JP2023552172A - 非生物的ストレスに対する植物適応代謝のシュードモナス・パルメンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｅｎｓｉｓ）ＢＢＢ００１刺激剤およびミネラル栄養の増強剤 - Google Patents

Abstract

グラム陰性細菌群、シュードモナス属の微生物であり、非生物的ストレスに対する植物適応代謝の刺激剤、ならびに鉄および他の栄養素における植物栄養の増強剤である、細菌株シュードモナス・パルメンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｅｎｓｉｓ）ＢＢＢ００１。ニコチアナ・グラウカ（キダチタバコ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ）の根圏から単離されたこの株は、全ゲノム配列決定によって形態学的、生化学的および遺伝的観点から特徴付けられ、新種として同定され、植物における酸化ストレスを減少させ、より高い産生を誘導し、非生物的ストレス条件への適応を改善する；例えば、水の不足または高い塩分濃度のために、それを単独でまたは他の株と組み合わせて使用して、農学的食品の対象となる植物種における植物の適応性を高め得る。さらに、それは鉄、リンおよびカリウムの栄養を強化することが可能であり、有機農業および従来の農業の両方において、バイオ肥料として使用もし得る。【選択図】なし

Description

本発明は、非生物的ストレスに対する適応を改善し、成長および収量を増加させるように酸化ストレスを減少させるために植物の処理に使用するための、シュードモナス属の新種としての細菌株シュードモナス・パルメンシス（ＢＢＢ００１研究室内コード）に関する。さらに、シデロフォアを産生し、植物の鉄栄養を改善し、鉄欠乏症状を回復させ、リンおよびカリウムなどの他の栄養素の動員を刺激し得るため、有機農業および従来の農業のためのバイオ肥料としても興味深い。

この株は、バレンシア大学のスペインタイプカルチャーコレクション（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＣＥＣＴ）に特許目的で寄託されており、番号３０２２２が割り当てられている。

上述の細菌株は、植物の適応代謝を刺激する様々な種類の製品の調製の基礎として使用し得るので、本発明は、農業食品バイオテクノロジーの分野、特に植物成長調節細菌の分野に含まれる。これらの製品は、水欠乏または過剰な土壌塩分などの種々の非生物的ストレス条件に対する植物の適応性を向上させる。

この株は、有機バイオ肥料の分野においても、一般に植物栄養を改善するために、より具体的には、特に塩基性ｐＨで、任意の細菌製剤中および特定の条件下で得られた細菌代謝産物の両方で土壌中の鉄分の取り込みを改善するために使用し得る。

さらに、本発明は新種に属する菌株であり、Ｂｅｒｇｅｙの「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、２００１年３月版の菌の指標化に用いられている用語に従えば、実施されたゲノム解析と合わせて、新規種に属する株であることから、本発明はシュードモナス属の菌種の一つに分類し得る。

植物成長促進細菌の作用機序は、以下の２つの種類：細菌またはその代謝産物が植物の代謝（ホルモン活性、適応機構の刺激）を変化させる直接的なもの、および植物の代謝を変化させることなく栄養素の取り込みまたは動員を促進するか、または植物上の病原性微生物の成長を防止する化合物を合成する間接的なものに要約し得る。本特許の場合、いずれも重要である。植物は、その寿命の間に直面しなければならない有害な状況への植物の適応に関連する、高度に誘導可能な二次代謝を有する。

シュードモナス属は土壌細菌の間で一般的である。２００１年３月版のＢｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌの分類法によれば、この細菌はドメインバクテリウム（Ｄｏｍａｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａ）、フィラムプロテオバクテリア（Ｐｈｙｌｕｍ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｃｌａｓｓ ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス目（Ｏｒｄｅｒ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、シュードモナス科（Ｆａｍｉｌｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ）に含まれる。シュードモナス属は土壌系において非常に一般的であり、様々な植物病害に対する防御細菌（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）として繰り返し記載されている。この群の細菌には、水に容易に溶解する蛍光性の黄緑色の顔料を産生するものがある。他の機能の中でも、これらの顔料はシデロフォア（微生物の代謝のために培地から鉄を捕捉し得る分子）として作用する。さらに、これらの顔料は、培地中に存在する化合物の異化を可能にする特定の酵素の合成のための誘導可能なオペロンを含有する多数のプラスミドのために、大きな代謝汎用性を示す。種々の植物の根圏に存在するシュードモナス種は、植物の生理機能に有益に影響を及ぼし、根圏レベルでの植物によるその選択が非常に可能であることが示される。異なる植物の生理学に対するこの株の影響は、植物がその利益のためにそれらを選択することを示す。

シュードモナス属の株を単独でまたは他の生物と組み合わせて含有する組成物および製剤に関する文献には、植物の成長を刺激および改善するため、または植物衛生製品の製剤化の基礎として機能する、病原体に対する保護剤または作物の良好な成長を維持に関する多数の参考文献があり、そのうちのいくつかは特許されており、スペインの公開番号ＥＳ２７０７８０７－Ｔ３、２０１９－０４－０５を有する欧州特許は、植物の出芽および成長を刺激するためのシュードモナス・アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）種の新規蛍光シュードモナス・フルオレッセンス（Ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を、およびＥＳ２６２４７８８－Ｔ３、２０１７－０７－１７は、病原性細菌の生物学的培養、および病原性細菌の生物学的制御のためのアンタゴニストとしてのこの培養物の使用であり、また、国内特許ＥＳ２５７２７４６，２０１６－０９－２１はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）を含む植物成長促進組成物を得るための手順およびその使用に関する。

この特許出願では、新しい技術により、その固有の遺伝的特徴に基づいて、新規の種であるシュードモナス・パルメンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｅｎｓｉｓ）ＢＢＢ００１を同定することが可能になっており、これにより、ＢＢＢ００１のゲノムをシュードモナスの２５４個の完全かつ利用可能なゲノムと比較した場合に、他のシュードモナス株と区別される。

新種の同定を可能にするパラメータは、ｉ）平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）および平均アミノ酸同一性（ＡＡＩ）のいずれかであり、新種を定義する閾値は９５％未満であること；ｉｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡデジタルハイブリダイゼーション（ｄＤＤＨ）であり、閾値は７０％未満であること；ｉｉｉ）グアニン－シトシン含量（Ｇ＋Ｃ）、閾値は１％超であること；ｉｖ）テトラヌクレオチド使用頻度相関指数（ｔｅｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｕｓａｇｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ、ＴＥＴＲＡ）、閾値は０．９９未満であること；ｖ）多座配列分析（ＭＬＳＡ）であり、閾値は９７％未満であることのいずれかである。

