WO2012089887A1 - Cultivo biológico de una cepa de la especie pseudomonas graminis, uso de dicho cultivo como antagonista y método para tratar fruta - Google Patents

Cultivo biológico de una cepa de la especie pseudomonas graminis, uso de dicho cultivo como antagonista y método para tratar fruta Download PDF

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PCT/ES2011/070912
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Immaculada VIÑAS ALMENAR
Maria Isabel ABADIAS SERÓ
Josep USALL RODIÉ
Neus TEIXIDÓ ESPASA
Rosario TORRES SANCHIS
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Universitat De Lleida
Institut De Recerca I Tecnologia Agroalimentàries
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    • C12R2001/38—Pseudomonas

Definitions

  • BIOLOGICAL CULTURE OF A PSEUDOMONAS GRAMINIS strain SO OF SUCH CULTURE AS AN ANTAGONIST AND METHOD TO TREAT FRUIT
  • the present invention relates to a biological culture of a strain of the Pseudomonas graminis species and to the use of said strain as an antagonist for the biological control of pathogenic foodborne bacteria in fruit. 10 It also refers to a method for treating fruit comprising the step of applying a preparation comprising said crop to the fruit.
  • Fresh cut fruit or fourth-range fruit is a product of recent appearance in the markets. This fruit is subjected to a minimum processing consisting of cleaning, peeling, cutting, disinfection and packaging in a passive or active modified atmosphere, finally being kept under refrigeration conditions.
  • the cut fruit is a food product very susceptible to alterations
  • the antagonists used do not belong to the species Pseudomonas graminis and, in addition, none of them is effective against any of the microorganisms Salmonella spp. hysteria spp. and Escherichia coli 0157: H7 both at room temperature and in cooling conditions.
  • a first objective of the present invention is to provide a substantially pure biological culture of a new strain of the species Pseudomonas graminis deposited with the number CBS124167 at the depository institution "Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) in Utrech, The Netherlands.
  • a second objective is to provide a substantially pure biological culture of a new strain of the species Pseudomonas graminis deposited with the number
  • CBS 124167 for use as an antagonist for the biological control of foodborne pathogenic bacteria in fruit for human consumption.
  • a third objective of the present invention is the use of said biological culture of the new strain as an antagonist for the biological control of foodborne pathogenic bacteria in fruit for consumption. human.
  • a fourth objective is to provide a method for treating fruit that comprises the step of applying to the fruit a preparation comprising said biological culture of the new strain.
  • the new isolate strain shows great effectiveness as an antagonist against foodborne pathogenic bacteria in fruit, in a wide range of pathogens and fruits, at room temperature, in a modified atmosphere and under refrigeration conditions. Its application allows to reduce the growth of pathogens during the life of the product, especially when the cold chain breaks.
  • "foodborne pathogenic bacteria” means pathogenic bacteria that cause food poisoning or diseases caused by the intake of contaminated food, for example, fruit contaminated with pathogenic bacteria of the Salmonella spp., Hysteria spp. or Escherichia coli 0157: H7.
  • the new strain of the species Pseudomonas graminis was isolated from the surface of a "Golden Delicious" apple by washing with sterile water, followed by immersion in saline peptone solution (peptone, 1 g / 1; NaCl, 0.85 g / 1), sonication in an ultrasonic bath for 10 min and planting of the washing liquid in NYDA culture medium (nutritive broth, 8 g / 1; yeast extract, 5 g / 1; dextrose, 10 g / 1 and agar 15 g / 1) and subsequent incubation at 25 ° C for 3 days.
  • peptone 1 g / 1
  • NaCl 0.85 g / 1
  • NYDA culture medium nutritive broth, 8 g / 1; yeast extract, 5 g / 1; dextrose, 10 g / 1 and agar 15 g / 1
  • CBS 124167 isolate was identified by partial sequencing of the 16S rRNA region: Pseudomonas sp., And by total sequencing of the region
  • 16S rRNA Pseudomonas graminis (Behrendt et al. 1999 1 ).
  • CBS strain 124167 is a gram-negative, non-spore-forming bacillus, Negative oxidase and positive catalase, mobile and aerobic. In plaque, the colonies are yellow, circular in shape with whole edges.
  • Strain CBS 124167 has the biochemical characteristics detailed in Table 1 and is phenotypically differentiated from other Pseudomonas species by the tests shown in Table 2.
  • the growth temperature is between 5 ° C and 30 ° C, with an optimum between 25 ° C and 30 ° C. It does not grow at 33 ° C or 0 ° C.
  • the growth in plates can be carried out in AN culture medium (Nutritive Agar: Tryptone 5 g / 1, meat extract 3 g / 1, agar 15 g / 1), TSA (Tryptone Broth Broth: triptone 15 g / 1 , soybean peptone 5.0 g / 1, sodium chloride 5.0 g / 1 and agar 15 g / 1, pH 7.3) or NYDA (Nutrient broth: 8 g / 1; yeast extract, 5 g / 1 ; dextrose, 10 g / 1 and agar 15 g / 1).
  • AN culture medium Nutritive Agar: Tryptone 5 g / 1, meat extract 3 g / 1, agar 15 g / 1
  • TSA Teryptone Broth Broth: triptone 15 g / 1 , soybean peptone 5.0 g / 1, sodium chloride 5.0 g / 1 and agar 15 g / 1, pH 7.3
  • NYDA Nutri
  • the liquid growth can be carried out in TSB culture medium (Tryptone Broth Soy: Pancreatic casein digestion 17.0 g / 1, enzymatic digested soybean 3.0 g / 1, sodium chloride 5.0 g / 1, Dipotassium hydrogen phosphate 2.5 g / 1, glucose 2.5 g / 1, pH 7.3).
  • the NB medium can also be used (Nutrient broth: 10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 meat extract, 5 g / 1 sodium chloride, pH 7.2)
  • strain CBS 124167 in TSB or NB medium under aerobic conditions, under agitation and at a temperature of 25 and 30 ° C, reaches a maximum population at 20-24 h of incubation (generally between 1.9 and 2.9 x 10 9 colony forming units (cfu) / ml), without presenting large differences between the two culture media.
  • strain CBS 124167 produces antimicrobial substances.
  • the strain was grown in TSB medium at 30 ° C, for 20-24 h. From the culture obtained, a fraction was reserved, which was called “culture, CUL", which contained both cells and culture medium and possible metabolites produced during growth. The rest was centrifuged at 8000 rpm for 10 min, at 10 ° C. The pH of the supernatant was adjusted to 6.5 and sterilized by filtration (0.22 ⁇ ), obtaining a "cell-free neutral supernatant, SNLC”. The cell fraction obtained after centrifugation was resuspended in sterile deionized water, centrifuged and washed twice consecutively for the elimination of possible remains of culture medium, obtaining only "cells, CEL".
  • CUL, SNLC and CEL in vitro conditions, against several indicator cultures: Escherichia coli 0157: H7, Salmonella spp., Listeria innocua and Listeria monocytogenes.
  • Salmonella spp. and Escherichia coli 0157: H7 were grown in TSB medium and Listeria spp. in TYSEB (TSB supplemented with 6 g / 1 yeast extract) at 37 ° C, for 18-20 h. 50 ⁇ of each of the cultures obtained was added to tubes containing 10 ml of TSB medium (Salmonella spp. And Escherichia coli 0157: H7) or TYSEB (Listeria spp.) Containing 7.5 g / 1 agar and tempered at 45 ° C.
  • each of the tubes (medium + indicator culture) was deposited on plates containing 20 g / 1 meat extract, 20 g / 1 glucose and 15 g / 1 agar. Once solidified, 5 ml of the CUL, SNLC or CEL were deposited and the plates were incubated at 30 ° C for 20 h, after which the presence or not of an inhibition halo was indicated.
  • strain CBS124167 is phytopathogenic or not, capable of producing hypersensitivity reaction in tobacco leaves, according to the methodology of Noval et al. 1991 2.
  • a suspension of 109 "cfu / ml of the strain was prepared and injected into the veins of tobacco leaves using an insulin syringe. Water was used for the negative control and the strain CPA-3 of Pantoea ananatis as a positive control, since this strain is phytopathogenic.
  • the plants were kept at room temperature and periodically it was observed whether or not they presented symptoms of hypersensitivity, in the form of necrosis, yellowing of the infiltrated area and death of the leaves. no reaction in the treated leaves, even with high doses of CBS124167 (10 9 cfu / ml) Therefore, strain CBS124167 is not phytopathogenic.
  • strain CBS 124167 was inoculated with strain CBS 124167 at a dose of 10 cfu / ml by bath immersion for 2 min. They were allowed to dry and packaged in polypropylene wafers and sealed with polypropylene film 35 ⁇ thick and permeability at 0 2 and C0 2 of 3500 cm 3 / m 2 * day * atm at 23 ° C, and steam of water of 0.9 g / m * day at 25 ° C and 75% relative humidity, and stored at 5 ° C. After 0, 4, 7 and 14 days, 10 g were taken and submitted to a gastric transit simulation.
  • strain CBS124167 is capable of growing in apple, peach and melon cut at different temperatures, although the growth is much higher in melon, due to its lower acidity (higher pH). Growth has also been observed in apple preserved under conditions of modified atmosphere and at temperature or cooling conditions.
  • strain CBS 124167 is very effective against foodborne pathogenic bacteria in fruit, preferably, in fruit cut into pieces and, advantageously, against microorganisms Salmonella spp., Listeria spp., And / or Escherichia coli 0157. ⁇ 7 , which are the most important in fruits and vegetables.
  • strain CBS 124167 can be used as an antagonist against any of these microorganisms, favoring compliance with the microbiological criteria established especially for cut fruit or fourth-range fruit, to avoid food poisoning or diseases caused by the intake of contaminated fruit with bacteria of the type Salmonella spp., Listeria spp. or Escherichia coli 0157: H7.
  • the strain of the present invention is used for biological control in fruit, preferably fruit cut into pieces, keeping the fruit at a temperature greater than 10 ° C, preferably, a temperature equal to or greater than 20 ° C
  • strain CBS 124167 can slow growth, and even reduce, to any of the aforementioned microorganisms, even when these microorganisms are present in the fruit at a concentration equal to or greater than 10 cfu / g, which is a very high and difficult concentration that occurs in reality.
  • This use is particularly advantageous since it allows to control the growth of pathogens in cases where the fruit's storage temperature is not adequate, or the product's cold chain is cut during storage or transport, for example, by problems in the maintenance of fruit refrigeration equipment. It is very important that the strain is effective at room temperature, since at this temperature it is when the pathogenic microorganism can grow more and therefore the risk in the consumer is increased.
