CN109055245A - 一种海洋源锁掷孢酵母及其防控草莓病害的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海洋源锁掷孢酵母及其在草莓病害防治中的应用，特点是该菌株为ZMY‑1菌株，分类命名为锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus），于2018年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15618，该菌株的ITS序列如SEQ NO1所示；该菌株分离于福建漳江口红树林中采集的海泥，对果蔬灰霉病的病原真菌灰葡萄孢霉具有显著的拮抗作用，对草莓采后灰霉病和自然病害具有良好的防治作用，优点是该菌株的制备工艺简单，生长稳定，能够耐受冷链贮藏中的低温环境，在果蔬采后病害防治方面有很大的应用前景。

Description

一种海洋源锁掷孢酵母及其防控草莓病害的应用
技术领域
本发明属于生物防治领域，尤其是涉及一种海洋源锁掷孢酵母及其防控草莓病害的应用。
背景技术
草莓富含大量的维生素、有机酸、矿物质元素和抗氧化物质等营养成分，深受消费者的喜爱。草莓由于果实组织娇嫩，果皮极薄，极不耐贮，在采后容易发生腐烂。灰霉病是目前草莓生产过程中最常见的一种真菌性病害，其病原菌灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），在我国各草莓栽培地区都有发生，主要危害花和果实，在种植和采后贮运期间引发草莓腐烂，降低草莓的产量和品质，造成巨大的经济损失。
长期以来控制灰霉病的主要措施是采用化学杀菌剂，目前使用的化学杀菌剂种类很多如多菌灵、克霉灵、腐霉利和保果灵等等。然而，B. cinerea是果蔬采后的高风险性病原菌，频繁使用化学杀菌剂会导致田间产生抗药性菌株，而且容易导致果蔬农药残留超标，威胁食品安全、危害人类健康和造成环境污染。因此，为了减少化学杀菌剂的使用，确保果蔬的卫生和安全，寻求安全有效、绿色环保的采后病害防治技术是目前研究的重要课题。
近年来，利用生物拮抗菌防治果蔬采后病害是一种安全有效的新兴技术，也是成为替代化学杀菌剂最具潜力的方法之一。酵母由于安全稳定、不产毒素、能在果蔬表面生长定植，是采后病害生物防治研究的热点，但是真正实现商业化生产和应用的并不多，主要是因为目前研究的拮抗酵母大多数分离自果蔬表面，生长条件限制太多，而商业生产中环境变化大、条件恶劣，限制了酵母的生长繁殖。因此，改进分离筛选策略，获得新型、高效的生防酵母菌株具有非常重要的意义。
海洋酵母是生活在海洋中酵母的统称，长期处于低温、高盐、高压的生态环境中，比陆生酵母具有较强的耐低温和耐高渗透压等优良特性，如果能应用于果蔬采后病害的生物防治，将比其他从果蔬表面和伤口分离的陆生拮抗酵母更有优势。另外草莓是一种皮薄肉嫩的浆果，在采后处理过程中容易发生机械损伤、遇水易腐烂，所以很多保鲜防病的方法很难真正应用在草莓商业化生产中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种生长稳定，能够耐受冷链贮藏中的低温环境且能有效抑制草莓灰霉病的海洋源锁掷孢酵母及其防控草莓病害的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海洋源锁掷孢酵母，该菌株为ZMY-1菌株，分类命名为锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus），于2018年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 15618。
所述的菌株的ITS序列如SEQ NO1所示。
上述海洋源锁掷孢酵母的应用，所述的海洋源锁掷孢酵母在制备灰葡萄孢霉拮抗剂或者制备草莓灰霉病生物防治剂方面的用途。
将海洋源锁掷孢酵母ZMY-1用来防治引发草莓的采后病害，具体使用方法为：首先培养海洋源锁掷孢酵母ZMY-1，制备浓度为1×108cells/mL的菌悬液，采前在草莓始红期、半红期和红熟期在田间喷洒草莓，草莓叶片和果实表面湿润，直至有液滴滴下，待果实成熟后采收，置于货架温度和低温下贮藏。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明通过实验证实本发明提供的锁掷孢酵母ZMY-1对草莓灰霉病具有良好的防治效果。并研究了具体应用的最佳使用方法，实验结果表明，在草莓始红期、半红期和红熟期在田间喷洒草莓，草莓采后在货架温度下贮藏4天，自然病害发生减少了50%，在4℃温度下贮藏15天，自然病害减少了40%，减少了草莓采后的腐烂损失，具有良好的经济效益。