ＢＢＢ００１ゲノムを２５４の利用可能なゲノムと比較すると、シュードモナス・アルキルフェノリカが最も近い種であり、ＡＮＩおよびＡＡＩ値はそれぞれ８３．３９％および８５．１１％であり、両方とも９５％未満であり、ＤＮＡ－ＤＮＡデジタルハイブリダイゼーション（ｄＤＤＨ）値は２７．１０％で７０％未満であり、グアニン－シトシン（Ｇ＋Ｃ）含有量は３．４３％で１％超であった。この分析において最も類似する種であるシュードモナス種ＮＺ ＣＰ０２４４７８．１（ＨＬＳ－６株）シュードモナス種に対する４ヌクレオチド使用頻度相関指数（ＴＥＴＲＡ）値は０．９８３であり、０．９９から低下した。一方、選択した遺伝子の多座配列解析（ＭＬＳＡ）による系統解析および種の区分け（１６Ｓ ｒＲＮＡ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ ｒｐｏＤ）では、本解析で最も類似する種であるシュードモナス・ジャポニカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）に対して最も類似度の高い推定値は９１．５２％であり；９７％未満の値は、それが新種であることを示す。全てのシュードモナス属ゲノム（コアゲノム）によって共有される遺伝子セットにおける一塩基多型（ＳＮＰ）の系統樹から、そのコアゲノムが５８５の遺伝子ファミリーからなり、この群の全遺伝子ファミリー含有量のわずか０．０５％を占めることが明らかになり、これは新種としてのその同一性を補強する値である。最後に、パンゲノムにおける相同遺伝子ファミリーの有無に基づく系統樹は、ＳＮＰ分析から得られた結果と非常に類似した結果をもたらす。実現方法の節の表２および表３は、新種とそれに最も類似するものとの間の類似性のすべての結果を示す。

したがって、多相的アプローチに基づいて新種が記載され、シュードモナス・パルメンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｅｎｓｉｓ）種ｎｏｖ（ＣＥＣＴ寄託番号０３０２２２）という名称が提案されている。この株の生理学的特徴および遺伝子解析により、この株が明確に同定され、シュードモナス属の他の種と区別することが可能になる。

シュードモナス・パルメンシス株は、植物に対するその有益な効果を特徴とし、その特徴は、ストレスの多い状況で産生されたフリーラジカルの除去に関与する代謝を誘導し、レドックス代謝の恒常性の機構およびこれらの条件下での水ポテンシャルの上昇を通してこれらの条件への植物の適応を改善し、この株が水バランスを誘導する能力の明確な指標であり、その結果、植物が水ストレス条件に抵抗する能力が高まる。他方で、植物の第二鉄栄養を改善し得、その成長をも改善する。

新規な種であるため、報告された効果のいずれについてもシュードモナス・パルメンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｅｎｓｉｓ）についての特許はない。シュードモナス属に関して、シデロフォアを産生し、酸化ストレスに関与する代謝を調節する能力を記載するいくつかの刊行物がある（Ｂａｒ－Ｎｅｓｓら，１９９１，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｉｒｏｎ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，２７１－２８１；Ｗｅｇｅｒら，１９８８，ＤＯＩ：１０．１１２８／ｊｂ．１７０．１０．４６９３－４６９８．１９８８；Ｇｈｏｓｈら，２０１８，ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１３２１３－０１８－１３６６－７；Ｖｉｖｅｓ－Ｐｅｒｉｓら，２０１８，ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２９９－０１８－２３２８－ｚ）。上記の基準に基づいて提案された新種に最も類似するシュードモナス株では、Ｐ．アルキルフェノリカ、Ｐ．ジャポニカまたはシュードモナス種ＮＺ ＣＰ０２４４７８．１（ＨＬＳ－６株）について、本発明の適用分野においてこれらの種に関する特許または刊行物はない。Ｐ．ジャポニカについては、工業用の油分解に関連する情報があり（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｎｏｖｅｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｈａｔ ａｓｓｉｍｉｌａｔｅｓ ｓｔｒａｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌｐｈｅｎｏｌｓ．ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＥＮＥＲＡＬ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ２００８ ５４；１、この論文における株番号：ＴＩＳＴＲ １５２６）、軟体動物のあらゆる表面への付着を防止する能力を有する（ＷＯ２０１４１４９３２４Ａ１）は、本発明が言及する農業食品分野とは関係ない。

本明細書に記載され、先行技術を考慮して、特許権に値するのに必要な新規性および進歩性の条件を満たすと理解される本発明の目的は、植物における非生物的ストレスへの適応代謝を刺激する能力、ストレスの多い状況で産生されたフリーラジカルの除去に関与する代謝を誘導することによって酸化ストレスを軽減する能力、植物のこれらの条件へのレドックス代謝のホメオスタシスを通じて植物のこれらの条件への適応を改善する能力、ストレスの多い状況で産生されたフリーラジカルの除去に関与する代謝を誘導することによって酸化ストレスを軽減する能力、成長および産生が刺激されるようなレドックス代謝のホメオスタシスを通じて植物のこれらの条件への適応を改善する能力を有するとともに、特に鉄栄養のための栄養素の動員のための用途を有する、グラム細菌群、シュードモナス属に属する微生物に属する、細菌株シュードモナス・パルメンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｅｎｓｉｓ）ＢＢＢ００１（ＣＥＣＴ３０２２２）の単離および特徴付けである。

この記述的報告の最後に組み込まれるＷＩＰＯ ＳＴ．２５規格に従って配列決定されたゲノムを有するこの株の生理学的特徴および遺伝子分析により、この菌株が明確に同定されることが可能となり、シュードモナス属の他の種と区別される。

キダチタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ）の根圏の細菌スクリーニングでは、シュードモナス属に属する株が単離され、遺伝子分析により、この属の既知の種のいずれにも配置し得なかった。

単離した後、シュードモナスＢＢＢ００１の特有な遺伝子レパートリーの特徴づけを行った。２５４個の完全ゲノムの比較分析において、ＢＰＧＡプログラムにより、シュードモナスＢＢＢ００１に固有に存在する合計４８９個の遺伝子が同定され、そのうち４１個の遺伝子が特定のサブシステムに関連していた。シュードモナスＢＢＢ００１の４１個の特有の遺伝子の中で、鉄の取り込みおよび代謝に関連するもの、ならびにアミノ酸および誘導体の合成に関連するものは、それらの存在量の多さが際立っている。この配列表の配列番号１～４１に相当する４１個の遺伝子は、工業的規模で物質または化合物を製造するための製剤をコードする能力を有しており、株から生物学的材料を含有する製品を得るための異種発現に使用し得る。