  • the strain of the present invention is used for biological control in fruit, for example fruit cut into pieces, keeping the fruit in refrigeration conditions.
  • Refrigeration conditions shall mean the maintenance of the fruit at a refrigeration temperature equal to or less than 10 ° C, preferably, equal to or less than 5 ° C.
  • strain CBS124167 against any of the microorganisms Salmonella spp., Hysteria spp. and Escherichia coli 0157: H7 has also been shown at refrigeration temperatures that are those marked by the producer or distributor for the preservation of the fruit.
  • the strain of the present invention is used for biological control in fruit, preferably, cut fruit, keeping the fruit in a modified atmosphere.
  • a modified atmosphere means an atmosphere with a composition of gases different from that of air to improve the conditions in which the fruit is preserved.
  • the strain of the present invention also shows effectiveness when the fruit is packaged in a modified atmosphere for preservation. Thanks to this, the strain can be used in the usual conditions of commercialization, so it is possible to guarantee food safety also in the conditions of the supermarkets or stores.
  • said fruit is fruit with a pH between 3 and 7, for example, fruits such as apple, peach and / or melon.
  • an objective of the present invention is to provide a method of fruit preparation comprising the step of applying to the fruit a preparation comprising the biological culture of the new strain CBS 124167.
  • the fruit is cut into pieces before applying said preparation.
  • the concentration of strain CBS 124167 in said preparation is equal to or greater than the estimated concentration of pathogen that the fruit may contain, preferably, the cut fruit.
  • the concentration of said strain in the preparation is equal to or greater than 10 5 cfu / ml.
  • the concentration of said strain in the preparation is the same.
  • the method comprises the step of packaging the fruit once said preparation is applied.
  • said method also comprises the step of providing the fruit with a modified atmosphere and / or the step of providing the fruit with a cooling temperature, for example, a temperature equal to or less than 10 ° C, preferably, an equal temperature or less than 5 ° C.
  • the modified atmosphere can be provided in a passive manner, for example, by packaging the product by using plastic films of different gas permeability, passively creating a favorable modified atmosphere as a result of the permeability of the container wall and 20 factors such as product respiration and biochemical changes.
  • the packaging of the product in a modified atmosphere helps to maintain the quality of freshness of the cut fruit for a longer time, so that the shelf life of the product is extended.
  • the invention is also effective under these conditions of modified atmosphere packaging.
  • said method of preparing the fruit, preferably cut fruit comprises the step of applying an antioxidant to the fruit, before applying the suspension containing the strain.
  • Figure 1 is a graphical representation showing the population of Escherichia coli 0157: H7 in apple cylinders after inoculation (initial concentration), after 2 days of incubation at 20 ° C without antagonist (control) and with 10 of the antagonists selected, among which is the CBS 124167 antagonist.
  • the values represent the average of 6 values (2 trials with 3 repetitions each) and the bars represent the standard error.
  • the numbers in parentheses indicate the average of the reduction obtained.
  • Figure 2 is a graphical representation showing the population of Salmonella choleraesuis BAA-709 in apple cylinders after inoculation (initial concentration), after 2 days of incubation at 20 ° C without antagonist (control) and with 10 of the antagonists selected, among which is strain CBS 124167.
  • the values represent the average of 6 values (2 trials with 3 repetitions each) and the bars represent the standard error.
  • the numbers in parentheses indicate the average of the reduction obtained.
  • Figure 3 is a graphical representation showing the population of Listeria innocua CECT-910 in apple cylinders after inoculation (initial concentration), after 2 days of incubation at 20 ° C without antagonist (control) and with 10 of the antagonists selected, among which is strain CBS 124167.
  • the values represent the average of 6 values (2 trials with 3 repetitions each) and the bars represent the standard error.
  • the numbers in parentheses indicate the average of the reduction obtained.
  • Figure 4 is a graphical representation showing the population of Escherichia coli 0157: H7 in the peach cylinders after inoculation (initial concentration), after 2 days of incubation at 20 ° C without antagonist (control) and with 10 of the antagonists selected, among which is strain CBS 124167.
  • the values represent the average of 6 values (2 trials with 3 repetitions each) and the bars represent the standard error.
  • the numbers in parentheses indicate the average of the reduction obtained.
  • Figure 5 is a graphical representation showing the population of Salmonella choleraesuis BAA-709 in peach cylinders after inoculation (initial concentration), after 2 days of incubation at 20 ° C without antagonist (control) and with 10 of the selected antagonists, among which is strain CBS 124167.
  • the values represent the average of 6 values (2 trials with 3 repetitions each) and the bars represent the standard error.
  • the numbers in parentheses indicate the average of the reduction obtained.
  • Figure 6 is a graphic representation showing the population of Listeria innocua CECT-910 in the peach cylinders after inoculation (initial concentration), after 2 days of incubation at 20 ° C without antagonist (control) and with 10 of the antagonists selected, among which is strain CBS 124167.
  • the values represent the average of 6 values (2 trials with 3 repetitions each) and the bars represent the standard error.
  • the numbers in parentheses indicate the average of the reduction obtained.
  • Figure 7 is a graphic representation showing the population of Salmonella choleraesuis BAA-709 in the melon cylinders after inoculation (initial concentration) and after 2 days of incubation at 20 ° C without antagonist (control) and with 12 of the antagonists selected, among which is strain CBS 124167.
  • the values represent the average of 6 values (2 trials with 3 repetitions each) and the bars represent the standard error.
  • the numbers in parentheses indicate the average of the reduction obtained.
  • Figure 8 is a graphical representation showing the population of Listeria monocytogenes LM230 / 3 in the melon cylinders after inoculation (initial concentration), after 2 days of incubation at 20 ° C without antagonist (control) and with 12 of the antagonists selected, among which is strain CBS 124167.
  • the values represent the average of 6 values (2 trials with 3 repetitions each) and the bars represent the standard error.
  • the numbers in parentheses indicate the average of the reduction obtained.
  • Figure 9 is a graphical representation showing the evolution over time of the population of Escherichia coli 0157: H7 in apple cylinders co-inoculated or not with a suspension of strain CBS 124167 (10 cfu / ml) and preserved at 5 ° C.
  • Figure 10 is a graphical representation showing the evolution over time of the population of Escherichia coli 0157: H7 in peach cylinders co-inoculated or not with a suspension of strain CBS 124167 (10 cfu / ml) and preserved at 5 ° C and 10 ° C.
  • Figure 11 is a graphical representation showing the evolution over time of the population of Salmonella cholearaesuis BAA-709 in peach cylinders co-inoculated or not with a suspension of strain CBS 124167 (10 cfu / ml) and preserved at 5 ° C.
  • Figure 12 is a graphical representation showing the evolution over time of the Salmonella cholearaesuis BAA-709 population in melon cylinders co-inoculated or not with a suspension of strain CBS 124167 (10 cfu / ml) and preserved at 5 ° C and 10 ° C.
  • Figure 13 is a graphic representation showing the evolution in time of the population of a cocktail of Listeria monocytogenes strains (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 and LM230 / 3) in melon cylinders co-inoculated or not with strain CBS 124167 at different concentrations and stored at 10 ° C.
  • CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 and LM230 / 3 Listeria monocytogenes strains
  • Figure 14 is a graphical representation showing the evolution in time of the population of a cocktail of Salmonella choleraesuis strains (BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711) in co-inoculated melon cylinders or not with strain CBS 124167 at different concentrations and stored at 10 ° C.
  • BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711 Salmonella choleraesuis strains
  • Figure 15 is a graphical representation showing the evolution in time of the population of a cocktail of Salmonella choleraesuis strains (BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711) in cut apple treated with antioxidant and inoculated or not with strain CBS124167 at 10 'cfu / ml, by immersion for 2 min, and stored in modified atmosphere (MAP) packaging at 5 ° C and 10 ° C.
  • BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711 modified atmosphere
  • Figure 16 is a graphical representation showing the evolution over time of the population of a cocktail of Listeria monocytogenes strains (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 and LM230 / 3) in treated cut apple with antioxidant and inoculated or not with strain CBS124167 at 10 'cfu / ml, by immersion for 2 min, and preserved in modified atmosphere packaging (MAP) at 5 ° C and 10 ° C.
  • MAP modified atmosphere packaging
  • the antagonistic effect has been tested in different strains of the genus Salmonella and Listeria and in a strain of Escherichia coli 0157: H7. These pathogens They are the most important in fruits and vegetables. Table 3 shows the strains of foodborne pathogenic microorganisms used in the tests.
  • strains of pathogenic microorganisms used in these tests were: innocuous hysteria (CECT-910), Escherichia. coli 0157: H7 (NCTC-12900), and Salmonella choleraesuis (BAA-709, BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711) and, in some cases, hysteria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032 , CECT-933, CECT-940 and LM230 / 3), (see Table 3).
  • the fruits were previously disinfected by spraying with 70% ethanol. Cylindrical pieces of the fruit to be tested were then prepared, by means of a punch, of dimensions 1.2 cm in diameter and 1 cm in height, equivalent to approximately 1 g of fruit. These pieces were introduced into sterile test tubes and inoculated with 15 ⁇ of a suspension containing the two microorganisms (pathogen and antagonist), called co-inoculation. In the control treatment, the pathogen was added to a tube with 10 ml of sterile water (without antagonistic microorganism). After co-inoculation, the fruit was allowed to dry at room temperature. Next, 3 tubes were taken, of which the initial pathogen concentration was measured by seeding in specific culture media.
  • the other tubes were stored at 20 ° C, 10 ° C or 5 ° C, depending on the test. After 2 days (conservation tests at 20 ° C), or 2-3 days, 5-7 days and 10 days (tests at 5 or 10 ° C), the concentration of pathogen per piece of fruit was determined again in the samples with antagonist (treatment with antagonist) and in those that did not have antagonist (control treatment). The concentration data was transformed to decimal logarithm. The following formula was used to calculate the pathogen growth reduction value:
  • Ct-controi is the concentration of the pathogen in the control treatment after "t" days of conservation
  • Ct + an tagonist is the concentration of the pathogen in the treatment with antagonist after "t" days of conservation.
  • the pathogens were inoculated in tubes containing 10 ml of TSB medium (Salmonella choleraesuis BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711 and Escherichia coli 0157: H7) or TYSEB ⁇ innocuous hysteria CECT-910 and hysteria monocytogenes
  • CECT Spanish Type Crops Collection
  • ATTC American Type Culture CoUection
  • NCTC National CoUection of Type Cultures.
