CN109169881A - 抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法 - Google Patents

抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于水果采后病害生物防治领域，具体涉及抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法；具体步骤为将抗坏血酸加入NYDB培养基中，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液；将菌悬液均匀喷洒于水果表面，自然风干后用保鲜膜密封，置于室温存放，实现水果采后病害的控制；本发明利用抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母处理水果，可以显著提高该酵母对水果采后病害的生防效力，避免使用化学杀菌剂，不会对人体和环境产生危害，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法
技术领域
本发明属于水果采后病害生物防治领域，具体涉及一种抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)防治水果采后病害的方法。
背景技术
苹果含有丰富的碳水化合物、维生素和微量元素，是人们经常食用的水果之一。中国是世界上最大的苹果生产国和消费国，苹果种植面积和产量均占世界总量的40％以上，在世界苹果产业中占有重要地位。苹果在采后贮运期间，易遭受多种病原菌的侵染产生采后病害，导致果实腐烂变质，经济损失严重。苹果每年因腐烂造成的损失可达30-40％，严重时可高达50％以上。目前已知能引起苹果采后腐烂的致病菌有20多种，其中由扩展青霉(Penicillium expansum)青霉病和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病为苹果两大主要病害，而以扩展青霉引起的腐烂尤为严重，此类病原菌分布广泛，以腐生在有机物上的方式，将所产生的大量分生孢子扩散在空气之中，从而扩散到果实上，引起果实腐烂，损失极大。
在苹果采后病害的防治中，传统的方法主要有物理防治方法和化学防治方法。其中物理方法对苹果采后病害的防治局限性较大，成本较高。而化学防治法主要依靠化学药剂,如邻苯酚钠、仲丁胺以及苯并咪唑类杀菌剂等控制苹果的采后病害。化学防治法效果较好，但杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有损于人类健康。过去十多年，公众和科学界对于水果中杀菌剂残留问题的关注日益增加。此外，长期使用化学杀菌剂会使病原菌产生抗药性从而降低防治效果,化学杀菌剂的连续使用,已经造成抗病霉菌的出现。因此，在很多发达国家和地区,一些化学杀菌剂已经开始被限制使用，如，克菌丹(Captan)和苯菌灵(benomyl)等几种杀菌剂已经被美国环保机构所禁用。
随着经济的发展和人们生活水平的不断提高，研究并开发替代化学杀菌剂的安全、无毒、高效的新型水果采后病害防治方法，具有重大的社会意义和广阔的应用前景。当前国际上越来越重视利用微生物拮抗菌控制水果采后病害的研究，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方向之一。在所有拮抗菌中，拮抗酵母具有效果好、不产毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点而成为研究的热点。目前，已经有不少科学家分离到诸多拮抗酵母，并且研究其对于苹果采后病害的防治效果，如Debaryomyces hansenii、Pantoeaagglomerans、Candida famata、Cryptococcus albidus等。
然而到目前为止，果蔬采后生物防治的研究虽然已有半个世纪的历史，但实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Yield Plus，Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于商业生产，主要是在实际应用过程中，由于环境条件的不确定性，微生物防治的效果往往不如化学杀菌剂。例如，当果蔬受到病原菌侵染等逆境胁迫时，会产生大量的活性氧(ROS)，而对拮抗酵母产生氧化胁迫，降低其生防效力。因此，寻找提高拮抗酵母控制果蔬采后病害效力的方法，是将其应用于实际生产的关键。
抗坏血酸是一种天然存在的具有抗氧化性质的有机化合物，易溶于水，形成轻度酸性的溶液，是常用的食品添加剂之一。同时，抗坏血酸是一种很好的还原剂，在植物细胞中可直接与ROS反应，从而去除游离氧基；抗坏血酸还可以作为抗氧化酶的底物，是赖氨酰基和辅氨酰基羟化酶的辅因子。抗氧化剂和拮抗酵母结合使用，可以提高拮抗酵母对氧化胁迫的耐受性，从而提高其对水果采后病害的生物防治效力；但是，这种目前的生物防治效力较低，所以亟需研究和开发一种新型高效、无毒、安全的苹果防腐保鲜剂。
发明内容
针对目前存在的不足，本发明旨在解决上述问题之一；本发明选用本实验室自主分离的卡利比克毕赤酵母，以抗坏血酸诱导提高该拮抗酵母对苹果采后青霉病的生物防治效果，从而达到研究和开发新型高效、无毒、安全的苹果防腐保鲜剂的目的。
本发明提供一种抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治苹果采后青霉病的方法，按照下述步骤进行：将抗坏血酸加入NYDB培养基中，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，将菌悬液均匀喷洒于水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放，实现对水果采后病害的控制。
优选的，所述的NYDB培养基为(以1000mL计)：酵母膏，牛肉浸膏和葡萄糖的质量比为5：8：10，余量为蒸馏水，pH自然。
优选的，所述NYDB培养基中抗坏血酸的浓度为150～350μg/mL。
优选的，所述NYDB培养基中抗坏血酸的浓度为250μg/mL。
优选的，所述培养的条件为：转速180rpm/min，温度28℃，时间20h。
优选的，所述菌悬液的浓度为1×108cells/mL。
优选的，所述的水果为苹果；所述的病害为青霉病。
本发明的有益效果：