それらの特性評価後、いくつかの試験を実施して、適応代謝を誘導し、酸化ストレスを低減し、植物の成長を促進する潜在的能力、および第二鉄栄養を改善する能力を示す生化学的活性を明らかにした。これらは、オーキシン産生、１－アミノシクロプロパン－１－カルボキシレートの分解、リン酸塩可溶化ならびにシデロフォアおよびキチナーゼの産生であり、インビトロでのオーキシンおよびシデロフォア産生に対して陽性となった。ＢＩＯＬＯＧ Ｅｃｏのプロファイルは、トリカルボン酸リンゴ酸、ヒドロキシ酪酸およびグルコサミン酸を分解することができ、１Ｐ－グルコース、セロビオース、ラクトースおよびＮ－アセチルグルコサミンの分解が糖の中で際立っていることを示している。窒素源として、プトレシン、フェニルエチルアミン、セリンおよびＬ－グリコール－Ｌ－グルタミン酸を使用する。

これまで、酸化ストレスおよび植物の酸化還元バランスの制御に関連する酵素の代謝プロファイル、ならびに植物の成長および産生を刺激する可能性の指標としての蛍光に関連する光合成パラメータの改変、ならびに植物の酸化還元バランスへの影響の結果としての植物の健康状態を特徴とする、モデル植物（シロイヌナズナ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）にシュードモナス・パルメンシスの直接接種する実験が行われてきた。

さらに、生産用温室で生育するブラックベリー植物（Ｒｕｂｕｓ ｓｐ．Ｖａｒ Ｌｏｃｈｎｅｓｓ）に直接接種を行った。総蓄積産生量を決定し、ブラックベリーの葉における酸化ストレスの制御に関連する酵素の代謝プロファイルを、産生サイクルの６ヶ月間の１ヶ月当たり２回の施用で、サイクルの２つの時点（開花および完全産生）で決定した。

種々の植物種で行われたこれら２つの実験により、細菌が、１）ＲＯＳ捕捉酵素、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはカタラーゼ（ＣＡＴ）の活性の上昇、および２）通常の条件下でのＲＯＳフリーラジカル（非光化学的消光、ＮＰＱ）の生成に関与する過剰な光合成エネルギーの散逸の増加を通じて、酸素フリーラジカル（ＲＯＳ）を除去する能力を増大させることによって、非生物的ストレスへの植物の適応に関与する代謝を調節し、酸化ストレスを制御し得ることが実証されている。

トマト植物における塩分ストレス条件に対する適応代謝を刺激する能力を実証するために、別の実験を行った。この株は、対照と比較して水ポテンシャルの実質的な改善を誘導し、適合性の浸透圧調節物質であるプロリン含有量をわずかに増加させた。これらの条件下での水ポテンシャルの上昇は、この歪みが水バランスを誘導し、その結果、植物が塩分または水ストレス条件に耐える能力が向上したこと示している。

集約的灌漑システムでの生産中のオリーブの木で行われた別の実験では、通常の灌漑条件下で灌漑の２５％の減少で生産を増加させる能力を評価するために、ＢＢＢ００１を用いた実験が行われた。収穫前のサンプリングでは、本発明者らは、標準的な灌漑条件下および減水下で対照と比較して、果実の平均新鮮重量が４０％を超えて増加することを見出した。一方、根レベルでＢＢＢ００１で処理した植物の果実重量は、両方の灌漑計画で同じ値に達した。

一方、トマト植物における鉄欠乏萎黄病の回復について実験を行った。これらの実験は、鉄欠乏が誘導され、Ｆｅの不溶化を確実にするために基質を塩基性ｐＨに調整したトマト植物にシュードモナス・パルメンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｅｎｓｉｓ）を直接接種することによって行った。本発明者らはまた、特定のシデロフォア産生培地（改変コハク酸培地）中で増殖させた株を株と共に試験し、代謝液体のみも試験した。全ての処理で同様の結果が得られ、鉄、リンおよびカリウム含有量の改善、光合成の改善、光合成色素の増加し、したがって成長の改善（乾燥重量の増加）に対する効果が強調された。

植物における非生物的ストレスへの適応の代謝を刺激する能力、成長および産生が刺激されるようにＲＯＳ捕捉に関連する酵素の活性を上昇させることによって酸化ストレスを減少させる能力、ならびに栄養素の動員、特に鉄、リンおよびカリウムの栄養を刺激するので、バイオ肥料としての用途を有するシュードモナス・パルメンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｍｅｎｓｉｓ）ＢＢＢ００１の使用に関する実験は、この報告の最後に、それがどのように行われるかのセクションで行われる。

本発明の技術的利点を構成する本発明の最終的な目的は、植物における非生物的ストレスへの適応の代謝を刺激し、成長および産生を刺激するような方法で酸化ストレスを減少させる能力を改善する細菌（バイオ刺激剤／バイオ肥料）を有することである。一方、これは、任意の利用可能な手段によって細菌またはその部分のいずれかを植物と接触させ、特定の細菌種による効果を改善することによって、栄養素の動員、特に鉄、リンおよびカリウムの栄養を刺激するので、バイオ肥料としての用途を有する。

その結果、本特許出願は、塩分条件、生産の増加などの任意の非生物的ストレス条件に適応する植物の能力を高め、さらに植物の鉄、リンおよびカリウムミネラル栄養を改善するために、あらゆる種類の植物種における適用のための、シュードモナス・パルメンシスＢＢＢ００１株または株の培養ブロスの代謝産物の使用を主張する。

シュードモナス・パルメンシスＢＢＢ００１のそのような使用は、個々にまたは他の細菌種もしくは生物と組み合わせて、その菌株を有する任意の調製物の一部として、およびその細菌を植物の種子、根または空中系と接触させる任意の利用可能な手段によって行われ得る。

特に、シュードモナス・パルメンシスＢＢＢ００１の使用は、塩ストレスに対する応答を改善するために、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＣＥＣＴ９０１５と組み合わせて、またはこの他の株との任意の調製物の一部として適切であり、また、アルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＣＥＣＴコード３０２３１と組み合わせて、有機農法および従来の農法の両方において、鉄、窒素、リンおよびカリウムのミネラル栄養を改善する。

実現方法
本明細書に記載されるシュードモナス属の株は、Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ Ｇｒａｎ Ｃａｎａｒｉａ（カナリア諸島）の島のトランセクトにおけるキダチタバコの自然集団の根圏を研究することによって単離された。この植物種（キダチタバコ）はナス科に属し、活発な二次代謝を有し、農業において関心のある生物学的活性を有する微生物の良好な供給源であることが証明されているために選択された。

細菌株単離のための根圏サンプリングを、２０１７年１２月にキダチタバコの天然集団に対して行った。このサンプリングの結果、４５０株が収集され、そのうちシュードモナス・パルメンシス（ＢＢＢ００１、研究所内コード）が発見された。この株の単離は栄養寒天（ＰＣＡ）上で行った。

実験室では、この微生物は、－８０℃の栄養培地（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ）中の２０％グリセロールまたは－２０℃の水中の１５％グリセロールで高い生存率で維持され、２８℃の固相および液相の両方で単離に使用される培養培地で容易に収集される。