  • the pathogen concentrations tested range between 10 5 cfu / ml and 10 cfu / ml. However, in real conditions it is estimated that the concentration of pathogen 10 5 cfu / ml, which in the tests carried out corresponds to 103 cfu / g of product, is even a very high concentration of pathogen (Sallen et al., 2003 6 ; Nguz et al., 2005), so the results obtained are presented in unfavorable / adverse conditions for strain CBS 124167.
  • Figures 1 to 3 show an example of results obtained against Escherichia coli 0157 strains: H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 and Listeria innocua CECT-910, in "Golden Delicious" apple, comparing the effectiveness of strain CBS 124167 with other strains isolated in the laboratory and tested under the same conditions.
  • the suspension that was inoculated had a concentration of strain CBS 124167
  • strain CBS 124167 showed much better results, with a reduction of 5.9 logarithmic units after conservation, indicating that the Listeria population innocuous in apples that had been treated with strain CBS 124167 was less than 2 log cfu / g ( Figure 3).
  • Figures 4 to 6 show an example of results obtained against the strains of Escherichia coli 0157: H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 and innocuous hysteria CECT-910, in peach, comparing the effectiveness of strain CBS 124167 with other strains isolated in the laboratory and tested under the same conditions.
  • the initial concentration of E. coli 0157: H7 in peach was 4.9 logioufc / g, and increased approximately 3 logarithmic units in the pieces not treated with antagonist after 2 days of storage at 20 ° C.
  • the concentration of E. coli 0157: H7 was reduced between 1.8 and 3.0 logarithmic units, while with strain CBS 124167, the reduction was 4.3 logarithmic units , being the concentration at 2 days even lower than the initial, which demonstrates its great effectiveness.
  • Figure 6 shows the data concerning innocuous hysteria in peach.
  • the population of innocuous hysteria in the control treatment also increased approximately 3 logarithmic units in each piece of peach, while in those pieces inoculated with different antagonists isolated in the laboratory, the population was smaller , observing reductions between 0.7 and 2.1 logarithmic units.
  • strain CBS 124167 was greater, of 4 logarithmic units, also making the final population even lower than the initial.
  • Example 3 Effectiveness of strain CPA-7 against different foodborne pathogens in melon at 20 ° C
  • Figures 7 and 8 show an example of results obtained against strains of Salmonella choleraesuis BAA-709 and hysteria monocytogenes LM230 / 3, in melon, comparing the effectiveness of strain CBS 124167 with other strains isolated in the laboratory and tested under the same conditions.
  • Figure 7 shows the results of different strains of antagonistic microorganisms, including CBS 124167 against Salmonella in melon pieces "Piel de Sapo".
  • the reduction values ranged from 1.5 to 3.2 logarithmic units, the greatest reduction being that obtained with the CBS strain 124167, with a total of 3.5 logarithmic units. It can be seen that the growth of Salmonella
  • Figure 8 shows the effectiveness of strain CBS 124167 against hysteria monocytogenes strain LM230 / 3, in melon preserved 2 days at 20 ° C. Just like
  • Figure 9 shows the result of the effectiveness of strain CBS 124167 against E. coli 0157: H7 in Golden Delicious apple preserved at 5 ° C.
  • the assay was performed by co-inoculating 15 ⁇ of a suspension containing both strains, E. coli 0157: H7 at 10 7 cfu / ml and CBS 124167 (30% transmittance,
  • FIGs 10 and 11 show the effectiveness of strain CBS 124167 in peach ("Elegant Lady” and “Placido” varieties), at 5 and 10 ° C, compared to Escherichia coli 0157: H7 and Salmonella BAA-709.
  • the suspension that was inoculated had a CBS 124167 strain concentration of approximately 10 8 cfu / ml and 107 cfu / ml of pathogenic microorganism.
  • strain CBS 124167 reduces the concentration of pathogen, this reduction being greater at 5 ° C than at 10 ° C and remaining even below the detection limit after 6 days of storage.
  • Figure 12 shows the effectiveness of strain CBS 124167 in melon preserved at 10 ° C against Salmonella BAA-709.
  • the suspension that was inoculated had a CBS 124167 strain concentration of approximately 10 8 cfu / ml and 107 cfu / ml
  • strain CBS 124167 was not able to grow and the addition of strain CBS 124167 did not represent any change with respect to the control treatment.
  • Example 7 Effectiveness of strain CBS 124167 applied at different doses against different foodborne pathogens in Golden Delicious apple at 20 ° C
  • Tables 4, 5 and 6 show the effectiveness of strain CBS 124167 applied at different doses, and against different concentrations of pathogens Escherichia coli 0157: H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 and innocuous hysteria CECT-910. This effectiveness was measured in decimal logarithmic units of growth reduction according to the formula cited above.
  • the 1: 1 ratio (antagonistic pathogen) is sufficient to observe reductions greater than 1.9 logarithmic units.
  • 10 cfu / ml is the one that presents the best results for the three pathogens (reductions greater than 3.5 logarithmic units).
  • the 10 cfu / ml dose of strain CBS 124167 is considered to be the most suitable for commercial application, since it guarantees a minimum of two log reduction units for the three pathogens studied, regardless of the concentration of pathogenic bacteria of the fruit
  • Example 8 Effectiveness of strain CBS 124167 applied at different doses against different foodborne pathogens in melon at 20 ° C and 10 ° C
  • a cocktail of Salmonella choleraesuis strains BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711
  • hysteria mono cyto genes CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT -940 and LM230 / 3
  • Tables 7 and 8 show the effectiveness in melon preserved at 20 ° C of strain CBS124167, applied at different doses, and against different concentrations of pathogen cocktail of the genus Salmonella and hysteria mono cyto genes. This effectiveness was measured in decimal logarithmic units of growth reduction according to the formula cited above. Table 7. Reduction values (logarithmic decimal units) of Salmonella choleraesuis applied at different concentrations, depending on the dose of strain CBS 124167, in melon "Toad skin" preserved at 20 ° C for 2 days.
  • the dose 10 cfu / ml of strain CBS 124167 shows growth reduction values equal to or greater than 3.7 logarithmic units of Salmonella and Listeria monocytogenes applied at 10 5 cfu / ml of melon equivalent to approximately 10 cfu / g melon.
  • Figures 13 and 14 show the effectiveness at different concentrations of strain CBS 124167, in melon preserved at 10 ° C, against the mentioned cocktails of Salmonella choleraesuis and Listeria monocytogenes applied at a concentration of 10 5 cfu / ml.
  • the apple pieces were immersed in a suspension containing the cocktail of strains of the pathogen and the antagonist, for 1 min and under stirring, simulating the application that would take place in a tank of the fruit treatment line .
  • the apple pieces were immersed in a suspension containing the pathogen strain cocktail without the antagonistic strain.
  • the apple pieces were allowed to drain and packed (200 g) in 500 ml polypropylene wafers and sealed with a polypropylene film of the commonly used type 35 ⁇ thick and permeable to 0 2 and C0 2 of 3500 cm 37m 2 "* day * atm at 23 ° C, and water vapor of 0.9 g / m * day at 25 ° C and 75% relative humidity.
  • a passive modified atmosphere MAP
  • the antagonist strain CBS 124167 can be affected by this atmosphere, so its effectiveness must also be demonstrated in these modified atmosphere conditions.
  • Apple pieces were stored at 5 ° C and 10 ° C for 15 days (estimated shelf life for this type of product). Microbiological counts were made periodically and a determination of different quality parameters (color, texture, pH, acidity, soluble solids content and visual quality) was made.
  • the pathogens were inoculated in tubes containing 10 ml of TSB medium (Salmonella choleraesuis BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711) or TYSEB (Listeria monocytogenes CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT- 940 and LM230 / 3), which were incubated at 37 ° C for 20-24 h. They were then centrifuged at 8000 rpm for 10 min and the cell precipitate was redissolved with 5 ml of saline (0.85 g / 1 NaCl).
  • TSB medium Salmonella choleraesuis BAA-707, BAA-709, BAA-710 and BAA-711
  • TYSEB Listeria monocytogenes CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT- 940 and LM230 / 3
  • the suspension that was inoculated by immersion of the apple pieces contained a concentration of strain CBS 124167 of 10 cfu / ml and a concentration of 10 5 cfu / ml of both pathogenic microorganisms.
  • strain CBS124167 has been effective against Salmonella, especially at 10 ° C, where growth was observed. In the case of Listeria monocytogenes, growth reduction was observed at both 5 ° C and 10 ° C.
  • strain CBS 124167 is effective against different foodborne pathogens under conditions that simulate commercial (MAP passive modified atmosphere and refrigeration).
  • strain CBS 124167 did not affect the color, texture, soluble solids, or acidity of apples.

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Abstract

Cultivo biológico sustancialmente puro de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el número CBS124167 en la institución de depósito "Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)" de Utrech, Holanda. Uso del cultivo CBS124167 como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta para consumo humano. Método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende un cultivo de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el número CBS124167 en la institución de depósito "Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)" de Utrech, Holanda. Su aplicación permite reducir el crecimiento de los patógenos durante la vida útil del producto, especialmente cuando se rompe la cadena de frío.

Description

CULTIVO BIOLÓGICO DE UNA CEPA DE LA ESPECIE PSEUDOMONAS GRAMINIS, SO DE DICHO CULTIVO COMO ANTAGONISTA Y MÉTODO PARA TRATAR FRUTA
5
La presente invención se refiere a un cultivo biológico de una cepa de la especie Pseudomonas graminis y a la utilización de dicha cepa como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta. 10 También se refiere a un método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende dicho cultivo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
15 La fruta fresca cortada o fruta de cuarta gama es un producto de reciente aparición en los mercados. Esta fruta es sometida a un procesado mínimo consistente en la limpieza, pelado, corte, desinfección y envasado en atmósfera modificada pasiva o activa, conservándose finalmente en condiciones de refrigeración.
La fruta cortada es un producto alimenticio muy susceptible a alteraciones
20 físicas, químicas y biológicas, que se deteriora a mayor velocidad que las piezas enteras. En la fruta cortada la respiración y los procesos metabólicos se aceleran como resultado de la manipulación, por lo que resulta esencial conservar el producto en atmósfera modificada y mantenerlo en condiciones de refrigeración.
La reglamentación actual aplica unos criterios microbiológicos muy
25 estrictos a la fruta cortada con el objetivo de reducir al mínimo las toxiinfecciones alimentarias o enfermedades originadas por la ingesta de fruta contaminada con bacterias del tipo Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli 0157:H7.