(1)本发明所使用的卡利比克毕赤酵母为本实验室筛选，其拮抗效力强，对人体安全无害，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治，减少水果采后病害造成的损失。
(2)本发明所使用的抗坏血酸来源广泛，价格低廉，无毒无害。
(3)本发明以抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母处理苹果，与未经诱导的卡利比克毕赤酵母相比，抗坏血酸诱导可以显著提高卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的生防效力，从而降低苹果的腐烂情况，进而达到水果贮藏保鲜的目的。
(4)本发明使用抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母，可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为不同浓度抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病发病率的影响。
图2为不同浓度抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母处理对苹果青霉病腐烂直径的影响。
图3为抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对苹果自然腐烂率的影响。
注：图中CK：无菌蒸馏水，即对照组；Y：未经抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母(1×108cells/mL)；Y+VC/150、Y+VC/200、Y+VC/250、Y+VC/300、Y+VC/350分别为用150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母菌悬液(1×108cells/mL)。不同字母代表差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。卡利比克毕赤酵母(P.carribbica)系本实验室筛选得到，已经获批中国发明专利(专利号：ZL201010198119.6：专利名称为：卡利比克毕赤酵母、在水果贮藏保鲜中的应用及使用方法)。
本发明所使用的NYDB培养基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容为l000mL，自然pH；NYDA培养基是在NYDB培养基的基础上添加2％的琼脂(质量计)。
培养程序为(1)固体活化：将卡利比克毕赤酵母接种于NYDA培养基中，在28℃培养48h；(2)液体培养：在装有50mL NYDB培养基的三角瓶中加入抗坏血酸，使其终浓度分别为150μg/mL，200μg/mL，250μg/mL，300μg/mL，350μg/mL,然后分别用接种环接入一环活化好的卡利比克毕赤酵母，于180rpm、28℃条件下培养20h；不诱导培养的酵母直接在NYDB培养基中接入一环活化好的酵母菌，培养条件相同。(3)悬浮液的制备：上述酵母培养物在7000g条件下，离心10-15min，收集菌体，用无菌水洗涤2次，以去除培养介质和抗坏血酸，最后用无菌水重悬酵母菌，并用血球计数板计数，调节酵母细胞浓度为1×108cells/mL。
实施例1：
抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的控制效果：
供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均匀一致,表面无擦伤或机械损伤和病虫伤害。将抗坏血酸加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸的浓度为150μg/mL，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：转速180rpm/min，温度28℃，时间20h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL；
用无菌打孔器在水果赤道处每隔120°打孔，伤口大小为5mm(直径)×3mm(深)。打孔的苹果分为三个处理组，伤口处分别加入30μL以下溶液：(1)1×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母悬液(未经抗坏血酸诱导)；(2)用浓度为150μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母悬液(1×108cells/mL)；(3)无菌水。2h后，再分别向苹果伤口处接种30μL 5×104spores/mL的扩展青霉孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于20℃恒温培养箱中培养(湿度95％)中贮藏。每个处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过7天的培养，记录果实发病率和病斑直径，以此评价抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病发病率的控制效果。
实施例2：
抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的控制效果：
供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均匀一致，表面无擦伤或机械损伤和病虫伤害。将抗坏血酸加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸的浓度为200μg/mL，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：转速180rpm/min，温度28℃，时间20h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL；
