CN117255850A - 棕榈假单胞菌bbb001植物抗非生物胁迫适应性代谢的刺激剂及矿物质营养增强剂 - Google Patents
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Abstract
细菌菌株PseudomonaspalmensisBBB001，革兰氏阴性细菌类群、假单胞菌属的微生物，植物抗非生物胁迫适应性代谢的刺激剂和在铁和其它营养物方面的植物营养增强剂。该菌株分离自粉蓝烟草(Nicotiana glauca)根际，通过全基因组测序，从形态学、生物化学和遗传学角度对其进行了表征，鉴定为一个新物种，可降低植物的氧化胁迫，诱导更高的产量和改善对非生物胁迫条件的适应性；例如，由于缺乏水或高盐度，因此它可以单独或与其他菌株组合使用，用于增加具有农艺食用价值的植物物种中的植物健康。此外，由于它能够增强铁、磷和钾的营养，它还可以在有机农业和传统农业中用作生物肥料。
Description
本发明涉及细菌菌株Pseudomonas palmensis(内部实验室代码是BBB001)，作为假单胞菌属的新种，用于在对植物进行处理以改善对非生物胁迫的适应，降低氧化胁迫以增加生长和产量。此外，它能够产生铁载体，改善植物的铁营养，逆转缺铁症状，并刺激其他营养物质诸如磷和钾的动员，因此它也是有机和常规农业的生物肥料。
该菌株已为专利目的保藏在巴伦西亚大学(University of Valencia)的西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Type Culture Collection)(CECT)，保藏号为30222。
技术领域
本发明属于农业食品生物技术领域，特别是植物生长调节细菌领域，因为上述细菌菌株能用作制备刺激植物适应性代谢的不同类型产品的基础。这些产品将改善植物对不同非生物胁迫条件诸如水分亏缺或土壤盐分过高的适应性。
同样在有机生物肥料领域中，因为该菌株可以用于在任何细菌制剂中以及利用特定条件下获得的细菌代谢物大体改善植物营养，更具体地说，能用于改善土壤中的铁吸收，尤其是在碱性pH下。
此外，由于它是属于新种的菌株，根据Bergey的《细菌鉴定手册(Handbook ofDeterministic Bacteriology)》(2001年3月版)中用于细菌索引的术语以及所进行的基因组分析，可以将本发明分类为假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌物种之一。
背景技术
植物促生细菌的作用机制可以概括为两种类型：直接作用，即细菌或其代谢产物改变植物的代谢(激素活性、适应性机制的刺激)；以及，间接作用，即细菌在不改变植物代谢的情况下，合成促进营养吸收或动员或者防止病原微生物在植物上生长的化合物。在本专利的情况下，这两方面都是令人感兴趣的。植物具有高度诱导性的次生代谢，与植物适应其一生中必须面对的不利情况有关。
假单胞菌属在土壤细菌中很常见。根据Bergey手册(2001年3月版)的分类学，该细菌被包括细菌域、变形菌门、γ变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科中。假单胞菌属在土壤系统中非常常见，并被再三描述为对抗各种植物疾病的保护性细菌。此类群中的一些细菌产生易溶于水的荧光黄绿色色素。在其他功能中，这些色素充当着铁载体(能够从微生物代谢的培养基中捕获铁的分子)。另外，由于大量的质粒含有用于合成特异性酶的诱导型操纵子，它们表现出很强的代谢多样性，特异性酶允许分解代谢存在于培养基中的化合物。脱氮假单胞菌(Pseudomonas sp.)在不同植物根际的存在对植物的生理产生有益的影响，表明植物在根际水平上对其进行选择是非常可能的。此菌株对不同植物的生理的影响表明，植物选择它们是为了自己的利益。
文献中有大量参考文献涉及含有假单胞菌属菌株的组合物和制剂，其单独或与其他生物结合刺激和改善植物生长，或作为植物检疫产品制剂、抵御病原体或保持作物良好生长的保护剂的基础，其中一些已获得专利权：西班牙公布号为ES2707807-T3(2019年4月5日)“新的发荧光的用于刺激植物出苗和生长的生氮假单胞菌种的荧光假单胞菌(Newfluorescent Pseudomonas fluorescens of the species Pseudomonas azotoformansfor the stimulation ofthe emergence and growth ofplants)”和ES2624788-T3(2017年7月17日)、“一株禾草假单胞菌种的菌株的生物培养物和该培养物作为生物防治病原菌的拮抗菌的用途(Biological culture ofa strain ofthe species Pseudomonasgraminis and use of this culture as an antagonist for the biological controlof pathogenic bacteria)”的欧洲专利；或国家专利ES2572746-B1(2016年9月21日)，“用于获得包含恶臭假单胞菌的植物生长促进组合物的方法及其用途(for Procedure forobtaining a plant growth promoting composition comprising Pseudomonas putidaand uses thereof)”。
发明内容
在本专利申请中，新的技术使得有可能基于其独特的遗传特征来鉴定新种Pseudomonas palmensis BBB001，当将BBB001的基因组与假单胞菌的254种完整且可用的基因组进行比较时，这些遗传特征将其与其他假单胞菌菌株区分开来。
允许对新种进行鉴定的参数是以下任意一个：i)平均核苷酸一致性(ANI)和平均氨基酸一致性(AAI)，限定新种的阈值为低于95％；ii)DNA-DNA数字杂交(dDDH)，其值低于70％；iii)鸟嘌呤-胞嘧啶含量(G+C)，值高于1％；iv)四核苷酸使用频率相关指数(TETRA)，其值低于0.99；v)多点序列分析(MLSA)，其值低于97％。
将BBB001基因组与254种可用基因组进行比较，解烷基酚假单胞菌(Pseudomonasalkylphenolica)是最接近的物种，ANI和AAI值分别为83.39％和85.11％(均低于95％)，DNA-DNA数字杂交(dDDH)值为27.10％(低于70％)，鸟嘌呤-胞嘧啶(G+C)含量为3.43％(高于1％)。针对该分析中最相似的种，脱氮假单胞菌NZ CP024478.1(菌株HLS-6)的四核苷酸使用频率相关指数(TETRA)值为0.983(低于0.99)。另一方面，在基于所选基因(16S rRNA、gyrB、rpoB、rpoD)的多位点序列分析(MLSA)的系统发育分析和物种界定中，最高相似性估计为日本假单胞菌(Pseudomonas japonica)的91.52％，其是该分析中最相似的物种；值低于97％表明它是新物种。所有假单胞菌基因组(核心基因组)共有的基因集中的单核苷酸多态性(SNP)的系统发育显示，其核心基因组由585个基因家族组成，仅占该类群总基因家族含量的0.05％，这一数值强化了其作为新种的身份。最后，基于泛基因组中存在或缺失同源基因家族的系统发育产生了与SNP分析非常相似的结果。“实现方法”部分中的表2和表3示出了新物种和最相似物种之间所有的相似性结果。
因此，基于多相鉴定方法，对一个新物种进行了描述，命名为Pseudomonaspalmensis sp.nov，已提交保藏(CECT保藏号030222)。该菌株的生理特征和遗传分析使其能够明确鉴定并与假单胞菌属的其他物种区分开来。
Pseudomonas palmensis菌株的特征在于其对植物的有益作用：它诱导参与消除胁迫情况下产生的自由基的代谢，通过氧化还原代谢的稳态机制和这些条件下水势的增加来改善植物对这些条件的适应，这是该菌株诱导水平衡能力的明确指标，致使植物抵抗水胁迫条件的能力更强。另一方面，它能够改善植物的铁营养，也能改善它们的生长。