2、本发明在海泥中分离到一株锁掷孢酵母ZMY-1，该菌株能够耐低温、高湿的环境，对温度等自然条件适应范围广，对冷链环境的耐受力强。锁掷孢酵母ZMY-1不分泌产生抗菌物质，通过营养和空间的竞争，抑制灰霉菌的生长和繁殖，而且能够诱导草莓的抗病防御反应，因此降低了草莓采后的病害发生率，减少了腐烂损失。因此，在采前环节利用海洋酵母的拮抗作用，抑制病原真菌的侵染，达到防治草莓采后病害的效果，将具有极大的商业化应用前景。
海洋源锁掷孢酵母菌株，该菌株命名为锁掷孢酵母Sporidiobolus pararoseus ZMY-1，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年4月16日，保藏编号为CGMCC NO.15618。
附图说明
图1为海洋源锁掷孢酵母ZMY-1的ITS序列比对结果；
图2为海洋源锁掷孢酵母ZMY-1对灰葡萄孢霉的体外拮抗效果；
图3为海洋源锁掷孢酵母ZMY-1对灰葡萄孢霉的体内拮抗效果；
图4为采前喷施海洋源锁掷孢酵母ZMY-1处理对草莓采后病害的防治效果；
图5为采前喷施海洋源锁掷孢酵母ZMY-1处理的草莓在4℃贮藏15天的效果图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
1、菌种分离纯化
从福建漳州红树林中采取海泥，称取1g海泥样品于100mL的无菌水中，在涡旋仪上混匀后分别进行梯度稀释至10-2、10-3和10-4，再分别吸取1mL稀释液涂布于营养酵母葡萄糖琼脂（Nutrient yeast dextrose agar，NYDA）培养基上，28℃倒置培养2天。挑取肉眼可见的菌落，移入NYDA平板，恒温培养，直至纯化得到单菌落，然后将菌落转移至NYDA培养基上保存。
NYDA选择性培养基制备方法：称取琼脂20 g、牛肉膏8 g、酵母浸膏5 g和葡萄糖10g溶于1 L蒸馏水，121℃高温高压灭菌15 min，待培养基冷却至55℃时加入培养基质量1%的链霉素。
2、菌种鉴定
用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取本发明菌株ZMY-1的DNA，然后采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增rDNA的ITS区域，得到的目的片段大小约为574bp并进行测序分析，具体序列如SEQ NO1所示。海洋源锁掷孢酵母ZMY-1的ITS序列比对结果如图1所示，测序结果在NCBI上进行BLAST比对，鉴定为锁掷孢酵母，因此命名为Sporidiobolus pararoseus ZMY-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年4月16日，保藏编号为CGMCC NO. 15618。
上述锁掷孢酵母Sporidiobolus pararoseus ZMY-1，属于担子菌亚门，冬孢菌纲，黑粉菌目，掷孢酵母科。菌落在NYDA培养基上生长较快，菌落呈玫红色，圆形，表面光滑，产生掷孢子。
具体实施例二
锁掷孢酵母体内体外拮抗灰葡萄孢霉的作用
海洋源锁掷孢酵母ZMY-1对灰葡萄孢霉的拮抗作用分别在马铃薯葡萄糖琼脂（PotatoDextrose Agar，PDA）培养基和草莓果实上进行试验。
体外拮抗试验：预先将灰葡萄孢霉在PDA平板上培养7 d，用已灭菌的打孔器打下直径5 mm的菌块。对照组直接将灰霉菌块置于新制备的PDA平板中央，酵母处理组先在PDA平板上加入100 μL浓度为1×108 cells/mL的锁掷孢酵母ZMY-1的菌悬液，涂布均匀后，再将灰霉菌块置于中央，放入25 ℃恒温恒湿培养箱中培养3天，测量菌斑直径。
体内拮抗试验：预先将灰葡萄孢霉在PDA平板上培养7 d，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×105个/mL的灰霉孢子悬浮液。草莓果实用消毒铁钉在果实赤道部位刺一个直径3mm、深3 mm的伤口，在伤口处接种10 μL的灰霉孢子悬浮液，自然晾干，对照组随后接种10 μL无菌水，处理组接种10 μL浓度为1×108 cells/mL的锁掷孢酵母ZMY-1的菌悬液，自然晾干后，放入20℃恒温恒湿培养箱中放置3天，记录草莓果实灰霉病发病率。