用无菌打孔器在水果赤道处每隔120°打孔，伤口大小为5mm(直径)×3mm(深)。打孔的苹果分为三个处理组，伤口处分别加入30μL以下溶液：(1)1×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母悬液(未经抗坏血酸诱导)；(2)用浓度为150μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母悬液(1×108cells/mL)；(3)无菌水。2h后，再分别向苹果伤口处接种30μL 5×104spores/mL的扩展青霉孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于20℃恒温培养箱中培养(湿度95％)中贮藏。每个处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过7天的培养，记录果实发病率和病斑直径，以此评价抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病发病率的控制效果。
实施例3：
抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的控制效果：
供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均匀一致，表面无擦伤或机械损伤和病虫伤害。将抗坏血酸加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸的浓度为250μg/mL，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：转速180rpm/min，温度28℃，时间20h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL；
用无菌打孔器在水果赤道处每隔120°打孔，伤口大小为5mm(直径)×3mm(深)。打孔的苹果分为三个处理组，伤口处分别加入30μL以下溶液：(1)1×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母悬液(未经抗坏血酸诱导)；(2)用浓度为150μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母悬液(1×108cells/mL)；(3)无菌水。2h后，再分别向苹果伤口处接种30μL 5×104spores/mL的扩展青霉孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于20℃恒温培养箱中培养(湿度95％)中贮藏。每个处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过7天的培养，记录果实发病率和病斑直径，以此评价抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病发病率的控制效果。
实施例4：
抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的控制效果：
供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均匀一致，表面无擦伤或机械损伤和病虫伤害。将抗坏血酸加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸的浓度为250μg/mL，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：转速180rpm/min，温度28℃，时间20h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL；
用无菌打孔器在水果赤道处每隔120°打孔，伤口大小为5mm(直径)×3mm(深)。打孔的苹果分为三个处理组，伤口处分别加入30μL以下溶液：(1)1×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母悬液(未经抗坏血酸诱导)；(2)用浓度为150μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母悬液(1×108cells/mL)；(3)无菌水。2h后，再分别向苹果伤口处接种30μL 5×104spores/mL的扩展青霉孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于20℃恒温培养箱中培养(湿度95％)中贮藏。每个处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过7天的培养，记录果实发病率和病斑直径，以此评价抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病发病率的控制效果。
实施例5：
抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的控制效果：
供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均匀一致，表面无擦伤或机械损伤和病虫伤害。将抗坏血酸加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸的浓度为300μg/mL，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：转速180rpm/min，温度28℃，时间20h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL；
用无菌打孔器在水果赤道处每隔120°打孔，伤口大小为5mm(直径)×3mm(深)。打孔的苹果分为三个处理组，伤口处分别加入30μL以下溶液：(1)1×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母悬液(未经抗坏血酸诱导)；(2)用浓度为150μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母悬液(1×108cells/mL)；(3)无菌水。2h后，再分别向苹果伤口处接种30μL 5×104spores/mL的扩展青霉孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于20℃恒温培养箱中培养(湿度95％)中贮藏。每个处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过7天的培养，记录果实发病率和病斑直径，以此评价抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病发病率的控制效果。