En la actualidad, para garantizar la seguridad alimentaria de los productos de cuarta gama resulta habitual aplicar tratamientos consistentes en lavar la fruta con
30 agua adicionada con hipoclorito sódico. Estos tratamientos consiguen reducir la carga microbiana de los productos pero presentan el inconveniente de que pueden dejar un residuo de cloro que facilita la formación de sustancias que podrían tener carácter cancerígeno. Además, el tratamiento con hipoclorito no previene el crecimiento de los microorganismos durante la conservación de la fruta o durante la vida útil del 35 producto. El control biológico de las bacterias patógenas de transmisión alimentaria en productos de cuarta gama es una alternativa a los tratamientos con hipoclorito sódico que resulta muy deseable. No obstante, para que esta alternativa sea viable resulta imprescindible hallar microorganismos antagonistas que sean efectivos contra cualquiera de los tres tipos de bacterias patógenas citadas (Salmonella spp., histeria spp., y Escherichia coli 0157:H7), tanto a temperatura ambiente como en condiciones de refrigeración y atmósfera modificada. Además, es deseable que estos antagonistas sean innocuos tanto para los humanos como para los vegetales ya que, en caso contrario, podrían perjudicar al consumidor o al producto tratado.
En el estado de la técnica se han descrito antagonistas para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta ( "Biological control of postharvest decays of apple can prevent growth of Escherichia coli 0157 :H7 in apple wounds ", Janisiewicz, W. et al. JOURNAh OF FOOD PROTECTION 62 (12): 1372-1375. 1999 y "Biocontrol of the food-borne pathogens histeria monocytogenes and Salmonella entérica serovar Poona on fresh-cut apples with naturally occurring bacterial and yeast antagonists. " heverentz, B. et al. APPhIED AND ENVIRONMENTAh MICROBIOhOGY 72 (2): 1135-1140. 2006).
Sin embargo, los antagonistas empleados no pertenecen a la especie Pseudomonas graminis y, además, ninguno de ellos es efectivo contra cualquiera de los microorganismos Salmonella spp. histeria spp. y Escherichia coli 0157:H7 tanto a temperatura ambiente como en condiciones de refrigeración.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN Un primer objetivo de la presente invención es proporcionar un cultivo biológico sustancialmente puro de una nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis depositada con el número CBS124167 en la institución de depósito "Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.
Un segundo objetivo es proporcionar un cultivo biológico sustancialmente puro de una nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis depositada con el número
CBS 124167 para su uso como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta para consumo humano.
Un tercer objetivo de la presente invención consiste en el uso del mencionado cultivo biológico de la nueva cepa como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta para consumo humano.
Un cuarto objetivo consiste en proporcionar un método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende el mencionado cultivo biológico de la nueva cepa.
Se ha observado que la nueva cepa aislada muestra una gran efectividad como antagonista frente bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta, en una amplia gama de patógenos y frutas, a temperatura ambiente, en atmósfera modificada y en condiciones de refrigeración. Su aplicación permite reducir el crecimiento de los patógenos durante la vida útil del producto, especialmente cuando se rompe la cadena de frío.
En la presente invención, por bacterias patógenas de transmisión alimentaria se entenderá bacterias patógenas causantes de toxiinfecciones alimentarias o enfermedades originadas por la ingesta de alimentos contaminados, por ejemplo, fruta contaminada con bacterias patógenas del tipo Salmonella spp., histeria spp. o Escherichia coli 0157 :H7.
La nueva cepa de la especie Pseudomonas graminis (Behrendt et al.19991) se aisló de la superficie de una manzana "Golden Delicious" mediante un lavado con agua estéril, seguido de la inmersión en solución de peptona salina (peptona, 1 g/1; NaCl, 0,85 g/1), sonicación en un baño de ultrasonidos durante 10 min y siembra del liquido de lavado en medio de cultivo NYDA (Caldo nutritivo, 8 g/1; extracto de levadura, 5 g/1; dextrosa, 10 g/1 y agar 15 g/1) y posterior incubación a 25 °C durante 3 días.
El cultivo de la nueva cepa ha sido depositado por uno de los solicitantes, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de depósito "Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)" con domicilio en Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrech, Holanda. El número de depósito asignado ha sido el CBS 124167.
El aislado CBS 124167 fue identificado mediante secuenciación parcial de la región 16S rRNA: Pseudomonas sp., y mediante secuenciación total de la región
16S rRNA: Pseudomonas graminis (Behrendt et al.19991).
Características morfológicas y bioquímicas de la nueva cepa
La cepa CBS 124167 es un bacilo gramnegativo, no formador de esporas, oxidasa negativo y catalasa positivo, móvil y aerobio. En placa, las colonias son amarillas, de forma circular con bordes enteros.
La cepa CBS 124167 presenta las características bioquímicas que se detallan en la Tabla 1 y se diferencia fenotípicamente de otras especies de Pseudomonas por las pruebas que se muestran en la Tabla 2.
La temperatura de crecimiento está comprendida entre 5 °C y 30 °C, con un óptimo entre 25 °C y 30 °C. No crece ni a 33 °C ni a 0 °C.
El crecimiento en placas puede llevarse a cabo en medio de cultivo AN (Agar Nutritivo: Triptona 5 g/1, extracto de carne 3 g/1, agar 15 g/1), TSA (Caldo de triptona soja: triptona 15 g/1, peptona de soja 5,0 g/1, cloruro sódico 5,0 g/1 y agar 15 g/1, pH 7,3) o NYDA (Caldo nutritivo: 8 g/1; extracto de levadura, 5 g/1; dextrosa, 10 g/1 y agar 15 g/1).
El crecimiento en líquido puede llevarse a cabo en medio de cultivo TSB (Caldo de triptona soja: digerido pancreático de caseína 17,0 g/1, digerido enzimático de soja 3,0 g/1, cloruro sódico 5,0 g/1, dipotasio hidrógeno fosfato 2,5 g/1, glucosa 2,5 g/1, pH 7,3). También puede usarse el medio NB (Caldo nutritivo: triptona 10 g/1, extracto de carne 5 g/1, cloruro sódico 5 g/1, pH 7,2)
El crecimiento de la cepa CBS 124167 en medio TSB o NB en condiciones aerobias, en agitación y a temperatura de 25 y 30 °C, alcanza un máximo poblacional a las 20-24 h de incubación (generalmente entre 1,9 y 2,9 x 109 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml), sin presentar grandes diferencias entre los dos medios de cultivo.
Tabla 1. Pruebas enzimáticas de las tiras bioquímicas API 20 NE - Sistema de identificación de bacterias de la marca Biomerieux. Resultados después de 24 h y 48 h a 30 °C.
Figure imgf000006_0001
positivo, - negativo, w débil , v variable, nd no determinado) Tabla 2. Características fenotípicas que diferencian la cepa CBS 124167 de otras especies de Pseudomonas.
Característica Cepa CBS 124167 P. graminis" P. lútea P. rhizosphaerae
Oxidasa b
Crecimiento a 6°C + + + nd
Producción de ácido a - partir de glucosa
Utilización de eritritol +
Utilización de sorbitol W + - +
Utilización de xilitol v +
Utilización de melibiosa +
Utilización de rhamnosa +
Hidrólisis de aesculina + + + -
Hidrólisis de gelatina v - : Los datos de las especies de referencia se han tomado de Peix et al. (20033, 20044) y Behrendt et al. (19991). b: +: positivo; - : neg ativo; w: débil; v: reacción variable entre cepas de la misma especie; nd: datos no disponibles
Producción de sustancias antimicrobianas Se han llevado a cabo experimentos para determinar si la cepa CBS 124167 produce sustancias antimicrobianas. Para ello, la cepa se hizo crecer en medio TSB a 30 °C, durante 20-24 h. Del cultivo obtenido, se reservó una fracción, a la que se llamó "cultivo, CUL", que contenía tanto células como medio de cultivo y posibles metabolitos producidos durante el crecimiento. El resto se centrifugó a 8000 rpm durante 10 min, a 10°C. El pH del sobrenadante se ajustó a 6,5 y se esterilizó mediante filtración (0,22 μιη), obteniendo un "sobrenadante neutro libre de células, SNLC". La fracción celular obtenida tras la centrifugación se resuspendió en agua desionizada estéril, se centrifugó y lavó dos veces consecutivas para la eliminación de posibles restos de medio de cultivo, obteniendo únicamente "células, CEL".
Se determinó la efectividad de estas tres fracciones: CUL, SNLC y CEL, en condiciones in vitro, frente a varios cultivos indicadores: Escherichia coli 0157:H7, Salmonella spp., Listeria innocua y Listeria monocytogenes. Para ello, Salmonella spp. y Escherichia coli 0157:H7 se hicieron crecer en medio TSB y Listeria spp. en TYSEB (TSB suplementado con 6 g/1 de extracto de levadura) a 37 °C, durante 18-20 h. Se añadió 50 μΐ de cada uno de los cultivos obtenidos a tubos conteniendo 10 mi de medio TSB (Salmonella spp. y Escherichia coli 0157:H7) o TYSEB (Listeria spp.) conteniendo 7,5 g/1 de agar y temperados a 45°C.
El contenido de cada uno de los tubos (medio + cultivo indicador) se depositó sobre placas conteniendo 20 g/1 extracto de carne, 20 g/1 de glucosa y 15 g/1 de agar. Una vez solidificado, se depositaron 5 mi del CUL, SNLC o CEL y las placas se incubaron a 30 °C, durante 20 h, tras las cuales se indicó la presencia o no de un halo de inhibición.
No se observó inhibición del crecimiento de los patógenos indicadores en aquellos tratamientos donde se inoculó el sobrenadante neutro libre de células por lo que se descarta la producción de sustancias antimicrobianas por parte de la cepa CBS 124167 en las condiciones ensayadas.
También se ha ensayado la efectividad in vivo en manzana cortada del sobrenadante frente a Escherichia coli 0157:H7, Salmonella spp. y Listeria innocua y se ha comparado con la efectividad de las células. Se ha visto que los sobrenadantes libres de células no tienen ningún efecto sobre el patógeno, e incluso favorecen su crecimiento tras 2 días de conservación a 20 °C. Fitopato enicidad
También se ha determinado si la cepa CBS124167 es o no fitopatógena, capaz de producir reacción de hipersensitividad en hojas de tabaco, según la metodología de Noval et al. 1991 2. Para ello se preparó una suspensión de 109" ufc/ml de la cepa y se inyectó en las venas de hojas de tabaco utilizando una jeringuilla de insulina. Se utilizó agua para el control negativo y la cepa CPA-3 de Pantoea ananatis como control positivo, ya que esta cepa sí es fitopatógena. Las plantas se mantuvieron a temperatura ambiente y periódicamente se observó si presentaban o no síntomas de hipersensitividad, en forma de necrosis, amarillamiento de la zona infiltrada y muerte de las hojas. No se observó ninguna reacción en las hojas tratadas, incluso con altas dosis de CBS124167 (109 ufc/ml). Por lo tanto, la cepa CBS124167 no es fitopatógena.