作为一个新物种，目前尚无关于Pseudomonas palmensis任何作用的专利报道。关于假单胞菌属，有一些出版物描述了它们产生铁载体和调节氧化胁迫代谢的能力(Bar-Ness等人，1991,《植物铁营养与相互作用杂志(Journal Iron nutrition andinteractions in plants)》,271-281；Weger等人，1988,DOI:10.1128/jb.170.10.4693-4698.1988；Ghosh等人，2018,DDOI:https://doi.org/10.1007/s13213-018-1366-7；Vives-Peris等人，2018DOI:https://doi.org/10.1007/s00299-018-2328-z)。关于与基于上述标准提出的新物种最相似的假单胞菌菌株，即，解烷基酚假单胞菌(P.alkylphenolica)、日本假单胞菌(P.japonica)或脱氮假单胞菌NZ CP024478.1(菌株HLS-6)，在本发明的应用领域中没有关于这些物种的专利或出版物。有一些关于日本假单胞菌(Pseudomonas japonica)的信息涉及工业石油降解有关(日本假单胞菌(Pseudomonasjaponica sp。Nov.，一种同化直链烷基酚的新物种.《普通与应用微生物学杂志(JOURNAL OF GENERALAND APPLIED MICROBIOLOGY)》200854；本文中引用的1个菌株编号：TISTR 1526)和防止软体动物粘附于任何表面的能力(WO2014149324A1)，但不涉及本发明所涉及的农业食品领域。
本文所述的本发明的目的是分离和表征细菌菌株Pseudomonas palmensisBBB001(CECT 30222)，其是属于革兰氏阴性类群、假单胞菌属的微生物，其具有刺激适应植物中非生物胁迫的代谢的能力，通过诱导消除胁迫情况下产生的自由基所涉及的代谢来减少氧化胁迫，通过植物对这些条件的氧化还原代谢的动态平衡来提高植物对这些条件的适应，它通过诱导参与消除在胁迫情况下产生的自由基的代谢来减少氧化胁迫，通过氧化还原代谢的体内平衡来改善植物对这些条件的适应，以这种方式刺激生长和生产，以及施用用于动员养分特别是铁营养。
该菌株的生理特征和遗传分析，以及根据WIPO ST.25标准测序的基因组(整合在本描述性报告的末尾)，使其能够得到明确鉴定，从而将其与假单胞菌属的其他物种区分开来。
在对粉蓝烟草(Nicotiana glauca)根际的细菌筛选中，分离出一株属于假单胞菌属的菌株，基因分析无法将其放在该属的任何已知物种中。
一旦分离，即对假单胞菌BBB001的独特基因库进行了表征。在对254种完整基因组的比较分析中，BPGA计划鉴定了假单胞菌BBB001中独特存在的总共489个基因，其中41个基因与特定子系统相关。在假单胞菌BBB001特有的41个基因中，与铁摄取和代谢有关的基因以及与氨基酸和衍生物合成有关的基因因其丰度而脱颖而出。对应于序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：41的这41个基因具有编码用于工业规模生产物质或化合物的制剂的能力，并且可以用于异源表达以获得含有该菌株生物材料的产物。
在对它们进行表征后，进行了几项测试来揭示其生化活性，一方面表明了它们诱导适应性代谢、减少氧化胁迫和促进植物生长的潜在能力，另一方面表明了它们改善铁营养的能力。这些是产生生长素、降解1-氨基环丙烷-1-羧酸盐、磷酸盐溶解作用以及产生铁载体和几丁质酶，导致体外生长素和铁载体的产生呈阳性。BIOLOG Eco分析表明，它能够降解三羧酸苹果酸、羟基丁酸和葡萄糖胺酸，其中对1P-葡萄糖、纤维二糖、乳糖和N-乙酰葡萄糖胺的降解尤为突出。作为氮源，它使用腐胺、苯乙胺、丝氨酸以及L-乙二醇-L-谷氨酸。
到目前为止，已经进行了涉及在模式植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana))中直接接种Pseudomonas palmensis的实验，表征了与控制氧化胁迫和植物氧化还原平衡相关的酶的代谢谱，以及与作为刺激植物生长和生产的潜力的指示剂的荧光相关的光合参数的改变，以及作为对植物氧化还原平衡的影响的结果的植物健康状态。
此外，还对生长在生产温室中的黑莓植物(Rubus sp.var.Lochness)进行了直接接种。在6个月的生产周期中，每月施用两次，在周期的两个时刻(开花和完全生产)，测定了总累积产量，并测定了与黑莓叶中氧化胁迫控制相关的酶的代谢概况。
在不同植物物种上进行的这两个实验证明，该细菌能够调节参与植物适应非生物胁迫的代谢，通过增加消除氧自由基(ROS)的能力来控制氧化胁迫，增加消除氧自由基(ROS)的能力通过以下来进行：1)增加ROS清除酶、超氧化物歧化酶(SOD)或过氧化氢酶(CAT)的活性，以及2)在正常条件下增加负责产生ROS自由基的过量光合能量的耗散(非光化学淬灭，NPQ)。
已经进行了另一个实验来证明在番茄植物中刺激对盐胁迫条件的适应性代谢的能力。与对照相比，该菌株诱导了水势的显著改善，略微增加了脯氨酸含量，这是一种相容的渗透剂。在这些条件下水势的增加水势的增加明确地表明了该菌株诱导水分平衡的能力，从而增加了植物抵抗盐度或水分胁迫条件的能力。
在集约灌溉系统中对生产中的橄榄树进行的另一项实验中，使用BBB001进行了一项实验，以评估在正常灌溉条件下和减少25％灌溉的情况下增加产量的能力。在收获前的取样中，我们发现在标准灌溉条件下和减水条件下，与对照相比，果实的平均鲜重增加了40％以上。另一方面，在两种灌溉方式下，BBB001处理的植株在根水平的果实重达到相同的值。
另一方面，已经进行了逆转番茄植株缺铁黄化的实验。这些实验是通过在番茄植株中直接接种Pseudomonas palmensis来进行的，在番茄植株中已经诱导了缺铁，并且已经将底物调节到碱性pH以确保铁的不溶解。我们还用菌株测试了在特定铁载体生产培养基(改良的琥珀酸培养基)中生长的菌株，并且还仅测试了代谢液。在所有处理中发现了相似的结果，突显了在改善铁、磷和钾含量、改善光合作用、增加光合色素并进而改善生长(增加干重)方面的作用。
在本报告的最后(在关于如何实施的部分中)列出了Pseudomonas palmensisBBB001用途的实验，其能够刺激植物中适应非生物胁迫的代谢，通过增加与ROS清除相关的酶的活性来减少氧化胁迫，以这样的方式刺激生长和生产，以及具有作为生物肥料的应用，因为它刺激营养物特别是铁、磷和钾营养的动员。
本发明的最终目的(其构成了本发明的技术优势)是获得一种细菌(生物刺激剂/生物肥料)，其以刺激生长和生产的方式改善刺激植物适应非生物胁迫的代谢的能力，减少氧化胁迫。另一方面，它可以用作生物肥料，因为它通过任何可用的方式使细菌或其任何部分与植物接触来刺激营养物特别是铁、磷和钾营养的动员，改善某些细菌物种的作用。
因此，本专利申请要求保护菌株Pseudomonas palmensis BBB001或该菌株培养液的代谢物的用途，施用于任何类型的植物物种，以便增加植物适应任何非生物胁迫条件的能力，诸如盐度条件，增加生产，以及改善植物的铁、磷和钾矿物质营养。
Pseudomonas palmensis BBB001的这种用途可以作为菌株的任何制剂的一部分，单独或者与其它细菌物种或生物体组合使用，并且借助使细菌与植物的种子、根或气生系统接触的任何可用方法。
特别地，Pseudomonas palmensis BBB001的用途是适合与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CECT 9015组合使用，或者与其它菌株一起作为任何制剂的一部分，以改善对盐胁迫的反应；以及与氧化节杆菌CECT编码30231组合，以在有机和常规耕作中改善铁、氮、磷和钾的矿质营养。
具体实施方式
本文所描述的假单胞菌属菌株是通过对大加那利群岛拉斯帕尔马斯岛(LasPalmas de Gran Canaria，加那利群岛)过渡带上的粉蓝烟草自然种群的根际进行研究分离得到的。选择这种植物物种(Nicotiana glauca)是因为它属于茄科，因为它具有活跃的次生代谢，还因为它已被证明是具有目标农业生物活性的的微生物的良好来源。
2017年12月对粉蓝烟草自然种群进行了用于细菌菌株分离的根际取样。作为该次采样的结果，收集了450个菌株，在其中发现了Pseudomonas palmensis(BBB001，内部实验室代码)。该菌株的分离是在营养琼脂(PCA)上进行的。
在实验室中，该微生物在-80℃下在含20％甘油的营养肉汤(Pronadisa)或在-20℃下在含15％甘油的水溶液中保持着高存活率，并且在28℃下在用于分离的固相和液相培养基中均易于复苏。
I.Pseudomonas palmensis BBB001的形态、生化和遗传特征
对于菌株的表征，考虑了不同的表型特征，并在本报告中进行了详细介绍：(i)菌落形态，(ii)细胞形态，(iii)代谢谱，(iv)假单胞菌BBB001菌株的基因组与已有的假单胞菌属的完整基因组的比较分析。
表1列出了在标准琼脂(PCA)上于28℃孵育24小时后的菌落形态。
表1
在液体环境中生长(Pronadisa营养肉汤)时，从生长指数期到生长平稳期，这种环境的颜色变为黄色。
在28℃、标准琼脂(PCA)上培养24h后，Pseudomonas palmensis BBB001的形态特征对应于革兰氏阴性杆菌。
一旦用内部编码BBB001进行了分离和表征，就进行了几项测试以证明这种细菌的潜能。这些是产生生长素、降解1-氨基环丙烷-1-羧酸盐、磷酸盐溶解作用以及产生铁载体和几丁质酶，其中铁载体的产生呈阳性。
