CN101899400B - 卡利比克毕赤酵母、在水果贮藏保鲜中的应用及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对水果采后病害具有防治效力的卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)，及在水果贮藏保鲜中的用途和使用方法。该卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)为CGMCC No.3616。将卡利比克毕赤酵母活化、发酵培养，离心得到菌体，菌体用无菌水稀释制备成1.0×107个/ml-1.0×109个/ml的菌悬液。将水果放入菌悬液中，浸泡30秒-2分钟左右的时间后，马上取出，再风干，放在塑料筐中，用保鲜膜密封后即可。本发明使用拮抗酵母防治水果采后病害，使用简单，操作方便，效果好，成本低，可以避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种对水果采后病害具有防治效力的的卡利比克毕赤酵母(Pichiacaribbica)、该菌株在水果贮藏保鲜中的应用以及其使用方法。
背景技术
水果在采摘、运销、储藏过程中因腐烂造成的损失是巨大的，也是全球关注的问题。据报道，在发达国家有10％-30％的新鲜产品由于采后病害导致腐烂，而在缺乏贮运冷藏设备的发展中国家，果实采后腐烂率则高达40％-50％。国外水果贮藏保鲜量占水果总产量60％以上，目前我国果品贮藏量800多万吨，不到总量的15％，其中冷藏库和气调库的贮藏量为70万吨，仅占总产量的7％。我国水果采后腐烂率一般在20％-30％，高者甚至达到50％。水果腐烂的主要原因归因于病原微生物的致病作用，这些病原微生物主要有灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、葡枝根霉(Rhizopus stoloniger)、青霉属(Penicillium spp.)、毛霉属(Mucorspp.)、链格孢(Alternaria spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)和软腐细菌(Erwinia sp.)等。
目前最常用的控制水果采后腐烂的方法还是低温和化学杀菌剂处理。近年来虽然冷藏技术在我国得到了广泛的发展的应用，但是在低温条件下仍有相当数量的致病菌可以生长从而引起腐烂。例如，能引起多种水果灰霉病的灰葡萄孢(Botryris cinerea)，也称灰霉菌，在-0.5℃时也能生长繁殖，引起许多水果腐烂变质，造成严重经济损失。而那些对低温敏感的水果，因只能在不低于使产品受冷害的温度下贮藏，病原物的生长、繁殖更不能得到有效地抑制，腐烂相当严重。化学杀菌剂的使用，虽然防治病害可以起到立竿见影的效果，但是在杀死病原菌的同时也杀死了有益微生物，且水果上的化学杀菌剂残留对人体健康的影响及环境的污染，一直是人们担心的问题。美国科学院(National Academy of Scinces)的一份报告显示，在用于处理食品的杀菌剂中，60％有致癌的危险性。目前多种杀菌剂(如Captan、Benomyl等)已被美国环保局明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用。为了保证农产品的卫生和安全，各国科学家都在积极的探索能代替化学杀菌剂的水果采后病害防治新技术。近年来，美国、意大利等发达国家对水果采后病害生物防治的研究已经取得了阶段性的成果，生物防治的应用潜力巨大，使得它成为一种取代化学杀菌剂的有效方法。
我国水果采后病害生物防治研究起步较晚，范青(2001)等对果实病害生物防治拮抗菌进行了筛选和分离，结果表明：季也蒙假丝酵母(Candida guiliermondii)、柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)对甜樱桃褐腐病都表现出显著的抑制效果，季也蒙假丝酵母和柠檬形克勒克酵母能有效地防治核果类果实软腐病；Tian(2004)等研究，在甜樱桃采前喷洒1×108CFU/mL的丝孢酵母(Trichosporon pullulans)，罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)和红酵母(Rhodotorula glutinis)，分别在25℃，0℃以及气调贮藏下，丝孢酵母在果实上繁殖数量最高，抑菌效果最好；张红印等(2005)研究了不同温度下，罗伦隐球酵母对灰霉病的防治效果，结果表明，25℃下，梨灰霉病的发病率为16.7％，结合CaCl2使用效果更显著。