Supervivencia al jugo gástrico en contacto directo y inoculada en manzana Para valorar la supervivencia en contacto directo, se añadieron 50 mi de una suspensión de 109 ufc/ml de la cepa CBS 124167 en una solución simulada de saliva y jugo gástrico (6,2 g/1 NaCl, 2,2 g/1 KC1, 0,22 g/1 de CaCl2 y 1,2 g/1 NaHC03, 0,3 g/1 pepsina; pH ajustado a 2,0, temperada a 37 °C) y se incubó a 37 °C, durante 2 h. Se tomó muestra al cabo de 1 y 2 h. No se detectó ninguna célula viable de la cepa de la presente invención, incluso tras 10 min de contacto.
Para valorar la supervivencia al jugo gástrico de la cepa CBS 124167 sobre manzana, se inocularon manzanas "Golden Delicious" con la cepa CBS 124167 a una dosis de 10 ufc/ml mediante inmersión en baño durante 2 min. Se dejaron secar y se envasaron en barquetas de polipropileno y se sellaron con film de polipropileno de 35 μιη de grosor y una permeabilidad al 02 y C02 de 3500 cm 3 /m 2 *dia*atm a 23 °C, y al vapor de agua de 0,9 g/m *día a 25 °C y 75 % de humedad relativa, y se conservaron a 5°C. Tras 0, 4, 7 y 14 días, se tomaron 10 g y se sometieron a una simulación de tránsito gástrico. Para ello se mezclaron con 10 mi de solución artificial de saliva (6,2 g/1 NaCl, 2,2 g/1 KC1, 0,22 g/1 de CaCl2 y 1,2 g/1 NaHC03), temperada a 37 °C. Se homogenizó durante 2 min y se transfirió a un matraz Erlenmeyer con 80 mi de jugo gástrico (0,3 g/1 pepsina; pH 2,0) y se incubó a 37 °C durante 2 h. A continuación se determinó la población viable de la cepa, mediante siembra en placas de medio AN.
No se observaron células viables tras 2 h de contacto con el jugo gástrico en ninguna de las muestras analizadas. Por tanto, puede deducirse que la cepa de la presente invención no sobrevive al paso gástrico. Esto es positivo pues, aunque las células crezcan sobre la superficie de la fruta durante su conservación, dichas células no pueden causar ningún daño al ingerir la fruta tratada ya que no sobrevivirán al tránsito gástrico. Cabe mencionar también que no se han encontrado referencias que relacionen la especie Ps. graminis con casos de toxiinfecciones alimentarias.
Crecimiento en la fruta
Se ha observado que la cepa CBS124167 es capaz de crecer en manzana, melocotón y melón cortados a distintas temperaturas, aunque el crecimiento es mucho mayor en melón, debido a su menor acidez (mayor pH). También se ha observado crecimiento en manzana conservada en condiciones de atmósfera modificada y a temperatura o condiciones de refrigeración. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se ha observado que la cepa CBS 124167 es muy efectiva contra bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta, preferiblemente, en fruta cortada a trozos y, ventajosamente, contra los microorganismos Salmonella spp., Listeria spp., y/o Escherichia coli 0157.Ή7, que son los más importantes en frutas y hortalizas.
Gracias a ello, la cepa CBS 124167 puede usarse como antagonista contra cualquiera de dichos microorganismos, favoreciendo el cumplimiento de los criterios microbiológicos establecidos especialmente para fruta cortada o fruta de cuarta gama, para evitar las toxiinfecciones alimentarias o enfermedades originadas por la ingesta de fruta contaminada con bacterias del tipo Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli 0157:H7.
En particular, la efectividad en Salmonella spp. se ha observado para la especie Salmonella choleraesuis, mientras que la efectividad en Listeria spp. se ha observado para las especies Listeria monocytogenes y Listeria innocua.
Según una primera realización de la presente invención, la cepa de la presente invención se usa para el control biológico en fruta, preferiblemente fruta cortada a trozos, manteniendo la fruta a una temperatura superior a 10 °C, preferiblemente, una temperatura igual o superior a 20 °C.
A temperatura ambiente, se ha observado que la cepa CBS 124167 puede frenar el crecimiento, e incluso reducir, a cualquiera de los microorganismos antes citados, inclusive cuando estos microorganismos están presentes en la fruta a una concentración igual o superior a 10 ufc/g, que es una concentración muy elevada y difícil que se dé en la realidad.
Este uso es particularmente ventajoso ya que permite controlar el crecimiento de los patógenos en los casos en que la temperatura de conservación de la fruta no es la adecuada, o se corta la cadena de frío del producto durante el almacenamiento o transporte, por ejemplo, por problemas en el mantenimiento de los equipos de refrigeración de la fruta. Es muy importante que la cepa sea efectiva a temperatura ambiente, ya que a esta temperatura es cuando el microorganismo patógeno puede crecer más y por tanto se incrementa el riesgo en el consumidor.
Según una segunda realización, la cepa de la presente invención se usa para el control biológico en fruta, por ejemplo fruta cortada a trozos, manteniendo la fruta en condiciones de refrigeración. Por condiciones de refrigeración se entenderá el mantenimiento de la fruta a una temperatura de refrigeración igual o inferior a 10°C, preferiblemente, igual o inferior a 5°C.
Sorprendentemente, la efectividad de la cepa CBS124167 contra cualquiera de los microorganismos Salmonella spp., histeria spp. y Escherichia coli 0157:H7 se ha demostrado también a las temperaturas de refrigeración que son las que marca el productor o distribuidor para la conservación de la fruta.
Según una tercera realización, la cepa de la presente invención se usa para el control biológico en fruta, preferiblemente, fruta cortada, manteniendo la fruta en una atmósfera modificada. Por atmósfera modificada se entenderá una atmósfera con una composición de gases diferente a la del aire para mejorar las condiciones en que se conserva la fruta.
La cepa de la presente invención muestra también efectividad cuando la fruta es envasada en atmósfera modificada para su conservación. Gracias a ello, la cepa puede ser empleada en las condiciones habituales de comercialización, por lo que es posible garantizar la seguridad alimentaria también en las condiciones de los lineales de los supermercados o tiendas.
Ventajosamente, dicha fruta es fruta con un pH comprendido entre 3 y 7, por ejemplo, frutas como manzana, melocotón y/o melón.
Se ha observado que el crecimiento de Salmonella spp., Listeria spp. o Escherichia coli 0157:H7 puede darse en un amplio rango de fruta, a pesar de las condiciones de acidez de ciertas frutas como la manzana. También, se ha observado que el crecimiento de las mencionadas bacterias es muy rápido en frutas menos ácidas como el melón. Sin embargo, gracias a la cepa de la presente invención, el crecimiento de estos patógenos puede ser controlado en un amplio rango de frutas.
Tal y como se ha comentado en la descripción de la invención, un objetivo de la presente invención es el de proporcionar un método de preparación de fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende el cultivo biológico de la nueva cepa CBS 124167.
Según una realización preferida de dicho método, la fruta es cortada a trozos antes de aplicar dicha preparación.
Preferiblemente, la concentración de la cepa CBS 124167 en dicha preparación es igual o superior a la concentración estimada de patógeno que puede contener la fruta, preferiblemente, la fruta cortada.
Según una realización, la concentración de dicha cepa en la preparación es igual o superior a 105 ufc/ml.
Se ha observado que esta concentración tiene efectos contra cualquiera de los tres microorganismos Salmonella spp., histeria spp. y/o Escherichia coli 0157:H7 y a concentraciones mucho más elevadas de las que dichos microorganismos pueden encontrarse en la fruta cortada en la realidad.
Ventajosamente, la concentración de dicha cepa en la preparación es igual
7
5 o superior a 10 ufc/ml.
Se ha observado que esta concentración garantiza una reducción de las bacterias patógenas de al menos dos unidades logarítmicas (dos unidades de la escala logarítmica decimal), independientemente de la concentración de bacterias patógenas de la fruta.
10 Según otra realización, el método comprende la etapa de envasar la fruta una vez aplicada dicha preparación.
Ventajosamente, dicho método comprende también la etapa de proporcionar a la fruta una atmósfera modificada y/o la etapa de proporcionar a la fruta una temperatura de refrigeración, por ejemplo, una temperatura igual o inferior a 15 10 °C, preferiblemente, una temperatura igual o inferior a 5 °C.
La atmósfera modificada puede proporcionarse de una forma pasiva, por ejemplo, envasando el producto mediante la utilización de películas plásticas de diferente permeabilidad a los gases, creando de forma pasiva una atmósfera modificada favorable como resultado de la permeabilidad de la pared del envase y 20 factores como la respiración del producto y cambios bioquímicos.
El envasado del producto en atmósfera modificada contribuye a mantener la calidad de frescura de la fruta cortada durante más tiempo, por lo que la vida útil del producto se alarga.
Tal y como se ha comentado anteriormente, la cepa de la presente
25 invención es efectiva también en estas condiciones de envasado en atmósfera modificada.
Ventajosamente, dicho método de preparación de la fruta, preferiblemente fruta cortada, comprende la etapa de aplicar un antioxidante a la fruta, antes de aplicar la suspensión que contiene la cepa.
30 Se ha observado que la cepa de la presente invención no se ve alterada por el empleo de algunas sustancias antioxidantes, por lo que dichas sustancias antioxidantes pueden emplearse para retardar la oxidación de la fruta. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para mayor comprensión de cuanto se ha expuesto se acompañan unos dibujos en los que, esquemáticamente y sólo a título no limitativo, se representan resultados de varios ejemplos de realización.