代谢谱分析(BIOLOG Eco，www.biolog.com/products-portfolio-overview/microbial-community-analysis-with-eco plates/)表明，它能够降解三羧酸：苹果酸、羟基丁酸和氨基葡萄糖，其中对1P-葡萄糖、纤维二糖、乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖的降解尤为突出。作为氮源，它使用腐胺、苯乙胺、丝氨酸以及L-乙二醇-L-谷氨酸。
为了研究Pseudomonas palmensis BBB001菌株与假单胞菌属其他种的系统发育关系，以及确定其分类归属，将其全基因组与数据库中已有的254种完整的假单胞菌基因组进行了比较。根据以下新细菌物种的定义标准，使用了三种主要策略：
1.估计基因组之间的相似程度：平均核苷酸一致性(ANI)、平均氨基酸一致性(AAI)、计算机DNA-DNA杂交(dDDH)、鸟嘌呤-胞嘧啶含量差异(G+C)以及四核苷酸使用频率(TETRA)：
·ANI和AAI值代表两个基因组之间进化距离的可靠度量；当这些值小于95％时，假定为新物种。经验证明，ANI和AAI值为95-96％相当于DDH(DNA-DNA杂交)值为70％，DDH是另一个常用于界定原核生物物种的参数(例如，Konstantinidis和Tiedje 2005,PNAS 102:2567-2572；Richter和Rosselló-Mora 2009,PNAS 106:19126-19131；Kim等人.2014,《国际系统与进化微生物学杂志(International Journal ofSystematic and EvolutionaryMicrobiology)》,64:346-351)。
·G+C含量的种内差异一般不超过1％；Meier-Koltho等人.2014，《国际系统与进化微生物学杂志(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology)》64：352-356)。
·dDDH指数显示出与传统DDH值较高的相关性(Auch等人，2010年,《基因组科学标准(Standards in Genomic Sciences)》2:1)。因此，认为dDDH值高于70％指示被进行比较的基因组属于相同物种。
·假单胞菌BBB001基因组与26个最密切相关基因组之间的TETRA值。预期密切相关的菌株的基因组会表现出相似的四核苷酸使用频率，相关指标(TETRA)等于或大于0.99，所以低于0.99的TETRA值指示新物种(Teeling等人.2004,《环境微生物学(EnvironmentalMicrobiology)》6:938947；Richter和Rosselló-Mora 2009，PNAS 106:19126-19131)。
2.基于多位点序列分析(MLSA)的系统发育分析和物种界定：
·对16S核糖体基因(16S rRNA)的测序是当前细菌物种分类系统的基本工具。一般认为，两个不同物种的16S rRNA基因相似度值小于98.65-99％(Kim等.2014,《国际系统与进化微生物学杂志(International Journal ofSystematic and EvolutionaryMicrobiology)》64:346-351)。然而，在许多情况下，16S rRNA基因可能提供的分辨能力有限。一方面，这种基因可能对近亲物种的区分能力较低。另一方面，尽管基于DDH值存在明显差异，一些物种可能表现出非常相似的16S rRNA序列(<99％)(Ash等.1991,《国际系统与进化微生物学杂志(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology)》41:343-346；Rosselló-Mora和Amann 2001,《FEMS微生物学综述(FEMSMicrobiology Reviews)》25:39-67)。在假单胞菌属的特定情况下，Mulet等人建议分析另外三个基因(gyrB,rpoB和rpoD)来界定物种、鉴定新菌株或者解决该类群内的系统发育关系(Mulet等人,2012a,《系统与应用微生物学(Systematic andApplied Microbiology)》35:4555-464；Mulet等.2012b,《系统与应用微生物学(Systematic andAppliedMicrobiology)》35:145-149；Sánchez等人.2014，《系统与应用微生物学(Systematic andApplied Microbiology)》37:89-94)。Mulet等人基于假单胞菌属内这四个基因的MLSA，建立了97％的平均相似度作为物种界定的标准(Mulet等人,2010，《环境微生物学(Environmental Microbiology)》12：
1513-1530)。
3.全基因组水平的系统发育分析，基于对基因组保守部分(核心基因组)中变异(单核苷酸多态性，SNP)的鉴定和泛基因组中基因的存在/缺失：
·所有假单胞菌基因组(核心基因组)共有的一组基因中SNP(单核苷酸多态性)的系统发育，以及基于泛基因组中同源基因家族存在与否的系统发育。细菌基因组测序和比较方面的进展揭示了属内不同物种，甚至相同物种的不同菌株的基因含量存在意想不到的差异。例如，大肠杆菌菌株的基因组仅共有其基因的40％(Rasko等人，2008，《细菌学杂志(Journal ofBacteriology)》190：6881-6893)。这导致形成了核心基因组的概念，以限定给定类群中所有细菌物种共有的基因集。类群中一个或多个成员缺失进而不构成核心基因组一部分的基因被称为附属基因。最后，完整的基因库(即，核心基因组和附属基因的总和)被称为泛基因组。
最后，作为假单胞菌泛基因组分析的结果，对假单胞菌菌株BBB001中存在的独特基因库进行了表征。
1.对基因组之间相似度的估计-
1.1.平均核苷酸一致性(ANI)和平均氨基酸一致性(AAI)参数：
该分析的第一步包括在核苷酸和氨基酸水平上将假单胞菌BBB001基因组与RefSeq数据库(NCBI参考序列数据库)中已有的假单胞菌属的所有完整基因组进行比较。
用OAU.jar程序计算核苷酸一致性指标(NIA)的估计值。
使用工具CompareM v0.0.23(https://github.com/dparks1134/CompareM)来比较氨基酸含量(AAI)。这种工具鉴定同源基因并计算它们之间的一致性。
1.2.NA-DNA电子杂交(dDDH)和G+C含量：
基于前一部分的结果，选择位于ANI值分布的第四个四分位数的26个基因组(即，正如所预料，与假单胞菌BBB001最密切相关的基因组)，使用web服务器GGDC(基因组到基因组距离计算器)来计算基因组间距离和dDDH指标。该服务器还计算被分析基因组中G+C含量的差异。
1.3.四核苷酸使用频率(TETRA)：
使用JSpecies软件(Richter和Rossellow-Mora 2009，PNAS 106：19126-19131)来计算假单胞菌BBB001基因组与26个最密切相关的基因组之间四核苷酸使用谱的差异。
2.基于多位点序列分析(MLSA)的系统发育分析和物种界定
在同样对26个基因组的子集进行的多位点分析中，包括了建议用于假单胞菌属物种界定的四个看家基因：16S、gyrB、rpoD和rpoB(例如，Mulet等人.2012a,《系统与应用微生物学(Systematic and Applied Microbiology)》35:4555-464)。
-16S：使用自制的bash脚本管道来提取所分析的每个全基因组中该基因的多个拷贝。这些拷贝被压缩成一致，其中每个变量位置都被表示为一个模糊性。
-gyrB、rpoD和rpoB：利用BWA 0.7.12进行对照定位，从所研究的全基因组中提取gyrB、rpoD和rpoB基因(Li和Durbin 2010，《生物信息学(Bioinformatics)》26：589-595)。
此外，为了将所得的系统发育与Mulet等人在研究解烷基酚假单胞菌(Pseudomonas alkylphenolica)的系统发育地位(Mulet等人.2015《国际系统与进化微生物学杂志(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)》65:4013-4018)时得到的系统发育结果进行比较，将该研究中使用的其他13个基因组未完整发表的物种或菌株的序列纳入了分析。
对于上述基因中的每一个，使用Mafft v7.310程序(Katoh等人，2002，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》30：3059-3066)进行所有序列的比对。在4次比对中，每一次均去除了模棱两可的区域(即，某些序列中缺失的区域和/或错位的区域)。
