CN108795782B - 异常威克汉姆菌对梨果采后病害防治及贮藏保鲜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了异常威克汉姆菌及对梨果采后病害防治及贮藏保鲜的方法，属于水果采后病害生物防治领域。该酵母经鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2018053。该异常威克汉姆酵母可用于常温梨果采后病害防治及其贮藏保鲜。经菌悬液(1×10⁸cells/mL)处理的梨果青霉病发病率和腐烂直径显著降低，使用菌悬液喷洒梨果表面对其贮藏品质没有产生不良影响。因此，异常维克汉姆酵母可以替代传统的化学杀菌剂，对食品安全，人类健康及环境保护等方面都具有重要意义。

Description

异常威克汉姆菌对梨果采后病害防治及贮藏保鲜的方法

技术领域

本发明涉及一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)YD，该菌株可以控制 梨果采后青霉病，属于水果采后病害生物防治领域。

背景技术

梨是蔷薇目蔷薇科植物的一种，果实椭圆形，个大，果皮黄色，果面光洁，质细多汁， 风味酸甜适口并具浓郁香味。梨还有清心润肺、止咳定喘、润燥利便、醒酒解毒之功效，适 宜各类人群食用。中国是梨树栽培面积最大和梨产量最多的国家，分别占世界总面积和总产 量的70.0％和69.0％。梨果实含水量大、表皮脆弱、内含物丰富，所以采后储藏期和货架期 易被病害侵染，果肉易软化腐烂，给果农造成很大的损失。据报道，引起梨果腐烂的主要病 原菌有扩展青霉(Penicillium expansum)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)。病原真菌对采后梨果的 危害不仅在于导致其在数量上的严重损失，而且许多病原真菌能分泌产生的次级代谢产物会 引起严重的食品安全问题，梨果上的扩展青霉(P.expansum)会产生棒曲霉素(patulin)。棒曲霉 素是一种有毒的真菌次级代谢产物，具有致癌、致畸甚至致死等不良影响。

长期以来，控制梨果采后病害的主要方法有物理控制和化学控制。物理控制主要有气调 贮藏，低压贮藏，低温贮藏，热处理，臭氧和辐照处理等。物理控制可以有效的减少果实采 后的腐烂率，而且对环境没有危害。但是其操作工艺复杂，技术要求高，成本高，且物理控 制如热处理还可能破坏水果的营养成分，低温环境只能减缓并不能阻止病原菌的生长繁殖， 过高剂量的辐照处理可能影响果实品质。化学控制主要有二氧化碳和二氧化硫处理，食品添 加剂，天然化合物以及化学杀菌剂。化学杀菌剂以其高效，低价，实用方便的特点在以前广 受大众的青睐。然而使用化学杀菌剂会对环境造成污染，且化学杀菌剂的残留对人体有极大 危害，并且易使病原菌产生抗药性。近些年，人们越来越注意环境以及食品安全问题，因此 亟需选用一种高效，安全的方法来处理采后的梨果。

生物防治法利用对人体无害的拮抗微生物控制水果采后病原菌，既安全高效，又能保护 环境，被认为是最有可能取代化学杀菌剂的方法之一。用于生物防治的微生物主要有细菌、 霉菌和酵母菌。酵母菌即使在干燥条件下，也能在表面长期定殖，同时，能产生胞外多糖， 这些多糖能增加酵母菌的耐受性并抑制病原物的生长；此外，快速利用营养并且迅速增殖， 而且受杀菌剂的影响不大，因此，酵母菌已成为生物防治的研究热点。

近年来国内外已经筛选出了多株可以有效控制梨果采后病害的拮抗酵母菌。2013年，Lutz 等发现接种浅白隐球酵母(Cryptoccocus albidus)后，梨上青霉病和灰霉病的发病率分别降低 了50％和90％。2015年，Zhu等发现在梨上接种红冬孢(Rhodosporidiumpaludigenum)后，当 对照组腐烂率为100％时，处理组发病率为8.3％。张晓云等发现在梨果接种季也蒙毕赤酵母 后，当对照组腐烂率为100％时，处理组的发病率为37.96％(专利申请号为CN107460134A)。 郑晓冬等发现西藏胶红酵母(专利申请号为CN105112312A)处理梨果，由青霉病引起的腐 烂率降低为40.4％，对照组为100％。针对梨果青霉病害防治的酵母菌较少，还没有异常威克 汉姆酵母(W.anomalus)在梨果应用上的报道。

本发明中的异常威克汉姆酵母被认为是最安全的酵母之一，研究证明，该酵母能显著降 低梨果采后病害的发生，降低水果的腐烂率，且不影响水果的品质，从而达到水果贮藏保鲜 的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一株分离自果园土壤的能够高效控制梨果采后青霉病的异常威克汉 姆酵母(W.anomalus)YD，可以有效控制梨果采后青霉病的发生，减少采后病害造成的损失， 具有潜在的应用价值。

