CN101919441A - 防治果实青霉病的生物防腐保鲜剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治果实青霉病的生物防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙、水杨酸和水组成，每1L保鲜剂中含有1×109～1×1011个罗伦隐球酵母细胞、0.5～2g的壳聚糖、10～20g的氯化钙和2～20mg的水杨酸，其余为水；罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该生物防腐保鲜剂能有效控制果实的青霉病。
Description
技术领域
本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种用于防治果实青霉病的生物防腐保鲜技术。
背景技术
青霉病是苹果、梨等大宗水果采后主要病害之一，每年都造成了巨大的经济损失。传统上，国内外对果实采后病害的控制主要依赖于杀菌剂。但是，随着人们对食品安全和环境保护意识的不断增强，化学杀菌剂的使用范围和剂量也受到了越来越严格的限制。在欧美发达国家，许多高效但存在食品安全和环境污染隐患的化学杀菌剂被禁止使用。因此，从长期可持续发展的角度出发，国内外都非常关注高效、安全、环境友好的新型防腐保鲜技术的研究和开发。研究、开发能替代化学杀菌剂的方法和技术具有重大的社会意义和广阔的应用前景。
在众多被研究的可能替代化学杀菌剂的方法中，利用拮抗微生物，特别是拮抗酵母抑制采后果实病害的生物防治技术是当前国内外最为关注的新型采后病害控制方法之一。但目前拮抗酵母对病原物的控制效力与杀菌剂相比还存在较大的差距。通过商业化试验表明，目前研究中的采后拮抗酵母，包括国外已商业化生产的拮抗酵母都只有在补充低剂量杀菌剂的条件下才能达到与杀菌剂(正常使用量)同等的效果(Droby等，2009；Sharma等，2009)。因此如何利用安全而且有效的方法提高拮抗酵母的效力是影响采后拮抗酵母大规模推广应用的关键性问题。
罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治微生物菌株，其拮抗机理涉及营养和空间竞争、与病原菌粘合、分泌β-1，3-葡聚糖酶、抗氧化胁迫、诱导果实抗性或抗性相关反应、降解病原菌分泌的真菌毒素和降解果实与激发病原菌孢子萌发相关的挥发物等。林丽等(2003)报道利用罗伦隐球酵母和低剂量杀菌剂(扑海因)能抑制桃果实青霉病和软腐病的发病率。Yao和Tian(2005)报道罗伦隐球酵母和茉莉酸能降低桃果实青霉病和褐腐病的发生。Zhang等(2007ab)的研究表明，罗伦隐球酵母与热处理结合能减少桃果实的青霉病和灰霉病的发病率。中国发明专利(专利号ZL200310115337.9，用硅酸钠或硅酸钾防治果蔬采后病害的方法以及果蔬采后病害防治液)公开了一种利用硅酸盐及罗伦隐球酵母等控制甜樱桃、黄瓜、桃和冬枣等果实病害的方法。该发明专利显示，利用硅酸钠或硅酸钾能降低桃果实病害的发病率；但未显示利用罗伦隐球酵母对桃果实病害的控制效应。中国发明专利申请号200310115336.4(一种生物拮抗菌及其应用)公开了一种利用罗伦隐球酵母和杀菌剂及氯化钙等防治甜樱桃、冬枣及苹果果实病害的方法；中国发明专利申请号200810128441.4(一种生物活性果蔬保鲜膜)公开了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法；中国发明申请号200910078858.9(葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂)公开一种利用罗伦隐球酵母和硼酸盐等防治葡萄果实病害或脱粒的方法。另外，中国发明专利(专利号ZL200510090063.1，一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基)公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方；中国发明专利(专利号ZL200510090065.0，酵母拮抗菌C.laurentii的真空冷冻干燥制品及其制备方法)公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法；中国发明申请专利(申请号200910079774.7，一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法)公开了一种制备罗伦隐球酵母常温保存的胶囊剂制备方法。
壳聚糖是几丁质脱乙酰产物。作为一种可生物降解的天然物质，壳聚糖不仅资源丰富、价格低廉、无毒安全，而且具有众多独特的功能，在食品和采后保鲜等领域都有着广泛的研究和应用。在采后领域，国内外的研究重点关注壳聚糖具有的3个显著的生物学功能，即：延缓果实成熟、衰老、维持采后品质的功能；直接抑菌的功能和作为激发子诱导果实抗性的功能(Bautista-