最后，将4个基因连接起来，并使用PartitionFinder 2对每个基因进行最佳匹配的核苷酸取代模型估计(Lanfear等人.2012,《分子生物学与进化(Molecular Biology andEvolution)》29:1695-1701)。使用MrBayes v3.2(Ronquist等人,2012年,《系统生物学(Systematic Biology)》61：539-542)来获得系统发育树。
还使用称为距离计算器(Distance Calculator)的Biopython模块对假单胞菌BBB001与其余物种或菌株之间的这4个基因的相似度进行了研究。在是16S基因的情况下，因为它是多拷贝基因，所以计算了每个拷贝的平均相似度。
3.基于全基因组序列的系统发育分析-
使用BPGA软件(Chaudhari等人,2016,《科学报告(Scientic Reports)》6：24373)对253个完整的假单胞菌基因组和假单胞菌BBB001中的注释基因进行同源聚类。聚类阈值为50％同源性，因此聚类了同源基因以及可能属于相同家族的基因。BPGA鉴定所有被分析基因组(核心基因组)共有的基因家族、附属基因，此外还有独特的功能，即没有被分组到任何创建的聚类中的基因。
3.1.核心基因中SNP(单核苷酸多态性)的系统发育：
首先，设计了自制的bash脚本管道来提取与被BPGA鉴定为核心基因组的基因相关的核苷酸序列。
使用距离计算器分析了这些序列的遗传距离，并使用Mafft v7.310生成每个核心基因的比对结果(Katoh等，2002，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》30：3059-3066)。最后，从生成的比对中提取空位含量信息，以鉴定质量差的比对。
对于SNP的研究，需要确保提取的所有位置都是同源位置，因此排除了包含距离大于50％的序列和包含空位含量大于10％序列长度的基因。
使用Geneious v10.2.2(Kearse等人，2012，《生物信息学(Bioinformatics)》28:1647-1649)去除序列的10％以上具有空位的位置，并最终提取PHYLIP格式的SNP。
使用RAxML v8.2.9软件(Stamatakis 2014，《生物信息学(Bioinformatics)》30:1312-1313)生成所有连接的SNP的最大似然系统发育树。通过执行1000次引导复制来计算每个节点的支持。
3.2泛基因组中基因或基因家族的矩阵存在/缺失的系统发育：
使用IQTREE(Chernomor等人，2016，《系统生物学(Systemic Biology)》65：997-1008)，使用由BPGA产生的基因存在/缺失矩阵来重建最大似然系统发育树。通过执行1000次引导复制来计算每个节点的支持。
4.假单胞菌BBB001独特基因库的表征。
为了确定所鉴定的独特功能是否为以前没有描述过，创建了NCBI/EMBL/DDBJ数据库集合中已有NR(非冗余)蛋白数据库的本地数据库，以使用BLAST+2.6.0程序对它们进行搜索(Camacho等人,2008,《BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)》10:421)。
使用自制的用bash语言编写的脚本管道从执行的搜索中获得的第一个匹配项中提取相关信息。独特的基因以附件的形式呈现。
5.结果讨论
将我们的菌株与254个假单胞菌基因组进行比较得到的结果使我们能够确定它是一个新种，Pseudomonas palmensis BBB001，如下所示；所有的值都是与最相似的物种比较的结果。因此，其独特的遗传特征是：相对于烷基酚假单胞菌，ANI和AAI值分别为83.39％和85.11％(表2)，估计的dDDH值为27.10％，G+C含量相差3.43％(表2)。与该分析中最相似的菌种脱氮假单胞菌(Pseudomonas sp.)NZ CP024478.1(菌株HLS-6)相比，它还表现出TETRA值为0.983(表2)。
表2示出了对基因组之间相似度估计的结果。针对每个基因组，示出了其长度(以碱基对为单位，bp)、注释基因数目、ANI、AAI、dDDH的值、基因组间距离、G+C含量差异以及与假单胞菌BBB001基因组比较时估计的TETRA。在第1栏中，在种名之后，给出了RefSeq基因组登录号。
表2
在MLSA分析中对16S rRNA基因(保存在Genebank中的序列MW009702)相似度估计得到的值在98.52％和99.42％之间，接近或高于纳入在相同物种中的阈值，然而，MLSA中所纳入的其他三个基因的相似度值却大大低于Mulet等人根据假单胞菌属内这四个基因的MLSA建立的物种界定的97％(91.52％，相对于日本假单胞菌(Pseudomonas japonica)，该分析中最相似的物种，表3)。
表3示出了MLSA中纳入的四个基因中的每一个的相似度百分比以及针对四个基因一起计算的平均相似度。
表3
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所有假单胞菌基因组共有的基因集(核心基因组)中SNP的系统发育。用BPGA软件对假单胞菌属的254个完整基因组和假单胞菌BBB001的基因组进行比较，发现其核心基因组由585个基因家族组成，仅占该类群中总基因家族含量的0.05％。绝大多数核心基因组家族与翻译和核糖体生物发生或氨基酸代谢和转运功能有关。
从核心基因组家族的类群中提取直系同源基因(275个基因)后，在254个基因组中总共鉴定出164394个多态性位置(单核苷酸多态性，SNP)。基于SNP，获得了五个主要的不同类群，这与Gomila等人2015年提出的假单胞菌属的系统发育大体一致(《微生物学前沿(Frontiers in Microbiology)》6:214)：
·铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、脱氮假单胞菌(P.denitrificans)、克氏假单胞菌(P.knackmussii)、香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)类群(102个基因组)
·斯氏假单胞菌(P.stutzeri)类群，P.balearica也属于其(11个基因组)
·丁香疫病假单孢菌(P.syringae)类群，其还包括扁桃假单胞菌(P.amygdali)、油橄榄癌肿假单孢杆菌(P.savastanoi)、P.viridiava和菊苣假单胞菌(P.cichorii)(22个基因组)
·荧光假单胞菌(P.fluorescens)类群，其包括其他种，诸如孟氏假单胞菌(P.mandelii)、韩国假单胞菌(P.koreensisis)、油菜假单胞菌(P.brassicacearum)、Pseudomonas protegens和莓实假单胞菌(P.fragi)(57个基因组)
·恶臭假单胞菌(P.putida)类群，可以在其中找到假单胞菌BBB001(43个基因组)
·其他类群：(19个基因组)
恶臭假单胞菌类群包括被分析的254个完整基因组中的43个，并且是数据库中已有的。除了属于恶臭假单胞菌的所有基因组外，在该类群中还发现了其他物种，诸如蒙氏假单胞菌(P.monteilii)或副黄假单胞菌(P.parafulva)。与MLSA结果一致，假单胞菌BBB001与解烷基酚假单胞菌(P.alkylphenolica)和脱氮假单胞菌NZ CP024478.1(菌株HLS-6)形成了统计学上支持良好的亚群。在这个亚群中，无法与MLSA的结果进行直接比较，因为种日本假单胞菌和弗村假单胞菌(P.vranovensis)没有公开的完整基因组，因此未纳入核心基因组分析中。然而，虽然MLSA系统发育没有解决假单胞菌BBB001相对于其他物种的系统发育位置，但SNP系统发育提供了更大的分辨率，恢复假单胞菌BBB001作为该亚群的基础谱系(即，假单胞菌BBB001是第一个与解烷基酚假单胞菌和脱氮假单胞菌HLS-6中分开的)。
基于泛基因组中同源基因家族存在或缺失的系统发育。对254个基因组的比较分析揭示了在泛基因组中总共存在65137个附属基因家族。将每个基因组中基因存在或缺失的信息转化为二元矩阵。
总体而言，根据泛基因组中基因的存在/缺失信息获得的系统发育与基于SNP分析获得的系统发育相似，但也存在显著差异。例如，根据SNP系统发育，比铜绿假单胞菌更接近恶臭假单胞菌类群的斯氏假单胞菌(P.stutzeri)类群，根据其附属基因含量，根据其附属基因的含量，它似乎是基础类群，是所有分析中差异最大的类群。
在泛基因组系统发育中，假单胞菌BBB001也是恶臭假单胞菌类群的一部分，与解烷基酚假单胞菌和脱氮假单胞菌NZ CP024478.1(菌株HLS-6)一起构成独特的亚群。在这种情况下，与SNP系统发育相反，该分析以显著的支持值确定了假单胞菌BBB001和脱氮假单胞菌(菌株HLS-6)之间更密切的关系。因此，BBB001假单胞菌的附属基因库可能更类似于脱氮假单胞菌(菌株HLS-6)，而不是解烷基酚假单胞菌。