Ｉ．シュードモナス・パルメンシスＢＢＢ００１の形態学的、生化学的および遺伝的特徴。
株の特徴付けのために、種々の表現型特性を考慮し、この報告に以下を詳述する。すなわち、（ｉ）コロニー形態、（ｉｉ）細胞形態、（ｉｉｉ）代謝プロファイル、（ｉｖ）シュードモナスＢＢＢ００１株のゲノムおよびシュードモナス属に利用可能な完全ゲノムの比較分析。

表１は、標準寒天（ＰＣＡ）上での２８℃における２４時間のインキュベーション後のコロニー形態を示す。

液体環境（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ栄養培地）で増殖すると、この環境の色は増殖の指数期から増殖の静止期まで黄色に変化する。

標準寒天（ＰＣＡ）上で２８℃で２４時間インキュベートした後のシュードモナス・パルメンシスＢＢＢ００１の形態学的特徴は、グラム陰性桿菌に相当する。

内部参照コードＢＢＢ００１が単離され、特徴付けられた後、この細菌の可能性を実証するためにいくつかの試験が行われた。これらは、オーキシン産生、１－アミノシクロプロパン－１－カルボキシレートの分解、リン酸塩可溶化、ならびにシデロフォアおよびキチナーゼの産生であり、シデロフォア産生については肯定的な結果であった。

代謝プロファイリング（ＢＩＯＬＯＧ Ｅｃｏ、ｗｗｗ．ｂｉｏｌｏｇ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ｐｏｒｔｆｏｌｉｏ－ｏｖｅｒｖｉｅｗ／ｍｉｃｒｏｂｉａｌ－ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ－ａｎａｌｙｓｉｓ－ｗｉｔｈ－ｅｃｏｐｌａｔｅｓ／）は、トリカルボン酸：リンゴ酸、ヒドロキシ酪酸およびグルコサミン酸を分解することが可能であり、１Ｐ－グルコース、セロビオース、ラクトースおよびＮ－アセチルグルコサミンの分解が糖の中で際立っていることを示している。窒素源として、プトレシン、フェニルエチルアミン、セリンおよびＬ－グリコール－Ｌ－グルタミン酸を使用する。

シュードモナス・パルメンシス株ＢＢＢ００１の系統学的関係をシュードモナス属の他の種に関して調査し、その分類学的割り当てを定義するために、その完全なゲノムを、データベースにおいて利用可能で完全な２５４個のシュードモナスゲノムと比較した。以下の新規細菌種の定義基準に従って、３つの主な戦略を使用した。

１．ゲノム間の類似度の推定値：平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）、平均アミノ酸同一性（ＡＡＩ）、インシリコＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｄＤＤＨ）、グアニン－シトシン含有量の差（Ｇ＋Ｃ）およびテトラヌクレオチド使用頻度（ＴＥＴＲＡ）：
・ＡＮＩおよびＡＡＩ値は、２つのゲノム間の進化的距離のロバストな尺度を表す；これらの値が９５％未満である場合、新種であると想定される。９５～９６％のＡＮＩおよびＡＡＩ値は、原核生物種を限定するために一般的に使用される別のパラメータである７０％のＤＤＨ（ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション）値と同等であることが経験的に証明されている（例えば、ＫｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓおよびＴｉｅｄｊｅ ２００５，ＰＮＡＳ １０２：２５６７－２５７２；ＲｉｃｈｔｅｒおよびＲｏｓｓｅｌｌｏ－Ｍｏｒａ ２００９，ＰＮＡＳ １０６：１９１２６－１９１３１；Ｋｉｍら，２０１４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６４：３４６－３５１）。
・Ｇ＋Ｃ含有量の種内差は一般に１％以下である；Ｍｅｉｅｒ－Ｋｏｌｔｈｏら、２０１４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６４：３５２－３５６）。
・ｄＤＤＨ指数は、従来のＤＤＨ値と高い相関を示している（Ａｕｃｈら，２０１０，Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２：１）。したがって、ｄＤＤＨ値が７０％を超えると、比較されたゲノムが同じ種に属することを示すと考えられる。
・ シュードモナスＢＢＢ００１のゲノムと２６個の最も密接に関連するゲノムとの間のＴＥＴＲＡ値。近縁種株のゲノムは、類似するテトラヌクレオチド使用頻度を示すと予想され、相関指数（ＴＥＴＲＡ）は０．９９以上であるので、０．９９未満のＴＥＴＲＡ値は、新種を示すと考えられる（Ｔｅｅｌｉｎｇら，２００４，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６：９３８９４７；ＲｉｃｈｔｅｒおよびＲｏｓｓｅｌｌｏ－Ｍｏｒａ ２００９，ＰＮＡＳ １０６：１９１２６－１９１３１）。

２．多座配列分析（ＭＬＳＡ）に基づく系統解析および種の区切り：
・１６Ｓリボソーム遺伝子（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の配列決定は、現在の細菌種分類システムにおける基本的なツールである。一般に、２つの異なる種は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子についての類似性価が９８．６５～９９％未満であると考えられている（Ｋｉｍら，２０１４，ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６４：３４６－３５１）。しかしながら、多くの場合、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解像力には限界がある場合がある。一方で、この遺伝子は、近縁種を識別する能力が低い可能性がある。一方、ＤＤＨ値に基づいて明らかに異なるにもかかわらず、非常に類似した１６Ｓ ｒＲＮＡ配列（９９％未満）を示す種がある（Ａｓｈら，１９９１，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４１：３４３－３４６；Ｒｏｓｓｅｌｌｏ－Ｍｏｒａ ａｎｄ Ａｍａｎｎ ２００１，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２５：３９－６７）。シュードモナス属の具体的な場合には、Ｍｕｌｅｔらは、種を区切るか、新しい株を同定するか、またはこの群内の系統関係を解決するために、３つの追加の遺伝子（ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢおよびｒｐｏＤ）の分析を推奨している（Ｍｕｌｅｔら．２０１２ａ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５：４５５－４６４；Ｍｕｌｅｔら，
２０１２ｂ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５：１４５－１４９；Ｓａｎｃｈｅｚら，２０１４，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７：８９－９４）。Ｍｕｌｅｔらは、シュードモナス属内のこれら４つの遺伝子のＭＬＳＡに基づいて、種の区切りの基準として９７％の平均類似性を確立した（Ｍｕｌｅｔら，２０１０，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：１５１３－１５３０）。

３．ゲノムの保存された部分（コアゲノム）中の変異（一塩基多型、ＳＮＰ）の同定および全ゲノム中の遺伝子の有無に基づく、全ゲノムレベルでの系統解析：
・全てのシュードモナスゲノム（コアゲノム）によって共有される遺伝子セットにおけるＳＮＰ（一塩基多型）の系統樹、およびパンゲノムにおける相同遺伝子ファミリーの有無に基づく系統樹。細菌ゲノムの配列決定および比較の進歩により、属内の異なる種、さらには同じ種の異なる株の遺伝子含有量の予想外のばらつきがあることが明らかになった。例えば、大腸菌株のゲノムは、４０％しか遺伝子を共有していなかった（Ｒａｓｋｏら，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９０：６８８１－６８９３）。これは、所与の群内のすべての細菌種によって共有される遺伝子のセットを定義するためのコアゲノムの概念の定式化をもたらした。群の１つ以上のメンバーには存在せず、したがってコアゲノムの一部を形成しない遺伝子は、アクセサリー遺伝子と呼ばれる。最後に、完全な遺伝子レパートリー（すなわち、コアゲノムおよびアクセサリー遺伝子の合計）をパンゲノムと命名した。