En dichos dibujos,
la figura 1 es una representación gráfica que muestra la población de Escherichia coli 0157:H7 en los cilindros de manzana tras la inoculación (concentración inicial), tras 2 días de incubación a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra el antagonista CBS 124167. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estándar. Los números entre paréntesis indican la media de la reducción obtenida.
la figura 2 es una representación gráfica que muestra la población de Salmonella choleraesuis BAA-709 en los cilindros de manzana tras la inoculación (concentración inicial), tras 2 días de incubación a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS 124167. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estándar. Los números entre paréntesis indican la media de la reducción obtenida.
la figura 3 es una representación gráfica que muestra la población de Listeria innocua CECT-910 en los cilindros de manzana tras la inoculación (concentración inicial ), tras 2 días de incubación a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS 124167. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estándar. Los números entre paréntesis indican la media de la reducción obtenida.
la figura 4 es una representación gráfica que muestra la población de Escherichia coli 0157:H7 en los cilindros de melocotón tras la inoculación (concentración inicial), tras 2 días de incubación a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS 124167. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estándar. Los números entre paréntesis indican la media de la reducción obtenida.
la figura 5 es una representación gráfica que muestra la población de Salmonella choleraesuis BAA-709 en los cilindros de melocotón tras la inoculación (concentración inicial), tras 2 días de incubación a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS 124167. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estándar. Los números entre paréntesis indican la media de la reducción obtenida.
la figura 6 es una representación gráfica que muestra la población de Listeria innocua CECT-910 en los cilindros de melocotón tras la inoculación (concentración inicial), tras 2 días de incubación a 20 °C sin antagonista (control) y con 10 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS 124167. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estándar. Los números entre paréntesis indican la media de la reducción obtenida.
la figura 7 es una representación gráfica que muestra la población de Salmonella choleraesuis BAA-709 en los cilindros de melón tras la inoculación (concentración inicial) y tras 2 días de incubación a 20 °C sin antagonista (control) y con 12 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS 124167. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estándar. Los números entre paréntesis indican la media de la reducción obtenida.
la figura 8 es una representación gráfica que muestra la población de Listeria monocytogenes LM230/3 en los cilindros de melón tras la inoculación (concentración inicial), tras 2 días de incubación a 20 °C sin antagonista (control) y con 12 de los antagonistas seleccionados, entre los que se encuentra la cepa CBS 124167. Los valores representan la media de 6 valores (2 ensayos con 3 repeticiones cada uno) y las barras representan el error estándar. Los números entre paréntesis indican la media de la reducción obtenida.
la figura 9 es una representación gráfica que muestra la evolución en el tiempo de la población de Escherichia coli 0157:H7 en cilindros de manzana co- inoculados o no con una suspensión de la cepa CBS 124167 (10 ufc/ml) y conservados a 5 °C.
la figura 10 es una representación gráfica que muestra la evolución en el tiempo de la población de Escherichia coli 0157:H7 en cilindros de melocotón co- inoculados o no con una suspensión de la cepa CBS 124167 (10 ufc/ml) y conservados a 5 °C y a lO °C. la figura 11 es una representación gráfica que muestra la evolución en el tiempo de la población de Salmonella cholearaesuis BAA-709 en cilindros de melocotón co-inoculados o no con una suspensión de la cepa CBS 124167 (10 ufc/ml) y conservados a 5 °C.
la figura 12 es una representación gráfica que muestra la evolución en el tiempo de la población de Salmonella cholearaesuis BAA-709 en cilindros de melón co-inoculados o no con una suspensión de la cepa CBS 124167 (10 ufc/ml) y conservados a 5 °C y a 10 °C.
la figura 13 es una representación gráfica que muestra la evolución en el tiempo de la población de un cóctel de cepas de Listeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3) en cilindros de melón co-inoculados o no con la cepa CBS 124167 a distintas concentraciones y conservados a 10 °C.
la figura 14 es una representación gráfica que muestra la evolución en el tiempo de la población de un cóctel de cepas de Salmonella choleraesuis (BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) en cilindros de melón co-inoculados o no con la cepa CBS 124167 a distintas concentraciones y conservados a 10 °C.
la figura 15 es una representación gráfica que muestra la evolución en el tiempo de la población de un cóctel de cepas de Salmonella choleraesuis (BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) en manzana cortada tratada con antioxidante e inoculada o no con la cepa CBS124167 a 10' ufc/ml, mediante inmersión durante 2 min, y conservada en envasado en atmósfera modificada (MAP) a 5 °C y 10 °C.
la figura 16 es una representación gráfica que muestra la evolución en el tiempo de la población de un cóctel de cepas de Listeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3) en manzana cortada tratada con antioxidante e inoculada o no con la cepa CBS124167 a 10' ufc/ml, mediante inmersión durante 2 min, y conservada en envasado en atmósfera modificada (MAP) a 5 °C y 10 °C.
DESCRIPCIÓN DE EJEMPLOS
A continuación se exponen distintos ensayos los cuales deben interpretarse como un medio auxiliar para la mejor comprensión de la invención y no como limitaciones al objeto de la misma.
El efecto antagonista se ha ensayado en distintas cepas de los géneros Salmonella y Listeria y en una cepa de Escherichia coli 0157:H7. Estos patógenos son los más importantes en frutas y hortalizas. En la Tabla 3 adjunta aparecen las cepas de microorganismos patógenos de transmisión alimentaria utilizados en los ensayos.
En primer lugar, se describen los ejemplos realizados para demostrar la efectividad en condiciones de laboratorio. En segundo lugar, se describen los ejemplos realizados para demostrar la efectividad en condiciones que simulan la producción comercial.
Ensayos para demostrar la efectividad de la cepa CBS 124167 frente a los principales patógenos de transmisión alimentaria en fruta cortada en condiciones de laboratorio.
A continuación se describen una pluralidad de ejemplos de ensayos en condiciones de laboratorio que demuestran la efectividad de la cepa CBS 124167 aplicada a distintas dosis, en distintas frutas, a temperatura ambiente y en condiciones de refrigeración.
Las cepas de microorganismos patógenos utilizados en estos ensayos fueron: histeria innocua (CECT-910), Escherichia. coli 0157:H7 (NCTC-12900), y Salmonella choleraesuis (BAA-709, BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) y, en algún caso, histeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT- 940 y LM230/3), (ver Tabla 3).
Las frutas se desinfectaron previamente mediante aspersión con etanol 70%. A continuación se prepararon trozos en forma cilindrica de la fruta a ensayar, mediante un sacabocados, de dimensiones 1,2 cm de diámetro y 1 cm de altura, que equivalen aproximadamente a 1 g de fruta. Estos trozos se introdujeron en el interior de tubos de ensayo estériles y se inocularon con 15 μΐ de una suspensión que contenía los dos microorganismos (patógeno y antagonista), llámese co-inoculación. En el tratamiento control, el patógeno se añadió a un tubo con 10 mi de agua estéril (sin microorganismo antagonista). Tras la co-inoculación, se dejó secar la fruta a temperatura ambiente. A continuación, se tomaron 3 tubos, de los que se midió la concentración inicial de patógeno mediante siembra en medios de cultivo específicos. Los otros tubos se conservaron a 20 °C, 10 °C o 5 °C, en función del ensayo. Al cabo de 2 días (ensayos conservación a 20 °C), o de 2-3 días, 5-7 días y 10 días (ensayos a 5 o 10 °C), se volvió a determinar la concentración de patógeno por trozo de fruta en las muestras con antagonista (tratamiento con antagonista) y en las que no tenían antagonista (tratamiento control). Los datos de concentración se transformaron a logaritmo decimal. Para calcular el valor de reducción del crecimiento del patógeno se usó la siguiente fórmula:
Reducción (unidades logarítmicas decimales) = logioCt-COntroi - logio Ct+antagonista, donde:
Ct-controi es la concentración del patógeno en el tratamiento control después de "t" días de conservación, y Ct+antagonista es la concentración del patógeno en el tratamiento con antagonista después de "t" días de conservación.
Valores positivos de la reducción indican que el crecimiento del patógeno en la fruta ensayada en presencia del antagonista es menor que el mismo sin antagonista. A mayor valor, mayor efectividad frente al patógeno estudiado
En los ensayos a temperatura ambiente (20 °C), para obtener la suspensión de la cepa CBS 124167 y de las otras cepas ensayadas, se utilizó la producción en medio NYDA incubado a 25 °C durante 48 h. Se tomaron colonias aisladas que se suspendieron en agua desionizada estéril y a partir de dicha suspensión se preparó otra suspensión que se ajustó, mediante un espectrofotometro, a distintos porcentajes de transmitancia (λ=420 nm) que se corresponden con las distintas concentraciones de antagonistas ensayadas (105 ufc/ml, 106 ufc/ml, 107 ufc/ml y 108 ufc/ml).
En los ensayos en condiciones de refrigeración (5 °C o 10 °C), para obtener la suspensión de la cepa CBS 124167, se utilizó la producción en medio líquido. Para ello, se inoculó un matraz Erlenmeyer con 50 mi de TSB, que se incubó a 30°C durante 20-24 h. Se centrifugó durante 10 min a 10000 rpm y se redisolvió con 25 mi de agua desionizada estéril.
Los patógenos se inocularon en tubos conteniendo 10 mi de medio TSB (Salmonella choleraesuis BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711 y Escherichia coli 0157:H7) o TYSEB {histeria innocua CECT-910 y histeria monocytogenes
CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3), que se incubaron a 37 °C durante 20-24 h. A continuación se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min y el precipitado celular se redisolvió con 5 mi de solución salina (0,85 g/1 de NaCl). Mediante la medición de la transmitancia a 420 nm y una curva previamente obtenida en el laboratorio para cada uno de los patógenos, se determinó la concentración estimada de patógeno. Tabla 3. Listado de cepas de microorganismos patógenos de transmisión alimentaria utilizados en los ensayos.
Figure imgf000018_0001
*: Aislada de lechuga fresca cortada en nuestro laboratorio (Abadías et al. 20085)
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo; ATTC: American Type Culture CoUection; NCTC: National CoUection of Type Cultures.
Las concentraciones de patógeno ensayadas oscilan entre 105 ufc/ml y 10 ufc/ml. Sin embargo, en condiciones reales se estima que la concentración de patógeno 10 5 ufc/ml, que en los ensayos realizados corresponde a 103 ufc/g de producto, es incluso una concentración muy elevada de patógeno (Sallen et al., 20036; Nguz et al., 2005 ), por lo que los resultados obtenidos se presentan en condiciones desfavorables/adversas para la cepa CBS 124167. Ejemplo 1. Efectividad de la cepa CBS 124167 frente a distintos patógenos de transmisión alimentaria en manzana "Golden Delicious" a 20°C
Las figuras 1 a 3 muestran un ejemplo de resultados obtenidos frente a las cepas de Escherichia coli 0157:H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 y Listeria innocua CECT-910, en manzana "Golden Delicious", comparando la efectividad de la cepa CBS 124167 con otras cepas aisladas en el laboratorio y que se ensayaron en las mismas condiciones.
La suspensión que se inoculó tenía una concentración de la cepa CBS 124167
8 7
de aproximadamente 10 ufc/ml y 10 ufc/ml de microorganismo patógeno. El pH de las manzanas fue de 3,8+0,2 y la acidez entre 1,6 y 2,9 g ácido málico/1.