本发明采用的技术方案

本发明所提供的防治梨果采后青霉病的酵母菌株是从江苏省镇江市江心洲有机果园中的 土壤分离得到，在NYDA固体培养基平板上28℃培养，进行形态学观察；对该菌株的5.8S rDNA-ITS区序列分析，进行分子生物学鉴定。

该异常威克汉姆酵母YD的保藏信息具体如下：保藏号为CCTCC NO:M 2018053；保藏 单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国武汉，武汉大学；保藏日期：2018 年1月24日；建议的分类名为：异常威克汉姆酵母YD(Wickerhamomyces anomalusYD)。

利用异常威克汉姆酵母YD对梨果采后病害防治及贮藏保鲜的方法，按照下述步骤进行： 将异常威克汉姆酵母YD在NYDA培养基、28℃培养48h进行活化，然后在NYDB培养基，28℃培养13h到达酵母菌的对数中期，再取对数中期的酵母菌1mL转接新的NYDB培养基 中培养20h，到达稳定期；离心洗涤得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1.0×10⁸cells/mL的菌悬液；将梨果用打孔器(5mm×3mm)打洞后加入上述菌悬液，2h后接种扩展青霉孢子悬浮液，或用上述菌悬液喷洒梨果表面，待梨果自然风干后放入保鲜袋中；梨果置于塑料筐中， 用保鲜膜密封后，于室温下存放，即可达到对梨果采后病害防治及贮藏保鲜的效果。

其中NYDA培养基的组成如下：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g， 121℃湿热灭菌20min。

其中NYDB培养基的组成如下：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，121℃湿热 灭菌20min。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的异常威克汉姆酵母(W.anomalus)YD为本实验室筛选，其拮抗效力强, 且经急性经口毒性试验验证对人体无害。

(2)本发明所使用的异常威克汉姆酵母(W.anomalus)YD可以显著抑制梨果采后青霉病的发 生，降低梨果采后青霉病的发病率，具有一定的商业价值。

(3)本发明所使用的异常威克汉姆酵母(W.anomalus)YD目前尚未有在梨果上应用的报道， 具有一定的创新性且比之前公开的相关专利中描述的拮抗菌生防效果好。

(4)本发明使用异常威克汉姆酵母(W.anomalus)YD，可以代替化学杀菌剂防治水果采后病 害，避免使用化学杀菌剂对人带来的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并 不受这些实施实例的限制。

附图说明

图1为筛选的不同拮抗酵母对梨果采后青霉病的控制

图2为异常威克汉姆酵母YD的5.8S rDNA-ITS区序列构建的进化树。

图3为异常威克汉姆酵母YD对梨果青霉病腐烂率的影响。注：CK：无菌蒸馏水处理组， 即对照组；Y1：用无菌蒸馏水配制的1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母YD菌悬液处理组。 不同字母代表差异显著(P<0.05)。

图4为异常威克汉姆酵母YD对梨果青霉病引起的腐烂直径的影响。注：CK：无菌蒸馏 水处理组，即对照组；Y1：用无菌蒸馏水配制的1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母YD菌 悬液处理组。不同字母代表差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

实施例1：本发明的异常威克汉姆酵母(W.anomalus)YD的获取方法步骤如下：

1.从环境中分离酵母单菌落

从江苏省镇江市江心洲有机果园采取土壤样品，称取1g土样加入到100mL无菌水中溶 解，并分别进行两次十倍稀释，分别得到10^-2,10^-3,10^-4土壤溶液。分别从稀释溶液中吸取100 μL涂布于NYDA培养基上，28℃培养24h。挑取优势酵母单菌落，在NYDA培养基上纯化 培养。将分离并纯化后的菌株接种到NYDA斜面上，28℃培养48h，置于4℃冰箱短期保藏备用。

2.拮抗扩展青霉酵母菌的筛选

(1)酵母菌悬液的制备

把斜面保存的酵母菌接种到装有已灭菌的含50mL NYDB培养基的250mL三角瓶中，28℃下180rpm培养13h后，再取1mL发酵液于一个新的已灭菌的含50mL NYDB培养基 的250mL三角瓶中，将发酵液于7500rpm下离心10min后收集菌体，并用无菌水冲洗菌体 两次。用血球计数板计数并将酵母悬浮液浓度调整至10⁸cells/mL，待用。