最後に、シュードモナスパンゲノム分析の結果として、シュードモナス株ＢＢＢ００１に存在する特有の遺伝子のレパートリーを特徴付けた。

１．ゲノム間の類似度の推定値。
１．１．パラメータ平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）および平均アミノ酸同一性（ＡＡＩ）：
この解析の最初の工程は、シュードモナスＢＢＢ００１のゲノムを、シュードモナス属のＲｅｆＳｅｑデータベース（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ）で利用可能なすべての完全ゲノムと塩基レベルおよびアミノ酸レベルで比較することである。

ヌクレオチド同一性指数（ＮＩＡ）の推定値を、ＯＡＵ．ｊａｒプログラムを用いて算出した。

アミノ酸含有量（ＡＡＩ）の比較にはツールＣｏｍｐａｒｅＭ ｖ０．０．２３（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｄｐａｒｋｓ１１３４／ＣｏｍｐａｒｅＭ）を使用した。このツールにより、相同遺伝子を同定し、それらの間の同一性を算出する。

１．２．ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション・インシリコ（ｄＤＤＨ）およびＧ＋Ｃ含有量：
前のセクションの結果に基づいて、ＡＮＩ値の分布の４番目の四分位に位置する２６個のゲノム（すなわち、予測可能に、シュードモナスＢＢＢ００１に最も密接に関連しているもの）を選択し、ウェブサーバーＧＧＤＣ（ゲノム間距離計算機）を使用して、ゲノム間距離およびｄＤＤＨ指数を算出した。このサーバはまた、分析されたゲノムのＧ＋Ｃ含有量の差を算出する。

１．３．テトラヌクレオチド使用頻度（ＴＥＴＲＡ）：
ＪＳｐｅｃｉｅｓソフトウェア（ＲｉｃｈｔｅｒおよびＲｏｓｓｅｌｌｏ－Ｍｏｒａ ２００９，ＰＮＡＳ １０６：１９１２６－１９１３１）を使用して、シュードモナスＢＢＢ ００１ゲノムと２６の最も密接に関連するゲノムとの間のテトラヌクレオチド使用プロファイルの差を算出した。

２．多座配列分析（ＭＬＳＡ）に基づく系統解析および種の区切り。
２６個のゲノムのサブセットに対しても行われた多座分析では、シュードモナス属の種の区切りに推奨される４つのハウスキーピング遺伝子：１６Ｓ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｐｏＢが含まれていた（例えば、Ｍｕｌｅｔら，２０１２ａ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５：４５５－４６４）。

－１６Ｓ：自作のｂａｓｈスクリプト作成パイプラインを使用して、分析した全ゲノムのそれぞれにおいてこの遺伝子の複数のコピーを抽出した。これらのコピーは、各可変位置が曖昧なものとして表されるコンセンサスにまとめられた。

－ｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｐｏＢ：ｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｐｏＢ遺伝子を、ＢＷＡ０．７．１２（ＬｉおよびＤｕｒｂｉｎ ２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：５８９－５９５）を使用した参照に対するマッピングによって問題の全ゲノムから抽出した。

さらに、得られた系統樹を、Ｍｕｌｅｔらが、シュードモナス・アルキルフェノリカの系統樹的位置を調べる際に得られた系統樹と比較するため（Ｍｕｌｅｔら，２０１５，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６５：４０１３－４０１８）、同著作で用いられた、ゲノムが完全に公開されていない他の１３種または菌株の配列も解析対象に含めた。

上記の各遺伝子について、全配列のアラインメントを、Ｍａｆｔ ｖ７．３１０プログラムを用いて実施した（Ｋａｔｏｈら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９－３０６６）。４つのアラインメントのそれぞれにおいて、不明瞭であった領域（すなわち、いくつかの配列において欠けている領域および／またはミスアライメントされている領域）が除去された。

最後に、４つの遺伝子を連結し、ＰａｒｔｉｔｉｏｎＦｉｎｄｅｒ２（Ｌａｎｆｅａｒら，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２９：１６９５－１７０１）を使用して各遺伝子について最適な適合ヌクレオチド置換モデルを推定した。ＭｒＢａｙｅｓ ｖ３．２（Ｒｏｎｑｕｉｓｔら，２０１２，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６１：５３９－５４２）を使用して系統樹を得た。

シュードモナスＢＢＢ００１と残りの種または株との間のこれら４つの遺伝子の類似性の試験も、距離計算機と呼ばれるＢｉｏｐｙｔｈｏｎモジュールを使用して行った。１６Ｓ遺伝子の場合、多重コピー遺伝子であるため、各コピーについて得られた平均類似度を算出した。

３．全ゲノム配列に基づく系統解析。
ＢＰＧＡソフトウェア（Ｃｈａｕｄｈａｒｉら，２０１６，Ｓｃｉｅｎｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６：２４３７３）を使用して、２５３の完全なシュードモナスゲノムとシュードモナスＢＢＢ００１の注釈付き遺伝子の相同性クラスタリングを行った。クラスタリングの閾値は５０％の相同性で、相同な遺伝子だけでなく、同じファミリーに属する可能性のある遺伝子もクラスタリングし得る。ＢＰＧＡは、解析された全てのゲノム（コアゲノム）によって共有される遺伝子ファミリー、付属遺伝子、およびさらに固有の機能、すなわち作成されたクラスターのいずれにもグループ化されていない遺伝子を同定する。

３．１．コア遺伝子に存在するＳＮＰ（一塩基多型）の系統樹：
最初に、ＢＰＧＡによってコアゲノムとして同定された遺伝子に関連するヌクレオチド配列を抽出するために、自作のｂａｓｈスクリプトパイプラインを設計した。

これらの配列の遺伝的距離を距離計算機を使用して分析し、Ｍａｆｔ ｖ７．３１０（Ｋａｔｏｈら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９－３０６６）を使用してコア遺伝子のそれぞれについてアラインメントを作製した。最後に、ギャップ内容情報を生成されたアラインメントから抽出して、低品質のアラインメントを同定した。

ＳＮＰの研究では、抽出された全ての位置が相同位置であることを確実にする必要があるため、５０％を超える距離を有する配列を含み、配列長の１０％を超えるギャップ含有量も含む遺伝子は除外された。

Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｖ１０．２．２（Ｋｅａｒｓｅら，２０１２，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８：１６４７－１６４９）を使用して、１０％を超える配列がギャップを有する位置を除去し、最後にＰＨＹＬＩＰ形式でＳＮＰを抽出した。

ＲＡｘＭＬ ｖ８．２．９ソフトウェア（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ ２０１４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０：１３１２－１３１３）を使用して、全ての連結されたＳＮＰの最尤系統樹を作成した。各ノードのサポートは、１０００回のブートストラップ複製を実行することによって算出した。

３．２ パンゲノムにおける遺伝子または遺伝子ファミリーのマトリックス的存在／非存在の系統樹：
ＢＰＧＡによって作成された遺伝子存在／不在マトリックスを使用して、ＩＱＴＲＥＥ（Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒら，２０１６，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６５：９９７－１００８）を使用して最尤系統樹を再構築した。１０００回のブートストラップレプリケートを実行することによって、各ノードのサポートを算出した。

４．シュードモナスＢＢＢ００１の特有の遺伝子レパートリーの特性評価。
同定された特有の機能が以前に記載されていないかどうかを判定するために、ＮＣＢＩ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースコレクションで利用可能なｎｒ（非冗長）タンパク質データベースのローカルデータベースを作成し、ＢＬＡＳＴ＋２．６．０プログラム（Ｃａｍａｃｈｏら，２００８，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １０：４２１）を使用してそれらを検索した。

ｂａｓｈ言語で書かれたスクリプトの自作のパイプラインを使用して、実行された検索で得られた最初の一致から関連情報を抽出した。特有の遺伝子は、添付ファイルとして提示される。

５．結果の考察。
本発明者らの株を２５４個のシュードモナスゲノムと比較することによって得られた結果であって、本発明者らがそれを新種であるシュードモナス・パルメンシスＢＢＢ００１として同定することを可能にした結果を以下に示し、全ての値は、利用可能な最も類似した種との比較の結果である。したがって、その特有の遺伝的特徴は、シュードモナス・アルキルフェノリカに関して、ＡＮＩおよびＡＡＩ値はそれぞれ８３．３９％および８５．１１％であり（表２）、推定ｄＤＤＨ値は２７．１０％であり、Ｇ＋Ｃ含有量は３．４３％の差を示す（表２）。この分析で最も類似した種のシュードモナス種ＮＺ ＣＰ０２４４７８．１（ＨＬＳ－６株）と比較して、０．９８３のＴＥＴＲＡ値も示す（表２）。

表２は、ゲノム間の類似度の推定結果を示す。各ゲノムについて、その長さ（塩基対、ｂｐ）、アノテーションされた遺伝子の数、ならびにシュードモナスＢＢＢ００１のゲノムとの比較で推定されたＡＮＩ、ＡＡＩ、ｄＤＤＨ、ゲノム間距離、Ｇ＋Ｃ含有量の差およびＴＥＴＲＡインデックスの値を特定する。１列目には、種名の後にＲｅｆＳｅｑゲノム寄託番号が記載されている。

１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＭＷ００９７０２に寄託された配列）のＭＬＳＡ解析における類似性推定値は、同じ種に含まれる閾値に近いまたはそれを超える９８．５２％～９９．４２％の値をもたらしたが、ＭＬＳＡに含まれる他の３つの遺伝子の類似性値は、シュードモナス属内のこれら４つの遺伝子のＭＬＳＡに基づく種の区切りについてＭｕｌｅｔらによって確立されたかなり低い（９１．５２％、この分析で最も類似した種であるシュードモナス・ジャポニカに関して、表３）９７％未満である。

表３は、ＭＬＳＡに含まれる４つの遺伝子のそれぞれについての類似性の割合、および４つの遺伝子について一緒に算出された平均類似度を示す。

全てのシュードモナスゲノム（コアゲノム）によって共有される遺伝子のセットにおけるＳＮＰの系統樹。シュードモナス属に利用可能な２５４の完全ゲノムおよびシュードモナスＢＢＢ００１のゲノムについて、ＢＰＧＡソフトウェアを用いて比較したところ、そのコアゲノムが５８５の遺伝子ファミリーからなり、この群の全遺伝子ファミリー含有量のわずか０．０５％を占めることが明らかになった。コアゲノムファミリーの大部分は、翻訳およびリボソーム生合成、またはアミノ酸代謝および輸送の機能に関連している。

コアゲノムファミリー群からオーソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子（２７５個の遺伝子）を抽出した後、２５４個のゲノムにおいて合計１６４３９４個の多型位置（一塩基多型、ＳＮＰ）が同定された。ＳＮＰに基づいて、Ｇｏｍｉｌａらによって（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６：２１４）に２０１５に提示されたシュードモナス属の系統発生と広く一致する５つの主要な異なる群が得られる。すなわち、
・ 緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、Ｐ．クナックムッシイ（Ｐ．ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ）、ｐ．シトロネロリス（Ｐ．ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）の群（１０２ゲノム）、
・ Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）の群であり、Ｐ．バレアリカ（Ｐ．ｂａｌｅａｒｉｃａ）もこれに属する。（１１ゲノム）
・ Ｐ．アミグダリ（Ｐ．ａｍｙｇｄａｌｉ）、Ｐ．サバスタノイ（Ｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、Ｐ．ビリジアバ（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉａｖａ）ｙ Ｐ．シコリイ（Ｐ．ｃｉｃｈｏｒｉｉ）も含むＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）の群。（２２ゲノム）
・ Ｐ．マンデリイ（Ｐ．ｍａｎｄｅｌｉｉ）、Ｐ．コリーンシシス（Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓｉｓ）、Ｐ．ブラシカセアラム（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、Ｐ．プロテゲンス（Ｐ．ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ）ｏ Ｐ．フラギ（Ｐ．ｆｒａｇｉ）などの他の種を含むＰ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の群。（５７ゲノム）
・ Ｐ．プチダの群であり、その中にシュードモナスＢＢＢ００１を見出し得る。（４３ゲノム）
・他の群：（１９ゲノム）

Ｐ．プチダ群には、解析された２５４個の完全なゲノムのうち、データベースで利用可能なものが４３個含まれている。Ｐ．プチダに属する全てのゲノムに加えて、Ｐ．モンテイリーまたはＰ．パラフルバなどの他の種がこの群に見られる。ＭＬＳＡの結果と一致して、シュードモナスＢＢＢ００１は、種Ｐ．アルキルフェノリカおよびシュードモナス種ＮＺ ＣＰ０２４４７８．１（ＨＬＳ－６株）と統計的に十分に裏付けられたサブグループを形成する。このサブグループ内では、種Ｐ．ジャポニカおよびＰ．ブラノベンシスは完全なゲノムを公開されておらず、コアゲノム分析に含まれていないため、ＭＬＳＡの結果との直接的な比較はできない。しかしながら、ＭＬＳＡの系統樹では、他の種と比較してシュードモナスＢＢＢ００１の系統的位置を解明しなかったが、ＳＮＰの系統樹はより大きな解像度が提供され、このサブグループの基礎系統としてシュードモナスＢＢＢ００１が回復した（すなわち、シュードモナスＢＢＢ００１は、Ｐ．アルキルフェノリカおよびシュードモナス種ＨＬＳ－６株から最初に分岐した）。