Tal y como muestra la figura 1, la concentración inicial de E. coli 0157:H7 fue de 5, 1 logioufc/g y aumentó en el tratamiento control (sin antagonista) hasta 6,8 logioufc/g. En cambio, en los trozos co-inoculados con distintos antagonistas, el crecimiento fue menor, observándose reducciones entre 1,0 y 1,6 unidades logarítmicas. En el caso de la cepa CBS124167, la población de patógeno tras los dos días de conservación a 20 °C fue menor incluso que la inicial (2,4 logio ufc/g), lo que nos indica una reducción efectiva de 4,5 unidades logarítmicas.
Resultados similares se obtuvieron cuando se ensayó la efectividad de distintas cepas frente a Salmonella BAA-709 (figura 2), con reducciones entre 0,3 y 1,0 unidades logarítmicas en el caso de los otros antagonistas y de 4,7 unidades logarítmicas en el caso de la cepa CBS 124167.
El crecimiento de Listeria innocua en manzana no tratada con antagonista tras la conservación a 20 °C durante 2 días fue mayor, de 2,5 logio ufc/g. En el caso de algunos de los antagonistas aislados en el laboratorio la reducción fue notable, entre
1,1 y 2,2 unidades logarítmicas, pero la cepa CBS 124167 mostró unos resultados mucho mejores, con una reducción de 5,9 unidades logarítmicas tras la conservación, lo que indica que la población de Listeria innocua en manzanas que habían sido tratadas con la cepa CBS 124167 fue menor de 2 logio ufc/g (figura 3).
Ejemplo 2. Efectividad de la cepa CBS 124167 frente a distintos patógenos de transmisión alimentaria en distintas variedades de melocotón a 20°C
Las figuras 4 a 6 muestran un ejemplo de resultados obtenidos frente a las cepas de Escherichia coli 0157:H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 y histeria innocua CECT-910, en melocotón, comparando la efectividad de la cepa CBS 124167 con otras cepas aisladas en el laboratorio y que se ensayaron en las mismas condiciones.
Se utilizaron melocotones de las variedades "Merry O'Henry", "Tardibelle", "Roig d'Albesa", "Placido", "Royal Glory" y "Elegant Lady". La suspensión que se inoculó tenía una concentración de la cepa CBS 124167 de aproximadamente
10 8 ufc/ml y 107 ufc/ml de microorganismo patógeno. El pH de los melocotones utilizados fue de 3,6-5,3, con una acidez entre 2,8 y 7,8 g ácido málico/1.
Tal y como muestra la figura 4, la concentración inicial de E. coli 0157:H7 en melocotón fue de 4,9 logioufc/g, y aumentó aproximadamente 3 unidades logarítmicas en los trozos no tratados con antagonista tras 2 días de conservación a 20 °C. En los trozos inoculados con algunos de los antagonistas aislados, la concentración de E. coli 0157:H7 se redujo entre 1,8 y 3,0 unidades logarítmicas, mientras que con la cepa CBS 124167, la reducción fue de 4,3 unidades logarítmicas, siendo la concentración a los 2 días incluso inferior a la inicial, lo que demuestra su gran efectividad.
En la figura 5 se muestran los resultados del mismo ensayo, pero realizado con la cepa de Salmonella BAA-709. En este caso, el incremento en la población tras dos días de conservación a 20 °C fue menor que el de E. coli 0157:H7, con aproximadamente 2,5 log de incremento. En general, las reducciones con los otros antagonistas fueron menores, entre 0,4 y 1,8 logaritmos, pero la reducción de Salmonella BAA-709 en aquellos trozos de manzana tratados con la cepa CBS 124167 fue la mayor con 2,8 unidades logarítmicas.
La figura 6 muestra los datos referentes a histeria innocua en melocotón. En esta figura 6 se observa que la población de histeria innocua en el tratamiento control (sin antagonista) también aumentó aproximadamente 3 unidades logarítmicas en cada trozo de melocotón, mientras que en aquellos trozos inoculados con distintos antagonistas aislados en el laboratorio, la población fue menor, observándose reducciones entre 0,7 y 2,1 unidades logarítmicas. De nuevo, la reducción obtenida con la cepa CBS 124167 fue superior, de 4 unidades logarítmicas, logrando también que la población final fuera incluso inferior a la inicial.
Ejemplo 3. Efectividad de la cepa CPA-7 frente a distintos patógenos de transmisión alimentaria en melón a 20 °C Las figuras 7 y 8 muestran un ejemplo de resultados obtenidos frente a las cepas de Salmonella choleraesuis BAA-709 y histeria monocytogenes LM230/3, en melón, comparando la efectividad de la cepa CBS 124167 con otras cepas aisladas en el laboratorio y que se ensayaron en las mismas condiciones.
El melón es una fruta con pH más neutro y menos acidez que la manzana y 5 el melocotón (pH 5,7-6,5, acidez 0,7-1,9 g ácido cítrico/1, generalmente). En este caso, la problemática de los patógenos es más importante porque el pH no ejerce de barrera al crecimiento de los patógenos de transmisión alimentaria. La suspensión que se inoculó tenía una concentración de la cepa CBS 124167 de aproximadamente
10 8 ufc/ml y 107 ufc/ml de microorganismo patógeno.
10 La figura 7 muestra los resultados de distintas cepas de microorganismos antagonistas, incluida la CBS 124167 frente a Salmonella en trozos de melón "Piel de sapo". En este caso, los valores de reducción oscilaron entre 1,5 y 3,2 unidades logarítmicas, siendo la reducción mayor la obtenida con la cepa CBS 124167, con un total de 3,5 unidades logarítmicas. Puede observarse que el crecimiento de Salmonella
15 en melón en el tratamiento control (sin antagonista) tras 2 días de conservación a 20 °C fue muy elevado, de 4,2 unidades logarítmicas, superándose la población en más de
Q
10 ufc/g de producto.
La figura 8 muestra la efectividad de la cepa CBS 124167 frente a la cepa de histeria monocytogenes LM230/3, en melón conservado 2 días a 20 °C. Tal y como
20 puede observarse, en este caso, también hay una reducción del patógeno respecto al control no tratado.
Ejemplo 4. Efectividad de la cepa CBS124167 frente a Escherichia coli Q157:H7 en manzana "Golden Delicious" en condiciones de refrigeración
25
La figura 9 muestra el resultado de la efectividad de la cepa CBS 124167 frente a E. coli 0157:H7 en manzana "Golden Delicious" conservada a 5 °C. El ensayo se realizó mediante co-inoculación de 15 μΐ de una suspensión que contenía ambas cepas, E. coli 0157:H7 a 107 ufc/ml y CBS 124167 (30 % transmitancia,
Q
30 aproximadamente 10 ufc/ml).
Tal y como puede verse en la figura, a 5 °C no se observó crecimiento de E. coli 0157:H7 en manzana cortada en el tratamiento control, en cambio, en las muestras co-inoculadas con el antagonista, se vio una reducción a partir del segundo día de conservación y, a partir de los 7 días, la población se redujo por debajo de 35 10 ufc/g. Ejemplo 5. Efectividad de la cepa CBS 124167 frente a distintos patógenos de transmisión alimentaria en melocotón en condiciones de refrigeración
5 Las figura 10 y 11 muestran la efectividad de la cepa CBS 124167 en melocotón (variedades "Elegant Lady" y "Plácido"), a 5 y 10 °C, frente a Escherichia coli 0157:H7 y Salmonella BAA-709. La suspensión que se inoculó tenía una concentración de la cepa CBS 124167 de aproximadamente 10 8 ufc/ml y 107 ufc/ml de microorganismo patógeno.
10 Tal y como muestra la figura 10, la cepa CBS 124167 reduce la concentración de patógeno, siendo esta reducción mayor a 5 °C que a 10 °C y manteniéndose incluso por debajo del límite de detección tras 6 días de conservación.
Resultados similares se obtuvieron cuando la cepa CBS 124167 se utilizó frente a Salmonella en melocotón de la variedad "Placido" (figura 11). En este caso, 15 tras 6 días de conservación a 5 °C, no se detectó Salmonella en los trozos de melocotón cortado, mientras que la población se mantuvo en el tratamiento sin antagonista
(control).
Ejemplo 6. Efectividad de la cepa CBS 124167 frente a Salmonella choleraesuis BAA- 20 709, en melón en condiciones de refrigeración
La figura 12 muestra la efectividad de la cepa CBS 124167 en melón conservado a 10 °C frente a Salmonella BAA-709. La suspensión que se inoculó tenía una concentración de la cepa CBS 124167 de aproximadamente 10 8 ufc/ml y 107 ufc/ml
25 de microorganismo patógeno.
Tal y como muestra la figura, a 10 °C el patógeno creció en el tratamiento control (sin antagonista), mientras que el tratamiento en el que se aplicó CBS 124167 la población se mantuvo más baja, con una reducción de más de 1,5 unidades logarítmicas a partir del sexto día de conservación. A 5 °C, en las condiciones
30 ensayadas, Salmonella no fue capaz de crecer y la adición de la cepa CBS 124167 no representó ningún cambio respecto el tratamiento control. Ejemplo 7. Efectividad de la cepa CBS 124167 aplicada a distintas dosis frente a distintos patógenos de transmisión alimentaria en manzana Golden Delicious a 20°C
Las tablas 4, 5 y 6 muestran la efectividad de la cepa CBS 124167 aplicada a distintas dosis, y frente a distintas concentraciones de patógenos Escherichia coli 0157:H7, Salmonella choleraesuis BAA-709 y histeria innocua CECT-910. Esta efectividad se midió en unidades logarítmicas decimales de reducción de crecimiento según la fórmula citada más arriba.
Tal y como puede observarse en las tablas adjuntas, los resultados muestran reducción del crecimiento de patógenos para concentraciones de la cepa CBS 124167 iguales o superiores a la concentración inoculada de patógeno.
Tabla 4. Valores de reducción (unidades logarítmicas decimales) de Escherichia coli 0157:H7 aplicada a distintas concentraciones, en función de la dosis de la cepa CBS 124167, en manzana "Golden Delicious" conservada a 20°C durante 2 días.
Concentración de
Escherichia coli 0157:H7
inoculada (ufc/ml)
Dosis cepa CBS 124167 105 106 107
(ufc/ml)
108 4,7 6,1 3,6
107 3,8 3,4 2,0
106 1,5 1,7 0,6
105 0,7 1,6 0,3
Tabla 5. Valores de reducción (unidades logarítmicas decimales) de Salmonella choleraesuis BAA-709 aplicada a distintas concentraciones, en función de la dosis de la cepa CBS124167, en manzana "Golden Delicious" conservada a 20°C durante 2 días.