II.Pseudomonas palmensis作为植物对非生物胁迫适应性代谢的刺激物和铁营养增强剂的证据。
1.Pseudomonas palmensis在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)上进行直接接种试验。实验在光照、湿度和温度受控制的条件下的实验室内进行，共42株植物，N＝3，采用随机区组模型-在萌发后2周和5周，将菌株的细胞悬浮液接种到预发芽的拟南芥幼苗中。在6周时，测量荧光光合参数(F0，Fv/FM，PSII，NPQ)，收获植物，称重并分析与ROS清除(SOD、APX、CAT)和抗坏血酸谷胱甘肽循环(脱氢抗坏血酸还原酶-DHR、单脱氢抗坏血酸还原酶-MDHR、谷胱甘肽还原酶-GR)相关的酶活性。观察到能量耗散能力(非光化学淬灭-NPQ)显著增加，并且与氧化胁迫控制相关的酶的代谢谱包括过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的显著增加，以及APX活性降低。记录到鲜重有所增加。
2.在生产温室中在黑莓(Rubus var.Lochness)上直接接种Pseudomonaspalmensis的实验。在真实的田间生产条件下对总共120株植物进行实验，n＝3，采用随机区组实验模型。在6个月的生产周期内，从十月到三月，每月两次在根水平施用该菌株的细胞悬液。采集总产量，并确定两个采样时刻，即完全开花和完全结果时。在每个时刻，测量光合荧光参数(F0、Fv/FM、PSII、NPQ)并收集叶片，分析光合色素以及与ROS清除有关的酶活性(SOD、APX、CAT)和与抗坏血酸-谷胱甘肽循环有关的酶活性(脱氢抗坏血酸还原酶-DHR、单脱氢抗坏血酸还原酶-MDHR、谷胱甘肽还原酶-GR)；评估抗氧化潜能(抑制β-胡萝卜素氧化的能力)和丙二醛-MDA水平(细胞氧化状态的指标)。在两个采样时刻都观察到非光化学猝灭(NPQ)显著增加，叶绿素B显著降低；与氧化胁迫控制相关的酶的代谢谱包括超氧化物歧化酶(SOD)和单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHA)活性显著增加，以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性降低，这与抗氧化潜能的提高和坐果期丙二醛水平略低于对照有关。记录到水果产量有所增加。
3.盐胁迫下的番茄(var Casillas)适应性代谢刺激试验。本实验在温室内光照、湿度和温度受控条件下进行，共有336株植物，4个处理，每个处理3R,n＝28，随机分组。番茄种子在盆栽中萌发，在萌发后2周、4周和6周施用3次细菌悬浮液；用500mM NaCl溶液灌溉1周，保持正常灌1周，之后用Scholander摄像机测量水势，并测定根系干重、地上部干重和株高。观察到株高和地上部重量显著降低了，水势增加了，与水分胁迫抗性有关的渗透调节物质脯氨酸增加了。在本实验中，还对P.palmensis与另一种假单胞菌——荧光假单胞菌CECT9015的组合进行了测试。观察到两者的组合显著增加了株高和根干重，以及水势增加和脯氨酸显著增加，根据Colby(http://www.jstor.org/stable/4041058)，这种作用是协同的，因为CECT9015菌株本身并不是造成这些增加的原因。
4.在超集约化灌溉的橄榄树上进行了一项实验，减少25％灌溉(4次灌溉中减少一次)。对假单胞菌菌株BBB001进行了根施试验。从四月到九月，每15天进行一次施用(12次施用)。实验中的植物数量为每个处理(3)株加上对照共20株，采用两种灌溉方式(100％水和75％水)。收获前的跟踪取样(九月)表明，在根水平施用BBB001菌株致使橄榄的鲜重比对照增加44.52％(20个果实的平均重量，n＝3)，水减少的情况下比对照增加45.96％，在两种灌溉方式下BBB001处理的橄榄达到了相同的重量。
5.番茄植株(var.Casillas)缺铁黄化病的逆转。实验在温室内光照、湿度和温度受控条件下进行，共216株植物，9个处理，每个处理24株，3个重复，采用随机区组试验模型。在整个实验过程中，用5mM碳酸氢钠缓冲液将基材保持在碱性pH下。种子在基质盆中发芽，用不含铁的霍格兰德溶液每周浇水一次，持续8周，直到出现黄化。一旦出现黄化，就开始用含铁(提供不溶性形式的铁(Cl3Fe))的霍格兰德溶液灌溉，并用含可溶性铁的霍格兰德溶液维持对照；施用3剂细菌，每次施用时间相差4天。2周后，黄化被逆转，测量荧光光合参数(F0、Fv/Fm、PSII、NPQ)并收获植株。对干重、光合色素和叶片养分进行了分析。观察到Fo、Fv/Fm和èPSR增加，能量耗散(NPQ)减少，伴随着光合色素(叶绿素a、b和胡萝卜素)增加，表明植物健康有所改善。营养分析表明铁含量增加了25％，锌含量增加了，对磷和钾吸收的分析表明分别增加了8.46％和1.3％。
在同样的实验中，我们测试了：1)在营养肉汤中生长的P.palmensis(结果如上所示)，2)在铁载体生产培养基中生长的P.palmensis，3)负责动员不溶性铁的培养基中含有的细菌代谢物(铁载体培养基)。总体而言，干重和色素的结果与前一段中所示的结果相似，P.palmensis总是脱颖而出。还将所有这些处理与产生生长素的氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)保藏号CECT 30231的菌株组合进行了测试。总体而言，干重和色素的结果是相似的，只有P.palmensis总是脱颖而出；然而，根据Colby(http：//www.jstor.org/stable/4041058)，P.palmensis与氧化节杆菌保藏号CECT 30231的组合对铁摄取具有协同作用，与对照和每种菌株单独作用相比，铁含量增加了36.4％。还在对氮、磷和钾吸收的分析中观察到增加了1.5％、9.7％和9.5％。
工业实用性
鉴于上述Pseudomonas palmensis BBB001作为非生物胁迫适应性代谢刺激物的特性，改善植物的氧化平衡，调节与ROS清除相关的酶的活性，以及其动员营养物质(特别是铁、氮、磷和钾)的能力，该细菌菌株在农业食品、化学和制药工业中具有特殊的应用，因为它可以用作任何制剂的一部分(单独使用或与其他微生物组合使用)，并借助任何可用的方法，在任何植物物种或任何形式的体外培养中，使它们(菌株或其任何部分)与植物的种子、根或气生系统接触，以增加菌株适应非生物胁迫条件的能力，并改善矿物质营养，特别是铁、氮、磷和钾。
<110>Biobab S.L. R&D
<120>Pseudomonas palmensis P7 stimulator of plant adaptive metabolism toabiotic stress and iron nutrition enhancer
<130>fig|6666666.276201
<160>41
<210>1
<211>477
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen1
atgctccagtgcaccctgattcagcccctgggccgtggcatggcgcaggcgagccgccgc 60
ttcgagttgttcacgcagcgacaggggggcgccggcgggctgtgcagccggttcgggagc 120
gggcggtatacgcttcacgggcgcgggcaccgcaacgactgccggcgcaggagctggtgc 180
ctgtaccggcgcaggcaccgatgccagggtcggcggcagcttcagggccgccagggtcgc 240
ggccaccggggcaaccggctcgggcgcggcagcaggtgtgatcggttcagccaccgtcag 300
cgcgggttcgaggtattcgaactcggtgtcgatttctttatagctgtccgcacttgcccc 360
aaacctggtgaacagatttccaatgtcgtctgcatgactcatatgtgtaatcccggccta 420
cggctatctgatcaactgctggggcagataaggtctgtcacactgctaggatgctaa 477
<210>2
<211>462
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen2
atgccgcgtcctgcggctggggcaaggatagtggtgcgcgcgcagggtgcgcgggggaga 60 gtgagtcgaggttttgcagcggttgacggggccaggggcgctgttcaagatcacggcgcc 120