パンゲノムにおける相同遺伝子ファミリーの存在または非存在に基づく系統樹。２５４個のゲノムの比較解析により、パンゲノムに合計６５１３７個のアクセサリー遺伝子ファミリーが存在することが明らかになった。各ゲノムにおける遺伝子の有無に関する情報をバイナリーマトリックスに変換した。

一般に、パンゲノム中の遺伝子の有無に関する情報から得られた系統樹は、ＳＮＰ解析に基づいて得られた系統樹と類似していたが、いくつかの有意差が認められた。例えば、ＳＮＰ系統樹によれば緑膿菌よりもＰ．プチダ群に近いＰ．スタッツェリ群は、基礎群として現れ、そのアクセサリー遺伝子含有量に基づいて分析された全ての群の中で最も多様である。

全ゲノム系統発生において、シュードモナスＢＢＢ００１はまた、Ｐ．プチダ群の一部であり、Ｐ．アルキルフェノリカおよびシュードモナス種ＮＺ ＣＰ０２４４７８．１（ＨＬＳ－６株）と統計的に十分に裏付けられたサブグループを形成する。この場合、ＳＮＰの系統樹とは対照的に、解析は、有意な支持値で、シュードモナスＢＢＢ００１とシュードモナス種（ＨＬＳ－６株）とのより近い関係を確立する。したがって、シュードモナスＢＢＢ００１のアクセサリー遺伝子レパートリーは、Ｐ．アルキルフェノリカよりもシュードモナス種（ＨＬＳ－６株）のアクセサリー遺伝子レパートリーに類似している可能性が高い。

ＩＩ．シュードモナス・パルメンシスの非生物的ストレスに対する植物適応代謝の刺激剤として、および鉄栄養の促進剤としての証拠。
１．モデル植物（シロイヌナズナ）へのシュードモナス・パルメンシスの直接接種実験。実験室において、ランダム化ブロックモデルを用いて、合計４２個の植物およびＮ＝３について、光、湿度および温度の制御された条件下で実施－この株の細胞懸濁液を発芽前のシロイヌナズナに接種し、発芽後２週間および５週間に植え付けた。６週間で蛍光光合成パラメータ（Ｆ０、Ｆｖ／Ｆｍ、ＰＳＩＩ、ＮＰＱ）を測定し、植物を収穫し、秤量し、ＲＯＳ捕捉に関連する酵素活性（ＳＯＤ、ＡＰＸ、ＣＡＴ）およびアスコルビン酸グルタチオンサイクル（デヒドロアスコルビン酸レダクターゼ－ＤＨＲ、モノデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ－ＭＤＨＲ、グルタチオンレダクターゼ－ＧＲ）について分析した。エネルギー散逸能力（非光化学的消光－ＮＰＱ）の有意な増加が観察され、酸化ストレス制御に関連する酵素の代謝プロファイルは、カタラーゼ（ＣＡＴ）およびグルタチオン還元酵素（ＧＲ）活性の有意な増加、ならびにＡＰＸ活性の減少からなっていた。生体重の増加が記録された。

２．生産用温室におけるブラックベリー（Ｒｕｂｕｓ ｖａｒ．Ｌｏｃｈｎｅｓｓ）へのシュードモナス・パルメンシスの直接植菌実験。実際の圃場生産条件下で、無作為化ブロック実験モデルを用いて、合計１２０株、ｎ＝３で実施した実験。株の細胞懸濁液を、６ヶ月の産生サイクルの間、１０月から３月まで月２回、根元に施用した。総生産量を収集し、完全開花および完全結実の２つのサンプリング時点を決定した。各時点で、光合成蛍光パラメータ（Ｆ０、Ｆｖ／Ｆｍ、ＰＳＩＩ、ＮＰＱ）を測定し、葉を収集し、ＲＯＳ捕捉に関連する光合成色素および酵素活性（ＳＯＤ、ＡＰＸ、ＣＡＴ）、ならびにアスコルビン酸－グルタチオンサイクル（デヒドロアスコルビン酸還元酵素－ＤＨＲ、モノデヒドロアスコルビン酸還元酵素－ＭＤＨＲ、グルタチオン還元酵素－ＧＲ）を分析し；抗酸化能（Ｂ－カロテン酸化を阻害する能力）および細胞の酸化状態の指標であるマロンジアルデヒド－ＭＤＡのレベルを評価した。非光化学的消光（ＮＰＱ）の有意な増加およびクロロフィルＢの減少が両方のサンプリング時間で観察された；酸化ストレス制御に関連する酵素の代謝プロファイルは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびモノデヒドロアスコルビン酸還元酵素（ＭＤＨＡ）活性の有意な増加、ならびにアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＡＰＸ）活性の減少と関連しており、これは抗酸化能の改善および果実結実時の対照よりもマロンジアルデヒドのレベルがわずかに低いことがわかった。果実収量の増加が記録された。

３．トマト（ｖａｒ Ｃａｓｉｌｌａｓ）の塩分条件下での適応代謝刺激実験。この実験は、無作為化されたブロックにまとめられた合計３３６個の植物、４つの処理、処理あたり３Ｒ、ｎ＝２８について、光、湿度および温度の制御された条件下、温室内で行った。トマトの種子を鉢で発芽させ、発芽後２、４および６週目に、細菌懸濁液を３回施用し；５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を一週間灌注し、通常の灌注をさらに一週間維持し、その後、Ｓｃｈｏｌａｎｄｅｒカメラで水ポテンシャルを測定し、根、空中部分の乾燥重量、および高さを測定した。高さおよび空中重量の有意な減少、水ポテンシャルの上昇、ならびに水ストレス耐性に関連する浸透圧物質であるプロリンの増加が観察された。この実験では、Ｐ．パルメンシスと別のシュードモナス、Ｐ．フルオレッセンスＣＥＣＴ９０１５との組み合わせも試験した。両方の組み合わせにより、高さおよび根の乾燥重量が有意に増加し、水ポテンシャルが増加し、ＣＥＣＴ９０１５株単独ではこれらの増加に寄与しないことから、この効果はＣｏｌｂｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔｏｒ．ｏｒｇ／ｓｔａｂｌｅ／４０４１０５８）によれば相乗的であることがわかった。