如图2和图3所示，海洋源锁掷孢酵母ZMY-1能够有效地抑制灰霉在PDA培养基和草莓果实上的生长，对灰霉有显著的拮抗效果。
具体实施例三
锁掷孢酵母采前喷施
将上述锁掷孢酵母ZMY-1接种在NYDA培养基上，28℃培养2d后，在平板上用接种环接种于200mL液体NYDB培养基上，28℃ 200rpm培养48 h，用无菌水稀释，配制成浓度为1×108 cells/mL的菌悬液。
在草莓始红期、半红期和红熟期，即采前6天、3天和1天喷洒，处理组喷洒锁掷孢酵母ZMY-1菌悬液，对照组喷洒蒸馏水，然后在果实商业成熟度时采摘，将果实运回实验室，置于货架温度和低温贮藏，观察病害发生情况。
如图4和图5所示，经采前喷洒锁掷孢酵母ZMY-1处理的草莓在采后货架温度下贮藏4天的病害发生率只有25.5%，对照组的病害发生率高达77.7%，低温贮藏15天对照组病害发生率高达53.3%，采前喷洒锁掷孢酵母ZMY-1处理组病害发生率仅有13.3%。因此，采前喷洒锁掷孢酵母ZMY-1处理对草莓果实病害具有显著的抑制效果。
以上实验证明，本发明的锁掷孢酵母ZMY-1菌株可以有效的抑制灰葡萄孢霉的生长，采前喷施锁掷孢酵母ZMY-1能有效防治草莓采后病害的发生，具有良好的生物防治作用，且不会造成环境污染，解决了现有的生防真菌对草莓采后病害防治效果不佳的问题。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种海洋源锁掷孢酵母及其防控草莓病害的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 574
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 海洋源锁掷孢酵母的ITS序列
<400> 1
CCTGCGGAAGGATCATTATTGAAAACAAGGGTGTCCAATTTAACTTGGAACCCAAACTTCTCAATTCTAACTTTGTGCATCTGTATTAATGGCGAGCAACTTCGGTTGTGAGCCTTCACTTACAAAACACTAGTCTATGAATGTAAAATTTTTATAACAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGTCTGTTTGAGTGTCATGAATTCTTCAACCCAATCTTTTCTTGTAATCGATTGGTGTTTGGATTCTGAGCGTTGCTGGCGTTTGCCTAGCTCGTTCGTAATACATTAGCATCCCTAATACAAGTTTGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTAAGGATTCGGTGGAAACATCGAGCCAACTTCATTAAGGAAGCTCCTAATTTAAAAGTCTACCTTTTGATTAGATCTCAAATCAGGCAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA 574

Claims (4)

1.一种海洋源锁掷孢酵母，其特征在于：该菌株为ZMY-1菌株，分类命名为锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus），于2018年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 15618。
2.根据权利要求1所述的一种海洋源锁掷孢酵母，其特征在于：所述的菌株的ITS序列如SEQ NO1所示。
3.一种权利要求1-2中任一项所述的海洋源锁掷孢酵母的应用，其特征在于：如权利要求1所述的海洋源锁掷孢酵母在制备灰葡萄孢霉拮抗剂或者制备草莓灰霉病生物防治剂方面的用途。
4.根据权利要求3所述的一种海洋源锁掷孢酵母的应用，其特征在于：将海洋源锁掷孢酵母ZMY-1用来防治引发草莓的采后病害，具体使用方法为：首先培养海洋源锁掷孢酵母ZMY-1，制备浓度为1×108cells/mL的菌悬液，采前在草莓始红期、半红期和红熟期在田间喷洒草莓，草莓叶片和果实表面湿润，直至有液滴滴下，待果实成熟后采收，置于货架温度和低温下贮藏。
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