Figure imgf000024_0001
Tabla 6. Valores de reducción (unidades logarítmicas decimales) de histeria innocua aplicada a distintas concentraciones, en función de la dosis de la cepa CBS 124167, en manzana 'Golden Delicious' conservada a 20°C durante 2 días.
Figure imgf000024_0002
En el caso de Salmonella y histeria innocua, inoculadas en manzana, la relación 1: 1 (patógeno antagonista) es suficiente para observar reducciones superiores a 1,9 unidades logarítmicas. De las dosis ensayadas, la 10 ufc/ml es la que presenta los resultados más buenos para los tres patógenos (reducciones superiores a 3,5 unidades logarítmicas). No obstante, la dosis 10 ufc/ml de la cepa CBS 124167 es la que se considera más adecuada para la aplicación comercial, ya que garantiza un mínimo de dos unidades logarítmicas de reducción para los tres patógenos estudiados, independientemente de la concentración de bacterias patógenas de la fruta.
Ejemplo 8. Efectividad de la cepa CBS 124167 aplicada a distintas dosis frente a distintos patógenos de transmisión alimentaria en melón a 20°C y 10°C
En este ejemplo, se utilizó un cóctel de cepas de Salmonella choleraesuis (BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) o de histeria mono cyto genes (CECT- 4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3).
Las tablas 7 y 8 muestran la efectividad en melón conservado a 20 °C de la cepa CBS124167, aplicada a distintas dosis, y frente a distintas concentraciones de cóctel de patógenos de los géneros Salmonella y histeria mono cyto genes . Esta efectividad se midió en unidades logarítmicas decimales de reducción de crecimiento según la fórmula citada más arriba. Tabla 7. Valores de reducción (unidades logarítmicas decimales) de Salmonella choleraesuis aplicada a distintas concentraciones, en función de la dosis de la cepa CBS 124167, en melón "Piel de sapo" conservado a 20 °C durante 2 días.
Concentración de
Salmonella choleraesuis
inoculada (ufc/ml)
Dosis CBS 124167 105 107
(ufc/ml)
108 7,3 2,1
107 3,7 0,9
106 0,2 0,4 Tabla 8. Valores de reducción (unidades logarítmicas decimales) de Listeria monocytogenes aplicada a distintas concentraciones, en función de la dosis de la cepa CBS 124167, en melón "Piel de sapo" conservado a 20 °C durante 2 días.
Figure imgf000026_0001
Tal y como puede verse en las tablas, en melón, la dosis 10 ufc/ml de la cepa CBS 124167 muestra valores de reducción de crecimiento iguales o superiores a 3,7 unidades logarítmicas de Salmonella y Listeria monocytogenes aplicadas a 105 ufc/ml de melón que equivale aproximadamente a 10 ufc/g melón.
Las figuras 13 y 14 muestran la efectividad a distintas concentraciones de la cepa CBS 124167, en melón conservado a 10 °C, frente a los mencionados cócteles de Salmonella choleraesuis y Listeria monocytogenes aplicados a una concentración de 105 ufc/ml.
Tal y como muestran las figuras, la reducción de Listeria monocytogenes y Salmonella es mayor a mayor concentración de la cepa CBS 124167.
Ensayo para demostrar la efectividad de la cepa antagonista CBS 124167 frente a los principales patógenos de transmisión alimentaria en fruta cortada en condiciones que simulan la producción comercial.
A continuación se describe un ejemplo de un ensayo en manzana "Golden Delicious" en condiciones que simulan la producción comercial.
En este ejemplo se utilizó un cóctel de cepas de Salmonella choleraesuis (BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) y un cóctel de cepas de Listeria monocytogenes (CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3).
Las manzanas enteras se desinfectaron, se descorazonaron y se cortaron en diez gajos. A continuación se sumergieron en un baño que contenía el antioxidante NatureSeal® ASI (6%, Agricoat Ltd., Great Shefford, UK), durante 2 min y en agitación, y se dejaron secar.
Una vez tratados con antioxidante, los trozos de manzana se sumergieron en una suspensión que contenía el cóctel de cepas del patógeno y el antagonista, durante 1 min y en agitación, simulando la aplicación que tendría lugar en un tanque de la línea de tratamiento de fruta. En el tratamiento control, los trozos de manzana se sumergieron en una suspensión que contenía el cóctel de cepas del patógeno sin la cepa antagonista.
A continuación, los trozos de manzana se dejaron escurrir y se envasaron (200 g) en barquetas de polipropileno de 500 mi de capacidad y se sellaron con un film de polipropileno del tipo habitualmente empleado de 35 μιη de grosor y una permeabilidad al 02 y C02 de 3500 cm 37m 2"*día*atm a 23°C, y al vapor de agua de 0,9 g/m *día a 25°C y 75% de humedad relativa. Debido a la respiración del fruto y las características de permeabilidad al 02 y al C02 del film, se crea en el interior del envase una atmósfera modificada pasiva (MAP). La cepa antagonista CBS 124167 puede verse afectada por esta atmósfera, por lo que su efectividad ha de demostrarse también en estas condiciones de atmósfera modificada.
Los trozos de manzanas se conservaron a 5 °C y a 10 °C durante 15 días (vida útil estimada para este tipo de productos). Periódicamente se realizaron recuentos microbiológicos y se hizo una determinación de distintos parámetros de calidad (color, textura, pH, acidez, contenido en sólidos solubles y calidad visual).
Para obtener la suspensión de la cepa CBS 124167, se utilizó la producción en medio líquido TSB y se ajustó el porcentaje de transmitancia (λ=420 nm) para una concentración de la cepa de 10 ufc/ml.
Los patógenos se inocularon en tubos conteniendo 10 mi de medio TSB (Salmonella choleraesuis BAA-707, BAA-709, BAA-710 y BAA-711) o TYSEB (Listeria monocytogenes CECT-4031, CECT-4032, CECT-933, CECT-940 y LM230/3), que se incubaron a 37 °C durante 20-24 h. A continuación se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min y el precipitado celular se redisolvió con 5 mi de solución salina (0,85 g/1 de NaCl). Mediante la medición de la transmitancia a 420 nm y una curva previamente obtenida en el laboratorio para cada uno de los patógenos, se determinó la concentración estimada de patógeno, que en el ensayo que se describe fue una suspensión con una concentración de 105 ufc/ml. Ejemplo 9. Efectividad de la cepa CBS 124167 en condiciones que simulan las comerciales frente a distintos patógenos de transmisión alimentaria en manzana "Golden Delicious" cortada y envasada a diferentes temperaturas Las figuras 15 y 16 muestran los resultados obtenidos frente a los mencionados cócteles de cepas de Salmonella y Listeria mono <cyto 'genes, en manzana "Golden Delicious" a 5 °C y 10 °C.
La suspensión que se inoculó mediante inmersión de los trozos de manzana contenía una concentración de la cepa CBS 124167 de 10 ufc/ml y una concentración de 105 ufc/ml de ambos microorganismos patógenos.
Tal y como puede observarse en las figuras, la cepa CBS124167 ha resultado efectiva frente a Salmonella, especialmente a 10 °C, donde se observó crecimiento. En el caso de Listeria monocytogenes, se observó reducción del crecimiento tanto a 5 °C como a 10 °C.
Por lo tanto, puede concluirse que la cepa CBS 124167 es efectiva frente a distintos patógenos de transmisión alimentaria en condiciones que simulan las comerciales (refrigeración y atmósfera modificada pasiva MAP).
Además, es importante destacar que la aplicación de la cepa CBS 124167 no afectó al color, ni a la textura, ni a los sólidos solubles, ni a la acidez de las manzanas.
A pesar de que se ha descrito y representado ejemplos concretos de la presente invención, es evidente que el experto en la materia podrá introducir variantes y modificaciones, o substituir los detalles por otros técnicamente equivalentes, sin apartarse del ámbito de protección definido por las reivindicaciones adjuntas.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Cultivo biológico sustancialmente puro de una cepa de la especie Pseudomonas graminis,, depositada con el número CBS 124167 en la institución de depósito "Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.
2. Uso del cultivo CBS 124167 de la reivindicación 1 como antagonista para el control biológico de bacterias patógenas de transmisión alimentaria en fruta para consumo humano.
3. Usos según la reivindicación 2, en la que dicha fruta es fruta cortada a trozos o fruta de cuarta gama.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que dichas bacterias patógenas son microorganismos Salmonella spp.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dichas bacterias patógenas son microorganismos histeria spp.
6 . Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dichas bacterias patógenas son microorganismos Escherichia coli 0157:H7.
7. Uso según la reivindicación 4, en el que la Salmonella spp. es de la especie Salmonella choleraesuis.
8. Uso según la reivindicación 5, en el que la histeria spp. es de cualquiera de las especies histeria monocytogenes o histeria innocua.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dicho control biológico se lleva a cabo manteniendo la fruta a una temperatura superior a
10 °C.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que dicho control biológico se lleva a cabo manteniendo la fruta a una temperatura igual o superior a 20 °C.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dicho control biológico se lleva a cabo manteniendo la fruta en condiciones de refrigeración.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que dicho control biológico se lleva a cabo manteniendo la fruta en una atmósfera modificada.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que dicha fruta es fruta con un pH comprendido entre 3 y 7.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que dicha fruta es manzana.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que dicha fruta es melocotón.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha fruta es melón.
17. Método para tratar fruta que comprende la etapa de aplicar a la fruta una preparación que comprende un cultivo de una cepa de la especie Pseudomonas graminis, depositada con el número CBS 124167 en la institución de depósito
"Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) de Utrech, Holanda.
18. Método según la reivindicación 17, que comprende la etapa de cortar la fruta a trozos antes de aplicar dicha preparación.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, en el que la concentración de la cepa CBS 124167 en dicha preparación es igual o superior a la concentración estimada de patógeno que puede contener la fruta.
20. Método según la reivindicación 19, en el que la concentración de la cepa CBS 124167 en dicha preparación es igual o superior a 105 ufc/ml.
21. Método según la reivindicación 20, en el que la concentración de la cepa CBS 124167 en dicha preparación es igual o superior a 10' ufc/ml.
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, que comprende la etapa de envasar dicha fruta una vez aplicada dicha preparación.
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, que comprende la etapa de proporcionar a dicha fruta una atmósfera modificada.
24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, que comprende la etapa de proporcionar a dicha fruta una temperatura de refrigeración.
25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, que comprende la etapa de aplicar un antioxidante a la fruta, antes de aplicar dicha preparación.
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