ccggtgcagccttcgccggcaacaccggctccaacaagggcacaaccagacaggagtctg 180
tcatgcagtcgttcatccgacccgccactaccgccgatatcgaggcgcttttcgagatcc 240
gcaccagcgtcgtgcagaaccatctgtctcgcgaacagatgctggcgctgggtatcaccc 300
cggccagcctggccgaggccatcgcggccgccccgtgcgcctggctggcggaagtcgagg 360
gcatgccggcggcgtttgccatggtcgatctggaagacgcctgcgtgttcgcgctgttcg 420
tcaaacctgcattcgaagggcaggggctggcccgccaactga 462
<210>3
<211>234
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen3
ttggctatacaccaacatccacaaaacctgacttggaagaaagaagagcggcgccaaggc 60
gcctacagggacaggctcggcttcaggacgcaagcagcgcgacgatcatcgccagcgcat 120
gctgcttggcaagcaacgtcaacggctgcaggcctcggaaaggctatcggcagcacgtgc 180
actttgcttgaggcgccgcaagcatgcggcacgaagccaacgcgccaagtgtga 234
<210>4
<211>225
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen4
ttggagacgagggaagacggggggaaattagggggctggccactccagttccgcaggccc 60
cggcacgttgcatgtgccgtgtgcacgctatgcaggcgccagccttgctggccaacgcat 120
gcgccggcgctttcacagcctaaatcaccctgcacctgcttcgttcttgtogggtacgact 180
ggaccttgtggtcccgcatcctatcgacaaggacgcattgcatga 225
<210>5
<211>210
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen5
atggctgtagccggcccgggcggcgacttcgaccatccggggtggggacagctcaaggac 60
agtgagggcggccagggacatgacacgtgggttcatggaggagtctcgggtgcgttgttg 120
tatttgcattatttagaacttagttccaatttcaatgcaagtacaaaaaaaacagctttg 180
cgctccgcaaaactgcctttgtttgcctga 210
<210>6
<211>204
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen6
atggccgctttcatctggcacagcagcgtagtcactcacgagcacctccaaccttgtgat 60
ttttattctgttggcgcacgcccccgaacccgcaagcccggtactgacgcgggaacaggc 120
ggtcgtcgccctgctcgagtcttagggcacgaaggggctggcacaagcgaaaaaaaatgg 180
gctggtcctgaattattttcctga 204
<210>7
<211>195
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen7
atgagcgcggatgatttcaagggcagggtttccctggtacccctgagcgcacagcatagc 60
cgttcatcggcccgtatacagctgaggcgtcagcctgatgtactgcaggggaggctgccg 120
ctgtcggcaggcccgggcactaaagtacttacaatttttcttacgccctgtagaatcgcg 180
ttacgcatacaataa 195
<210>8
<211>192
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen8
atgacctctagaaaccagacaaagcttgcgctgcggcgacagactgcgagcgcagtggcc 60
gaacgacaggtgtttttatgggagggcgcacactctgaagcagcacccgccacttgtcaa 120
agtacggggctagacggctgcacgcgggtcgcatgcatgactgaaaacgacgcatttcaa 180
ttgaacgtttga 192
<210>9
<211>185
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen9
gtggcctgcaccgcagaggcacggtcagcaagccacgaccagaaaagcaa accgcccccc 60
gcaaccaccaagccagcgggcagggataccagggccacaccggttaccaacagggcaaag 120
cccaataggccggtgagccaggacaggtacaccagtttcatatgccgacccctttgtcgta 180
gatag 185
<210>10
<211>162
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen10
ttgctatctggtgaggacgagcgcaatcggcagaaatttagccgtcgcctgcgccctgtg 60
cgggccgcccggggccgcttgctggctaaatttccctgtgtgcacaacgttctagcttcg 120
acaacgccatgctccatggcgcaacgcgagacacacaggtag 162
<210>11
<211>156
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen11
atggcagatgtgcgggggcagggcggcgagcatacgatctcctgggtcgggccttgtccg 60
ttgcaggccgggagtcgtatcgacgaatgaggctgttctgtaccggggcgtggcccttt 120
gcgcggacggcaggcgcggagaacgccagggcgtga 156
<210>12
<211>156
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen12
gtggctgaacttcaggtttttggtcattgcgaggtctgtctgcacaaggcggtcaacggg 60
gagggcgcggcgaaacgtcgcagcgccctcctgtgtcgtccgcgccgggcaaaaaatga 120
gcggatgtgcgactagtcgacaaatggcaacgataa 156
<210>13
<211>150
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen13
ttgaggcttgagagcatagggaatgaagccactgaagtatcgctgttgaaagccggtcga 60
atatcgcccaacaggcgtttggggcaacgcctggatttaactttgtgcagttttgccaac 120
actggaatcagacgatttcaagtgtgctga 150
<210>14
<211>150
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen14
ttgccccgcgaactggcgcgcagcgccagcaaaacctgcgaacgcgatctggctgatgca 60
ccgcgcacgatcgtcggccagcagcagcccacctgcacgcatgtggttgagctaccgctt 120
gagcccagccaagtcagtaaggcacgttga 150
<210>15
<211>147
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen15
gtgctgggagtgacggcgggagggcaggcagaacgcgggcgtggaaggacatcagtatca 60