从国内外文献中可知当前以有效微生物取代化学杀菌剂用于采后水果病害的防治已显示出巨大的应用前景，采后水果的生物防治成为一个新的研究热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，目前已报道的拮抗微生物的防治效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。为了尽快地将拮抗微生物应用于水果贮藏保鲜实际生产上，还需进一步筛选拮抗效果好、抗病谱广的微生物，同时需要深入探讨拮抗微生物防治水果采后病害的机理，在此基础上进一步提高拮抗微生物的抑菌能力，开展拮抗微生物扩大培养、保存和商品化应用技术的研究。
我们从镇江市江心洲农业生态果园筛选分离到一株对水果采后病害具有显著防治作用的拮抗菌，经系统分类鉴定，鉴定为卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术中的不足，发明人已经做过广泛的研究，以提供具有较强生物防治效力生物防治拮抗菌株。提供了一种具有较强生物防治效力的卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)菌株。
本菌株系从镇江市江心洲农业生态果园筛选分离到一株对水果采后病害具有显著防治作用的拮抗酵母G 4菌株。经系统分类鉴定为卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)。
本发明的卡利比克毕赤酵母G 4菌株已经于2010年1月29日保藏在保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏菌株编号为CGMCC No.3616。
本发明还提供该卡利比克毕赤酵母菌株的用途，可以用其对水果的进行采后病害防治及贮藏保鲜；尤其适合于梨果、桃果、草莓、苹果等水果中的采后病害防治及贮藏保鲜。
本发明同时提供了一种利用卡利比克毕赤酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法。步骤如下：将卡利比克毕赤酵母G 4活化、发酵培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1.0×107个/ml-1.0×109个/ml的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒-2分钟左右的时间后马上取出，再风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。
本发明的卡利比克毕赤酵母G 4，采用常规的菌种斜面保藏方法，采用培养基首选为NYDA培养基(牛肉膏0.8％，酵母浸出物0.5％，葡萄糖1％，琼脂2％)，也可以使用马铃薯琼脂培养基；在pH7.0～9.0，26℃～28℃，培养36h。在发酵培养时，可将斜面菌种直接接种至发酵培养基NYDB(牛肉膏0.8％，酵母浸出物0.5％，葡萄糖1％)或者麦芽汁培养基( )中，pH7.0～9.0，温度26℃～28℃，摇床转速180r/min的培养条件下，培养40～48h。一般在40h左右可以达到最大生物量。
本发明的卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)G 4，可以明显的抑制水果产生腐烂腐败的病原菌，防止采后水果发生腐烂，并且不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点，可以广泛的用于水果采后的病害的生物防治过程中，减少采后病害造成的损失。
通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
附图说明 其中图1为卡利比克毕赤酵母G 4菌株的5.8S rDNA-ITS区序列进化关系图。
具体实施方式
本菌株系通过以下方法得到，多次从镇江市江心洲农业生态园橘园和桃园取样包括：橘子叶片、花朵、橘子果实和橘园土壤；桃子叶片、花朵、桃果和桃园土壤。通过分离、筛选、培养、离体试验和活体试验得到具较强有生防效力的微生物菌株G 4。经过形态学培养、生理生化特征试验和小亚基5.8S rDNA和内转录间隔区ITS1和ITS2区碱基序列分析，该微生物菌株G 4鉴定为卡利比克毕赤酵母。
本发明的菌株卡利比克毕赤酵母G 4菌株(菌株编号：CGMCC No.3616)具有以下微生物学特性：
1.形态学特征
(1)在YEPD固体培养基(酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH6.0，115℃湿热灭菌20min)平板上28℃培养72h，菌落呈圆形、边缘整齐、乳白色、表面光滑、质地均匀、易挑起。
(2)镜检酵母细胞呈椭圆形或瓜子形，细胞大小(1.5-2.0)×(1.5-5.5)μm，无性繁殖为芽殖，有性繁殖产生子囊孢子，每个子囊孢含1-4枚圆形孢子。
2.生理特性
本发明菌株碳源能够同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，不能发酵乳糖，难以还原硝酸盐。