实施例6：
抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的控制效果：
供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均匀一致，表面无擦伤或机械损伤和病虫伤害。将抗坏血酸加入NYDB培养基中，培养基中抗坏血酸的浓度为350μg/mL，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养的条件为：转速180rpm/min，温度28℃，时间20h，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液，浓度为1×108cells/mL；
用无菌打孔器在水果赤道处每隔120°打孔，伤口大小为5mm(直径)×3mm(深)。打孔的苹果分为三个处理组，伤口处分别加入30μL以下溶液：(1)1×108cells/mL的卡利比克毕赤酵母悬液(未经抗坏血酸诱导)；(2)用浓度为150μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母悬液(1×108cells/mL)；(3)无菌水。2h后，再分别向苹果伤口处接种30μL 5×104spores/mL的扩展青霉孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，置于20℃恒温培养箱中培养(湿度95％)中贮藏。每个处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过7天的培养，记录果实发病率和病斑直径，以此评价抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病发病率的控制效果。
试验结果
发病率计算公式如下：
发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
如图1所示，抗坏血酸诱导和未诱导的卡利比克毕赤酵母处理的苹果腐烂率均显著低于对照组。而与未经抗坏血酸诱导的拮抗酵母处理组相比，不同浓度抗坏血酸诱导的拮抗酵母处理的苹果发病率均显著降低(P<0.05)，表明抗坏血酸诱导显著提高了卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的防治效力。尤其是250μg/mL抗坏血酸诱导的拮抗酵母处理组，苹果发病率最低，仅为9.81％，显著低于未经诱导的拮抗酵母处理的苹果腐烂率(24.44％)。图2的腐烂直径与发病率的趋势基本一致，不同浓度抗坏血酸诱导的拮抗酵母处理的苹果病斑直径均低于未经抗坏血酸诱导的拮抗酵母处理组，但无显著性差异，其中250μg/mL抗坏血酸诱导的拮抗酵母处理的苹果病斑直径最小，仅为7.43mm。
实施例7：
抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对水果自然腐烂的控制效果：
一、试验方案
将经250μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母悬液(1×108cells/mL)均匀喷于苹果表面，自然晾干后，放入塑料筐用保鲜膜密封，室温下贮藏3个月。取出水果统计腐烂水果个数，并观察腐烂情况。以无菌水喷洒的苹果作为对照。每处理重复3次，整个实验重复2次。抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母对水果自然腐烂的控制效果以发病率表示。
发病率的计算公式如下:
发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
二、试验结果
按照上述步骤试验，统计的自然腐烂率结果如图3所示。由图可以看出，经250μg/mL抗坏血酸诱导的卡利比克毕赤酵母处理的苹果果实发病率均显著低于对照，为30.13％。未经诱导的卡利比克毕赤酵母处理的苹果的自然腐烂率率(44.68％)显著低于诱导的酵母。表明抗坏血酸诱导提高了卡利比克毕赤酵母对苹果自然腐烂的控制效果。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (7)

1.抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
将抗坏血酸加入NYDB培养基中，然后将卡利比克毕赤酵母接种到培养基中进行培养，培养后离心得到菌体，无菌水清洗，然后用无菌水制备成菌悬液；将菌悬液均匀喷洒于水果表面，自然风干后用保鲜膜密封，置于室温存放，实现对水果采后病害的控制。
2. 根据权利要求1所述的抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于，所述的NYDB培养基为：以1000mL计，酵母膏，牛肉浸膏和葡萄糖的质量比为5 ：8 ：10，余量为蒸馏水，pH自然。
3. 根据权利要求1所述的抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于，所述NYDB培养基中抗坏血酸的浓度为150~350 μg/mL。
4. 根据权利要求1所述的抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于，所述NYDB培养基中抗坏血酸的浓度为250 μg/mL。
5. 根据权利要求1所述的抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于，所述培养的条件为：转速180 rpm/min，温度28℃，时间20 h。
6. 根据权利要求1所述的抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于，所述菌悬液的浓度为1×108 cells/mL。
7.根据权利要求1所述的抗坏血酸诱导卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法，其特征在于，所述的水果为苹果；所述的病害为青霉病。
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