(2)扩展青霉孢子悬浮液的制备

从在28℃下，经PDA培养基培养7天的扩展青霉上刮取孢子并溶于无菌水中，利用血 球计数板计数并调整浓度至1×10⁵spores/mL，待用。

(3)拮抗扩展青霉酵母菌株的筛选

挑选大小均匀、无损伤的成熟梨果实浸入含有0.3％次氯酸钠溶液的自来水中消毒约1 min，冲洗后晾干。将梨果用打孔器(5mm×3mm)打洞后晾干汁液，加入30μL酵母菌悬液， 2h后，再加入30μL的扩展青霉孢子悬浮液。梨果置于塑料筐中，用保鲜膜密封后，于室温 下存放，4d后观察酵母菌对梨果的防腐保鲜效果。

(4)拮抗扩展青霉酵母菌株的筛选结果

如图1所示，室温存放4d，无菌水对照组的腐烂率为100％，说明扩展青霉侵染梨果能 力很强。本发明筛选的拮抗酵母YD拮抗能力最强，可以显著抑制梨果腐烂。

实施例2：异常威克汉姆酵母(W.anomalus)YD的微生物学特性

1.形态学特征

(1)NYDA培养基(牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，121℃湿热灭菌20min)上28℃培养48h，菌落呈圆形、边缘光滑、较湿润、易挑起。细胞形态呈椭圆形， 单个分散。

(2)在NYDB液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈 椭圆形，芽殖。

2.分子生物学鉴定

对分离筛选出的酵母菌株YD的5.8S rDNA-ITS区序列进行分析，在GenBank检索，确 定为异常威克汉姆酵母(W.anomalus)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1 程序，构建生物进化关系树如图2。

本发明所提供的防治梨果采后病害的酵母菌株YD，现保存位于中国武汉市武汉大学的 中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018053，保藏日期为2018 年1月24日，建议的分类命名为异常威克汉姆酵母YD(W.anomalus)YD。

实施例3：异常威克汉姆酵母YD安全性研究

1.试验方案

供试动物为ICR小鼠，由江苏大学实验动物中心提供，清洁级。小鼠体重18-22g，将小 白鼠分为0，5000，10000和15000mg/kg四个剂量组进行实验，每个剂量组10只小白鼠，雌雄各半。采用经口灌胃方式，按0.2mL/l0g体重进行实验。观察14d，整个实验过程中，观 察小白鼠的日常状况是否有中毒或死亡现象。若出现死亡现象，必要时可延长到28d。记录 死亡数，查表求出LD50，并记录死亡时间和中毒现象等，确定急性毒性的级别。

2.实验结果

按照上述试验步骤，统计异常威克汉姆酵母YD安全性实验结果如下：

灌入异常威克汉姆酵母YD的小白鼠14d未出现死亡。并且由表1可以看出，实验过程中小 白鼠未出现死亡现象，且LD 50值大于100g/kg体重，根据急性毒性分级标准可知，异常威 克汉姆酵母YD属于安全无毒类酵母。

表1异常威克汉姆酵母YD的急性经口毒性实验结果

实施例4：异常威克汉姆酵母YD对梨果青霉病的控制效果

1.试验方案

异常威克汉姆酵母YD接种到装有已灭菌的50mL NYDB培养基的250mL三角瓶中，恒温28℃下180rpm培养13h后，再取1mL发酵液于一个新的已灭菌的50mL NYDB培养 基的250mL三角瓶中，将发酵液于7500rpm下离心10min后收集菌体，并用无菌水冲洗菌 体两次。用血球计数板计数并将酵母悬浮液浓度调整至10⁸cells/mL,待用。从已在28℃下， 经PDA培养基培养7d的扩展青霉上刮取孢子并溶于无菌水中，利用血球计数板计数并调整 浓度至1×10⁵spores/mL，待用；

挑选大小均匀、无损伤的成熟梨果实浸入含有0.3％次氯酸钠溶液的自来水中消毒约1 min，冲洗后晾干。将梨果用打孔器(5mm×3mm)打洞后晾干汁液，加入30μL酵母菌悬液，2 h后，再加入30μL的扩展青霉孢子悬浮液。梨果置于塑料筐中，用保鲜膜密封后，于室温下 存放，3d后观察异常威克汉姆酵母YD对梨果的防腐保鲜效果。

发病率的计算公式如下：

发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％

2.试验结果

按照上述试验步骤，统计水果的腐烂率结果如下：

如图3所示，在第3天对照组果实的发病率为100％，经异常威克汉姆酵母YD处理的梨 果发病率仅为5.56％。处理组显著低于对照组(<0.05)。与控制效果好的季也蒙毕赤酵母(专 利申请号为CN107460134A)相比，在使用相同浓度的酵母菌液和相同的扩展青霉孢子悬浮 液时，异常威克汉姆酵母YD比季也蒙毕赤酵母的控制效果更好；与西藏胶红酵母(R. mucilaginosa)处理的梨果效力(专利申请号为CN105112312A)相比，在降低酵母使用的浓 度，而提高扩展青霉的浓度情况下，梨果发病率却略低。且经异常威克汉姆酵母YD处理的 梨果的腐烂直径也显著低于无菌水对照组，因此异常威克汉姆酵母在室温下能够有效控制由 扩展青霉造成的梨果采后青霉病病害。