3.分子遗传学鉴定
对筛选菌株G 4小亚基5.8S rDNA-ITS区序列分析，在GenBank上检索，确定G 4菌株为卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)。根据检索到的同源菌株，根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege4程序，构建生物进化关系树如说明书附图图1所示。
实施例1：利用卡利比克毕赤酵母进行水果(梨果)采后病害防治及贮藏保鲜方法
将活化后酵母接种在装有50ml NYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH7.0-9.0)的三角瓶中，28℃、180r/min摇床培养48h。取菌液4000r/min离心10min，弃上清，无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成浓度为1×108个/ml的菌悬液。在果实腰部用打孔器打3个直径为3m(宽)×3mm(深)的孔，每孔注30μl的拮抗菌浓度为1×108个/ml细胞悬液，对照水果注入30μl无菌水。2h后分别接种病原菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和扩展青霉(Penicillium expansum)孢子悬液30μl，晾干后将果实装入塑料筐内，保鲜膜封口保持95％的湿度，在室温下贮藏，7d后统计果实的发病腐烂率。每个处理8个果实，试验重复3次。
按照上述步骤试验，7d后统计水果的腐烂率结果见下表1。
表1卡利比克毕赤酵母G 4对梨果灰霉病菌和青霉病菌的抑制效果
评价拮抗菌对梨果实两种病原菌的抑制效果，结果见表2。从表中可以看出，对照组已经全部发病，可以看出G 4对梨的采后腐烂病害具有明显的抑制作用。
实施例2：利用卡利比克毕赤酵母进行水果(草莓)的采后病害防治及贮藏保鲜方法
将活化后酵母接种在装有50ml NYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH7.0-9.0)的三角瓶中，28℃、180r/min摇床培养48h。取菌液4000r/min离心10min，弃上清，无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成浓度为1×107个/ml，1×108个/ml，1×109个/ml的菌悬液，对照组为无菌水。在果实腰部用打孔器打2个直径为3m(宽)×3mm(深)的孔，然后在每孔分别注30μl的以上浓度的拮抗菌悬液，对照水果注入30μl无菌水。2h后接种病原菌葡枝根霉(Rhizopus stoloniger)孢子悬液30μl。晾干后将果实装入塑料筐内，保鲜膜封口保持95％的湿度，在室温下贮藏，2d后统计果实的发病腐烂率。每个处理20个果实，试验重复3次。
按照上述步骤试验，2d后统计水果的腐烂率结果见下表2。
表2卡利比克毕赤酵母G 4对草莓葡枝根霉的抑制效果
评价拮抗菌对草莓葡枝根霉的抑制效果，结果见表2。从表中可以看出，对照组已经全部发病，而G 4对草莓的采后葡枝根霉引起的病害具有明显的抑制作用。当卡利比克毕赤酵母的浓度为1×109个/ml时，草莓的发病率为0，说明卡利比克毕赤酵母完全抑制草莓葡枝根霉的生长。
实施例3：利用卡利比克毕赤酵母进行水果(草莓)的采后病害防治及贮藏保鲜方法
一、试验方案
将活化后酵母接种在装有50mlNYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH7.0-9.0)的三角瓶中，28℃、180r/min摇床培养48h。取菌液4000r/min离心10min，弃上清，无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成浓度为1×107个/ml的菌悬液。将草莓浸泡至1×107个/ml的菌悬液，对照草莓浸泡至无菌水中，时间为30秒-2分钟。晾干后将果实装入塑料筐内，保鲜膜封口保持95％的湿度，在室温下贮藏。5d后统计果实的发病腐烂率和测定水果的品质。每个处理15个果实，试验重复3次。按照上述步骤试验，5d后统计草莓的自然腐烂率。
在草莓贮藏结束后，每组分别取出一些草莓，进行感官品质测定。感官测定在室温下进行(20℃)，每组处理在测定每一项指标时取5个水果，试验重复三次。
品质测定方法如下：
(1)失重率：采用称重法。
(2)硬度：用TA-XT2i质地分析仪进行测定，用直径为5mm的探头，探头向水果的运动速度为5.0毫米/秒，探头刺破水果所遇到的最大的反弹力(N)被定义为水果的硬度。
(3)总可溶性固形物含量：用手持式糖量计测定，采用手持糖量计进行测定，测定结果表示为g/100g样品。