ccattgttgttgttgattgggccgggcactgcagtaaagtcagagccctggctgaccggt 120
cttttgccggaggtgaggcgatgctaa 147
<210>16
<211>147
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen16
atggatcacggtcacaccgtcaccgaaacccatgtcttcccgctcaagtcggcggatttc 60
tgcatcaggggatgctgcgctggcgccggtggccagcagcaggaggcagagggcgaggcg 120
ggtcatggctgcacctcgccgctgtag 147
<210>17
<211>144
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen17
atggtacgacgaatttctatcgtactgataagcgggatcgagggtggtgaggggtattca 60
ccgatctggctgagcatcgaacatttcgaccatcatttcctcatgcttcttttgccttac 120
ggtgtagagcatgcaccggtgtaa 144
<210>18
<211>141
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen18
gtgggccagccgctgactcgttgccagcaggtgcgcccgctgttctgtcaggcgttcctg 60
ggcgatggcatcaatgtccgcgttcaggacggcgatctgcctggcatggtcggcttcccg 120
ctgtgcgagccccgcggctaa 141
<210>19
<211>141
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen19
atggccgctggccgcacttgcggcacggccggctgctcgatcgacttcatcccgcaggct 60
agatcagcacgagcagcggcagcatcagccaccgcacggtcaatggttttctgtccatc 120
ctgaatcgccttgttgattga 141
<210>20
<211>141
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen20fig|6666666.276201.peg.3580
atgttgcgtcaggtaccggggcttggcatgcccggcaagctgggccaagcttgcatgggc 60
ctgcagcagttgctctactacgggcctttcatcgatagcgctgatgattactatcaaagg 120
gcccgcctgtcggcgcggtaa 141
<210>21
<211>138
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen21
gtggtcgtcatcggccagcggccggagctcgcccggcctgctgaaaggcgccctacttta 60
actgaaccccccacctcgacaaacagcgaatgcacacacggcgaaaaaggcctgacctgt 120
aaaaaaacatatctatga 138
<210>22
<211>132
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen22
gtggagtatccggcgaagcgccatattcgcccggaagtcagggcgttttctcagaacctg 60
cctgtagtagttctttcgccattgtgggttggccgcaagccaagcccgatgggtgattgc 120
ctgctgcgctga 132
<210>23
<211>132
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400> Gen23
tgggggaaccacaatggcgttttcatgggcgacggctacacggttggcaggagcgagcg 60
cggctcgcaggcgttgcggatttcggcacaggcaaaaacagggcaacccgaggggcgccc 120
tgcctatgctga 132
<210>24
<211>126
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400> Gen24
atggccaacgccaccttgggtcaccccgaggcgttcggccagtttctcctgcgtgaggcc 60
cagctcgcgcattctggctttcgccagttcattccattttttcatcgctggcacgatacg 120
gactga 126
<210>25
<211>126
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400> Gen25
gtggatcaccggtgtggactccttgaggtgagggatgcagctttttattgtgcgaagcgg 60
tgttttcttgtgaggacacatctctggccgcagaaccttttgtccaggccaaaaaaaagc 120
cgctga 126
<210>26
<211>126
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen26
ttggacattggcatagaggtgttgctgttacagagcgtgtgtggcaagcaacacatgaag 60
aaattgctgagttactggatgcttcagggattgctagccgtgatgcagaccaccttcaaa 120
agctaa 126
<210>27
<211>126
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen27
ttgagcggcggtcatggtgaactccacagcgaactgatcacggaatgcgggcgcctcgct 60
gcgtgcagcggggcccgtcggttatctgtgagggacagtaatgcgcctggaagtgaggct 120
caatga 126
<210>28
<211>126
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen28fig|6666666.276201.peg.312
atgcaccacaattttgggca ggctgccgtt ctcaaatcgaatggtctggtcaccggcaaa 60
cttgaagccc gtggccatgg cgatgctgcc tgcctggcctcgcaagaggtgcgtgttgtg 120
tattga 126
<210>29
<211>123
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen29fig|6666666.276201.peg.4067
gtgcagcgggtggtgttcaggtggctcgtagcttgtcgccaggcgccggccggtgcaagg 60
gcaacgcagcgctggccgacgtcaggctatcggccggatgcccgcgtagttaatagtggc 120
tga 123
<210>30
<211>123
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen30fig|6666666.276201.peg.5179
ttgaactcctgcccgcgagagaaattcacgggcttcttcaacctgatatcgcttggcctc 60
tttgcctgggtgcgggcggtggcagcgccactgctgatcgcccagcaccagcttgagcct 120
tga 123
<210>31
<211>120
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400> Gen31fig|6666666.276201.peg.5272
ttgccggtgaaggattcggtgggattgccgcaaatatttggtgcgatcattcgccggcaa 60
ggccgtcccctgcaggcatttgcaggcacaaaaaaacccgccgaggcgggtttgatgtag 120
<210>32
<211>120
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen32fig|6666666.276201.peg.2055