实施例5：异常威克汉姆酵母YD对梨果采后贮藏品质的影响

1.试验方案

将以下处理液均匀喷洒于水果表面，自然晾干：(1)1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵 母YD菌悬液；(2)无菌水作为对照组。待梨果自然风干后放入保鲜袋中，后置于塑料筐中， 用保鲜膜密封，置于恒温恒湿培养箱(20℃，95％RH)中贮藏35d。35d后，测定果实自 然贮藏品质相关指标。每个处理三次平行，整个实验重复2次。异常威克汉姆酵母YD对水 果贮藏品质的测定方法如下：

(1)失重率：处理前后梨果重量的变化。

失重率＝(处理前(g)-贮藏后(g))/处理前(g)×100％

(2)可溶性固形物含量：用手持式糖量计测定，采用手持糖量计进行测定，测定结果表示 为g/100g样品。

(3)褐变度：随机挑选6个梨果，称取20g果实样品，加入40mL蒸馏水匀浆，1000rpm，4℃条件下离心10min，取10mL上清液加入15mL95％乙醇，4℃条件下离心10min，上清 液420nm处测定吸光度值，以此数值表示褐变程度。此处理重复3次。

(4)可滴定酸度：采用滴定法，随机挑选6个梨果，称取20g果实样品，加入40mL蒸馏水迅速匀浆，再加入适量的蒸馏水清洗至刻度为100mL烧杯中，置于80℃的恒温水浴锅中浸提30min，期间搅拌若干次，再用蒸馏水定容至100mL。过滤后取20mL滤液于100mL 小烧杯中，加入2-5滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH溶液进行滴定，当溶液逐渐变成微红 色且30s内不褪色即为滴定终点，记录所使用的NaOH体积，结果以苹果酸的百分数表示。 此处理重复3次。

(5)硬度：采用TA-XT2Plus质构分析仪测试，探头直径为5mm，探头测试前、测试中、测试后的运行速度分别为4.0mm s^-1、1.0mm s^-1、5.0mm s^-1，测试深度为10mm，探头插入 水果时所受的最大阻力(单位为N)就被定义为水果的硬度。每个水果绕赤道处每120°测定3次。

(6)维生素C(Vc)含量：紫外快速滴定法。随机挑选6个果实，称取20g果实样品，加入20mL 1％盐酸匀浆，装入50mL容量瓶定容至刻度。10000rpm，4℃条件下离心10min， 上清用于测定。取0.4mL上清液，加入有0.8mL 10％HCl的10mL刻度试管中，加水稀释至 刻度后摇匀。空白校正后，在243nm处测定上述溶液吸光值。另取0.4mL上清液，分别加入4 mL蒸馏水和1.6mL 1mol/L NaOH至10mL刻度试管，摇匀，静置15min后。加入入1.6mL 10％HCl，混匀，加蒸馏水定容至刻度。空白校正用蒸馏水，在243nm处测定吸光度。制作 Vc标准曲线，计算两次测得A₂₄₃值，求其差值，计算样品中Vc的含量。每处理3次重复。

2.试验结果

表2异常威克汉姆酵母YD对梨果贮藏品质的影响

注：CK：无菌水处理组，即对照组；YD：1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母YD菌悬液处理组。不同 字母代表差异显著(P<0.05)。

从表2可以看出，在20℃贮藏35d之后，经异常威克汉姆酵母YD处理的梨果的失重率、 硬度、可溶性固形物、可滴定酸、Vc含量与对照相比均无显著差异，而褐变度有所降低。表 明异常威克汉姆酵母YD对梨果采后自然贮藏品质没有显著不良影响。

实施例6：异常威克汉姆酵母YD的保存

首选培养基为NYDA培养基，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，琼脂15-20g， 蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min，26-28℃培养48h。

Claims (2)

1.利用异常威克汉姆酵母YD对梨果采后青霉病及贮藏保鲜方法，所述异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)YD，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2018053；按照下述步骤进行：将异常威克汉姆酵母YD在NYDA培养基、28℃培养48h进行活化，然后在NYDB培养基、28℃培养13h后得到种子液，再将种子液1mL重新接到含50mL NYDB培养基中培养20h，离心得到菌泥，用无菌水稀释并用血球计数板制备成1×10⁸cells/mL的菌悬液；用上述菌悬液喷洒梨果表面，待梨果自然风干后放入保鲜袋中，再置于塑料筐中，用保鲜膜密封后，置于室温条件下存放；其中所述的水果为梨果。

2.根据权利要求1所述的异常威克汉姆酵母YD对梨果采后病害的防治方法，其特征在于其中所述的NYDB培养基为：酵母浸膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

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