(4)可滴定酸度：采用滴定法，从6个水果取样，称取10g样品，加蒸馏水迅速研磨，定容至100ml，过滤，取10ml滤液，用0.1mol/l NaOH进行滴定至pH8.1，滴定后进行计算，结果以含柠檬酸的百分数表示。
(5)Vc含量
Vc含量：2，6-二氯酚靛酚法。从6个水果上取5g样品加5ml 2％草酸研磨匀浆，倒入100ml容量瓶，用1％草酸洗涤残渣，加lml 30％硫酸锌，摇匀。再加1ml15％亚铁氰化钾(除色素)，用1％草酸定容，摇匀过滤。取过滤液4ml，然后向各管加入2，6-二氯酚靛酚染料溶液，随即加入二甲苯5ml，迅速摇动约0.5min，静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液在500nm波长下测定吸光度。根据测定液的光密度值查标准曲线，求出相应的维生素C(Vc)的含量，结果用毫克Vc/100g水果表示。
二、试验结果
表3卡利比克毕赤酵母对梨果自然腐烂抑制效果及其贮藏品质的影响
备注：上述表中的发病率和品质测定时在室温(20℃)下放置5d后测定的结果。不同字母代表差异显著性。
从表3中可以看出，经过卡利比克毕赤酵母理过的草莓，在常温下(20℃)放置5d后，草莓的发病率显著低于对照组(p＜0.05)。对于可溶性固形物含量、Vc含量、可滴定酸含量、没有产生不利的影响。卡利比克毕赤酵母处理过的草莓失重率、硬度都明显优于对照组(p＜0.05)，其他的指标则均没有产生不利影响。
以上试验结果表明经过卡利比克毕赤酵母理过的草莓可以明显的降低草莓的自然腐烂发病率，而对贮藏品质没有产生不良的影响。
实施例4：利用卡利比克毕赤酵母进行水果(草莓)的采后病害防治及贮藏保鲜方法处理参照例3，与例3所不同的是配成浓度为1×108个/ml的菌悬液。
按照上述步骤试验，5d后统计草莓的自然腐烂率及贮藏品质的影响结果见下表4。
表4卡利比克毕赤酵母对梨果自然腐烂抑制效果及其贮藏品质的影响
备注：上述表中的发病率和品质测定时在室温(20℃)下放置5d后测定的结果。不同字母代表差异显著性。
从表4中可以看出，经过卡利比克毕赤酵母理过的草莓，在常温下(20℃)放置5d后，草莓的发病率显著低于对照组(p＜0.05)。对于可溶性固形物含量、Vc含量、可滴定酸含量、没有产生不利的影响。卡利比克毕赤酵母处理过的草莓失重率、硬度都明显优于对照组(p＜0.05)，其他的指标则均没有产生不利影响。
以上试验结果表明经过卡利比克毕赤酵母理过的草莓可以明显的降低草莓的自然腐烂发病率，而对贮藏品质没有产生不良的影响。
实施例5：利用卡利比克毕赤酵母进行水果(草莓)的采后病害防治及贮藏保鲜方法处理参照例3，与例3所不同的是配成浓度为5×108个/ml的菌悬液。
按照上述步骤试验，5d后统计草莓的自然腐烂率及贮藏品质的影响结果见下表5。
表5卡利比克毕赤酵母对梨果自然腐烂抑制效果及其贮藏品质的影响
备注：上述表中的发病率和品质测定时在室温(20℃)下放置5d后测定的结果。不同字母代表差异显著性。
从表5中可以看出，经过卡利比克毕赤酵母理过的草莓，在常温下(20℃)放置5d后，草莓的发病率显著低于对照组(p＜0.05)。对于可溶性固形物含量、Vc含量、可滴定酸含量、没有产生不利的影响。卡利比克毕赤酵母处理过的草莓失重率、硬度都明显优于对照组(p＜0.05)，其他的指标则均没有产生不利影响。
以上试验结果表明经过卡利比克毕赤酵母理过的草莓可以明显的降低草莓的自然腐烂发病率，而对贮藏品质没有产生不良的影响。
Claims (3)
1.卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)CGMCC No.3616。
2.权利要求1所述的卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)菌株的用途，用其对水果的采后病害进行防治及贮藏保鲜，适合于梨果或草莓的采后病害防治及贮藏保鲜。
3.权利要求1所述的卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)菌株进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法，其特征在于使用方法如下：将卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)活化、发酵培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1.0×107个/ml-1.0×109个/ml的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒-2分钟后马上取出，再风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放，其中所述的水果为梨果或草莓。
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