４．灌漑された超集約的なオリーブの木で実験を行い、灌漑を２５％減少させる実験を行った（４回中１回の灌漑を排除した）。シュードモナスＢＢＢ００１株は、根への塗布で試験した。４月から９月まで１５日ごとに施用した（１２回施用）。試験における植物の数は、２つの灌漑計画（１００％の水および７５％の水）で、処理（３）＋対照あたり２０であった。収穫前の追跡調査サンプル採取（９月）では、根に施用したＢＢＢ００１株が、水を加えた対照（２０個の果実の平均重量、ｎ＝３）に対してオリーブの新鮮重量に対して４４．５２％増加し、水を減少させた対照に対して４５．９６％増加して、２つの灌漑計画においてＢＢＢ００１で処理したオリーブと同じ重量に達したことを示した。

５．トマト植物（ｖａｒ．Ｃａｓｉｌｌａｓ）における鉄クロロシスの回復実験。温室内で光、湿度、温度を制御した条件下で、２１６株、９処理、各処理２４株を３反復で、無作為化ブロック実験モデルに従って実施した実験である。実験全体を通して、基質を５ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液で塩基性ｐＨに維持した。種子を基質ポットで発芽させ、鉄を含まないＨｏａｇｌａｎｄ溶液を週に１回、萎黄病が現れるまで８週間給水した。萎黄病が現れると、それらは、不溶性形態のＦｅ（Ｃｌ３Ｆｅ）を提供するＦｅを有するＨｏａｇｌａｎｄで灌注され始め、可溶性Ｆｅを完全に含むＨｏａｇｌａｎｄ溶液で対照を維持した。３用量の細菌を、適用間の４日の差で適用した。２週間後、萎黄病は回復し、蛍光光合成パラメータ（Ｆ０、Ｆｖ／Ｆｍ、ＰＳＩＩ、ＮＰＱ）を測定し、植物を収穫した。乾燥重量、光合成色素および葉の栄養分析を分析した。Ｆｏ、Ｆｖ／ＦｍおよびｅＰＳＲの増加、ならびにエネルギー散逸（ＮＰＱ）の減少が、光合成色素（クロロフィルａ、ｂおよびカロテン）の増加と共に観察され、植物の適応性の改善が示された。栄養分析では、鉄濃度が２５％増加し、亜鉛含有量が改善され、リンおよびカリウム取り込みの分析では、それぞれ８．４６％および１．３％の増加を示した。

同じ実験で、本発明者らは、１）栄養ブロス中で増殖させたＰ．パルメンシス（結果は上記のとおり）、および２）シデロフォア産生培地中で増殖させたＰ．パルメンシス、３）不溶性Ｆｅの動員に関与する培地（シデロフォア培地）中に含まれる細菌代謝産物を試験した。一般に、乾燥重量および色素についての結果は前の段落で示したものと同様であり、Ｐ．パルメンシスが常に際だっていた。これらの処理は全て、アルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）種コードＣＥＣＴ ３０２３１のオーキシン産生株と組み合わせて試験した。一般に、乾燥重量および顔料については同様の結果が得られ、Ｐ．パルメンシス単独については常に顕著であった。しかし、Ｐ．パルメンシスおよびアルスロバクター・オキシダンスＣＥＣＴコード３０２３１の組み合わせは、Ｆｅ取り込みに対するコルビー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔｏｒ．ｏｒｇ／ｓｔａｂｌｅ／４０４１０５８）による相乗効果を有し、対照および各株の効果に対してＦｅ含有量を個別に３６．４％増加させた。窒素、リンおよびカリウムの取り込みの分析でも、１．５％、９．７％および９．５％の増加が観察された。

産業用途
非生物的ストレスへの適応代謝の刺激因子としてのシュードモナス・パルメンシスＢＢＢ００１の上述の特性、植物の酸化バランスの改善、ＲＯＳ捕捉に関連する酵素の活性の調節、ならびに栄養素、特に鉄、窒素、リンおよびカリウムを動員するその能力を考慮すると、この細菌株は、非生物的ストレス条件に適応し、ミネラル栄養、特に鉄、窒素、リンおよびカリウムを改善する株の能力を高めるために、あらゆる利用可能な手段、任意の植物種、または任意の形態のインビトロ培養によって、あらゆる調製物（個別にまたは他の微生物と組み合わせて）の一部として使用し得、それら（株またはその任意の部分）を植物の種子、根または空中系と接触させることによって、農業食品、化学および製薬産業において特定の用途を有する。

Claims (12)

1. グラム細菌群、シュードモナス属の微生物であり、配列番号１～４１に相当するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株。
2. 植物種における非生物的ストレスに対する適応代謝を刺激する能力を有し、ストレス状態中に産生されたフリーラジカルの除去に関与する代謝を誘導することによって酸化応答を調節して、植物の成長および生産を改善することを特徴とする、請求項１に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株。
3. 植物種におけるＲＯＳ捕捉酵素の活性を上昇させる能力を特徴とする、請求項２に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株。
4. 植物種におけるＲＯＳフリーラジカル（ＮＰＱ）の生成に関与する過剰の光合成エネルギーの散逸を増加させる能力を特徴とする、請求項２に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株。
5. 鉄、リンおよびカリウムの吸収を刺激し、ミネラル栄養を改善する能力を特徴とする、請求項１に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株。
6. 任意の非生物的ストレス状態への植物の適応を改善するために、任意の種類の農作物または林業作物に適用するための、請求項１または２に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株、または不溶性のＦｅの動員に関与する株の培養液の上清中に存在するシデロフォアの使用。
7. 土壌または灌漑水中の高塩分条件下で任意の植物種に施用するための、請求項１または２に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株、または不溶性のＦｅの動員に関与する株の培養液の上清中に存在するシデロフォアの使用。
8. シロイヌナズナなどの植物中の野菜、およびブラックベリー、オリーブまたはトマトなどの植物果実の生産を増加させるために、任意の植物種に施用するための、請求項１または２に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株の使用。
9. 鉄、リンおよびカリウムの無機物含有量を改善するための任意の植物種において施用するための、請求項１または５に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株、または不溶性のＦｅの動員に関与する株の培養液の上清中に存在するシデロフォアの使用。
10. 単独で、または他の生物と組み合わせて、任意の細菌製剤の一部として、また細菌を植物の種子、根または気中系と接触させる利用可能な任意の手段による、請求項６～９のいずれか一項に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株の使用。
11. 食塩水ストレスに対する応答を改善するための、シュードモナス・フルオレッセンス（ＣＥＣＴ９０１５）と組み合わせた、またはシュードモナス・フルオレッセンス（ＣＥＣＴ９０１５）を含む任意の調製物の一部としての、請求項１０に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株の使用。
12. 有機農業および従来の農業の両方において鉄、窒素、リンおよびカリウムの無機含有量を改善するための、アルスロバクター・オキシダンス（ＣＥＣＴ３０２３１）と組み合わせた、またはアルスロバクター・オキシダンス（ＣＥＣＴ３０２３１）と任意の調製物の一部を形成する、請求項１０に記載の寄託番号ＣＥＣＴ３０２２２のシュードモナス・パルメンシス種の細菌株の使用。