27℃静置培养3小时后观察，观测标准为：对照的病原菌孢子90％为正常萌发，处理的病原菌孢子死亡或畸形率在90％为抑制，每个处理重复3次，处理抑菌浓度越小，表示活性越高，BY-1188的抑菌活性MIC为2，显示强抑菌活性。

3.根据权利要求1所述的对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌的应用，其特征在于：海洋芽孢杆菌BY-1188菌株在植物活体上对辣椒疫霉病、番茄灰霉病防治效果分别为88.4％和85.1％，防治效果超过传统化学农药防治水平。

4.根据权利要求1所述的对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌的应用，其特征在于：海洋芽孢杆菌BY-1188菌株在普通耕作土及海滨盐渍土栽种的黄瓜、番茄、辣椒、甘蓝、甜瓜、茄子均能正常定殖，浸根栽种5天后根、茎、叶的定殖数分别可达5.98×10³、6.24×10³、3.78×10³，定殖数可维持15-20天。

5.根据权利要求1所述的对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌的应用，其特征在于：海洋芽孢杆菌BY-1188菌株对植物种子的萌发和幼苗的生长都具有促进作用，菌液处理的番茄植株苗健壮，叶片大，叶色浓绿，茎秆粗，根毛长，幼苗的株高、根长、茎粗分别增加65.0％-84.4％；叶绿素a、b、总叶绿素分别提高60.0％，-143.9％，植株鲜重、干重增加86.0％-115.8％。

6.根据权利要求1所述的对植物具有多种功能的海洋芽孢杆菌的应用，其特征在于：海洋芽孢杆菌BY-1188菌株在盐渍土壤诱导植物抗盐，菌株降低了根、叶Na⁺的积聚39.5％，提高根、叶K⁺含量36.09％，植株含水量提高73.66％，植株盐害症状减轻，盐害指数降低了56.67％。