ttggtacaggccgaagggaatcagcaggaggccgaaaccgaaggtcgcagtcgcaatgac 60
gatgcccgctgggatcgacgcaacgccaatcagaacgccggccaaaaaaccggatcgtga 120
<210>33
<211>120
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen33fig|6666666.276201.peg.3769
gtgcgtttctttctcgtggtccttgagggggataggctggggcatgtgcaggctcttgcg 60
gaaaacggatacaccaccggcctgggagcaggcagtgaacgggcgcgatggcgtgaatga 120
<210>34
<211>117
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen34fig|6666666.276201.peg.3932
ttgcttaaaccgagcgccatggcctgcatgccttggcgccgctggcccggcagcgaaacg 60
caacacgaacggaagccgaccgcaatcaagcagcttttgatagttggggaaggttga 117
<210>35
<211>117
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen35fig|6666666.276201.peg.4843
ttgcgcgccactggtggagaacaatcgctggaaaaaatctctcatcacacgcatcccaaa 60
acaggtagaccgatcgttctcggcaggcgcgtgaagtatgtgagatctgcgatataa 117
<210>36
<211>117
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen36fig|6666666.276201.peg.3663
atggttggtcgagggcacagcggtgcagcgcaaaggctgtgcaaaagcacaaagacagcg 60
tcctctggctcaaacagactcgtcatgacaactgcctcgacgcagttgcggcgataa 117
<210>37
<211>117
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen37fig|6666666.276201.peg.311
atgtgcatggcggctttgcagaaagggcagggcagcagttcgctgaccatctgttcggtg 60
ttgctggatcggttttctgtgggcatggggatacctcgctggatcgtctacagttga 117
<210>38
<211>117
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen38fig|6666666.276201.peg.3014
atgaggcccaagcatagtcaccggcccctgcgccggcaacgcccgctcctgcccggtttg 60
cgtcgcctgcaggcgctggcgttgccggcgaaggcgtcactggagatccttgcatga 117
<210>39
<211>114
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen39fig|6666666.276201.peg.2287
atgctctgcatgaggttcgacagcggcgctgatcatacttgtctccgtcccttgttctgc 60
gggcgtatcccacccgctgcatgtctgtactgttgttctcgctatgtcatgtga 114
<210>40
<211>114
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen40fig|6666666.276201.peg.470
ttgccagtggggtctgcgcgaatgcgcaatttcgcgctcaacgctagatggcgaatggag 60
gggtgtcaaatggccatgtcagccagcaatccgaagctcaatttgcgccgttga 114
<210>41
<211>114
<212>DNA (ADN)
<213>Pseudomonas palmensis
<400>Gen41fig|6666666.276201.peg.1618
atggcgaaaaaaggtgcaacggtgtcgcgcttggtcatggttgtctccctgttcaacccg 60
ccaagcctcgacagttgcccgccgcaagtcaagaaatggcaaagaagcgattga 114
Claims (12)
1.一种保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis，其是革兰氏阴性细菌类群、假单胞菌属的微生物，其特征在于，包含对应于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:41的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis，其特征在于，其能够在植物物种中刺激针对非生物胁迫的适应性代谢、通过诱导参与在消除胁迫情况期间产生的自由基的代谢来调节氧化反应、改善植物生长和生产。
3.根据权利要求2所述的保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis，其特征在于，其能够增加植物物种中ROS清除酶的活性。
4.根据权利要求2所述的保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis，其特征在于，其能够增加植物物种中负责ROS自由基生成的过量光合能量的耗散(NPQ)。
5.根据权利要求1所述的保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis，其特征在于，其能够刺激铁、磷和钾的吸收，改善矿物质营养。
6.保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis或者存在于负责动员不溶性铁的菌株的培养液的上清液中的铁载体的用途，按照权利要求1和2用于在任何类型的农业或林业作物中的应用，以便改善植物对任何非生物胁迫条件的适应性。
7.保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis或者存在于负责动员不溶性铁的菌株的培养液的上清液中的铁载体的用途，按照权利要求1和2用于在土壤或灌溉水中的高盐度条件下施用于任何植物物种。
8.保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis的用途，按照权利要求1和2用于在任何植物物种中施用，以便增加植物诸如拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的蔬菜以及植物果实诸如如黑莓、橄榄或西红柿的生产。
9.保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis或者存在于负责动员不溶性铁的菌株的培养液的上清液中的铁载体的用途，按照权利要求1和5用于在任何植物物种中施用以改善铁、磷和钾的矿物质含量。
10.根据权利要求6至9所述的保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis的用途，其作为任何细菌制剂的一部分，单独地或与其他生物体组合，并借助使细菌与植物的种子、根或地上系统接触的任何可用方法。
11.根据权利要求10所述的保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis的用途，其与荧光假单胞菌(CECT9015)组合，或者与荧光假单胞菌(CECT9015)一起作为任何制剂的一部分，用于改善对盐水胁迫的反应。
12.根据权利要求10所述的保藏号为CECT30222的细菌菌株Pseudomonaspalmensis的用途，其与氧化节杆菌(CECT30231)组合，或者与氧化节杆菌(CECT30231)一起形成任何制剂的一部分，用于改善有机农业和传统农业中铁、氮、磷和钾的矿物质含量。
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