等，2006)。我们的研究表明，壳聚糖能与罗伦隐球酵母有效整合显著提高对果实青霉病的抑制效力(余挺等，2007a)。钙处理是采后保鲜的常用手段。据研究报道，钙处理不仅能延缓果实采后的成熟衰老，维持采后品质，而且还与果实对病害的抗性密切相关。例如，不仅采前钙处理能降低桃果实褐腐病的发病率；而且采后钙处理也能诱导梨果实对黑斑病的抗性(Tian等，2006；Elmer等，2007)。水杨酸(Salicylicacid，SA)，化学名称为邻羟基苯甲酸，是一种普遍存在的植物内源酚类化合物。SA是研究最为广泛的植物抗性信号分子，在SAR等抗性机制中起关键作用(Durrant和Dong，2004)。前人的研究表明，在病原菌侵染植物时，植物体内SA水平迅速提高，并伴随PR蛋白的大量产生；外源SA处理也能显著诱导PR蛋白产生和相关基因表达，激活原位和系统抗性；在拟南介和烟草组织中过度表达SA合成基因导致植物对病害抗性的提高；而在植物体内表达SA降解酶的基因后，组织体内SA浓度水平降低的同时，植物对病害的抗性也随之下降(Durrant和Dong，2004)。SA及其结构类似物或衍生物在采后有广泛的研究。相关研究已经证实SA处理延缓采后果实成熟衰老、提高对非生物逆境的抗性或诱导采后果实对病原菌的抗性及抗性相关反应。SA与拮抗微生物配合使用，控制真菌病害的研究国际上也有报道。Qin等(2003)的研究表明，联合SA处理和拮抗酵母Rhodotorulaglutinis能显著提高对甜樱桃病原菌Penicillium expansum和Altemaria alternata的控制；但同时他们发现联合SA处理不能增强Cryptococcus laurentii对甜樱桃病害的控制效力；Spadaro等(2004)报道拮抗酵母Metschnikowia pulcherrima和SA结构类似物(ASM)整合处理对苹果果实P.expansum和B.cinerea的拮抗效果。但他们的研究结果显示M.pulcherrima与ASM联合处理的效果与M.pulcherrima单独使用相比没有显著差异。
专利申请号为201010152108.4的发明专利《桃果实病害生物防腐保鲜剂及用途和所用罗伦隐球酵母》提供了一种罗伦隐球酵母，其保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保臧号：CGMCC NO.3590。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种在不使用化学杀菌剂前提下能有效控制果实采后青霉病的生物防腐保鲜剂。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种防治果实青霉病的生物防腐保鲜剂，该保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙、水杨酸和水组成，每1L保鲜剂中含有1×109～1×1011个罗伦隐球酵母细胞、0.5～2g的壳聚糖、10～20g的氯化钙和2～20mg的水杨酸，其余为水；罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的生物防腐保鲜剂，是将罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号CGMCC 3590)悬浮液和病害控制增效剂(壳聚糖、氯化钙和水杨酸)进行复合而得；果实经本发明的生物防腐保鲜剂处理后，可以进行常温或低温贮藏。
本发明的生物防腐保鲜剂只有在确保酵母活性的基础上才能发挥最佳的防腐效应，因此所用的罗伦隐球酵母悬浮液是指经过菌种活化、并配制成的具有抑菌效果且浓度适宜的酵母菌悬液，其有效浓度为1×106细胞/毫升～1×109细胞/毫升。
罗伦隐球酵母和病害控制增效剂的复合处理是指将病害控制增效成分直接添加到酵母菌菌悬液中，从而制成生物防腐保鲜剂。病害控制增效剂是指壳聚糖、氯化钙和水杨酸，其有效浓度分别为，每1L保鲜剂中含有0.5～2g的壳聚糖、10～20g的氯化钙和2～20mg水杨酸。
本发明所设定的病害控制增效剂的有效浓度是指其使用量确保不抑制拮抗酵母的生长和繁殖，并能发挥壳聚糖、氯化钙和水杨酸特定生理功能的浓度。
本发明的生物防腐保鲜剂有效整合了拮抗酵母(罗伦隐球酵母悬浮液)、壳聚糖、氯化钙和水杨酸的抑菌和生理活性，从而能显著抑制果实青霉病病害的发生和发展；由于能根据具体情况大幅度降低拮抗酵母的使用量，从而显著降低成本。
本发明的生物防腐保鲜剂具有安全高效、环境友好、病害防治效果突出等优点。使用本发明的生物防腐保鲜剂，能转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对确保食品安全、环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要意义。
实际使用时，可任选以下任意一种处理方式对果实进行处理：
处理方式一：选择无机械损伤、未感染的果实，用自来水冲洗、并在室温(25℃左右)下放干；接着将果实放入本发明的生物防腐保鲜剂中浸泡3分钟，取出后室温下放干，然后放入保鲜薄膜袋中在室温(25℃左右)下保持20～24小时，接着将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。
处理方式二：采前采用喷壶喷洒的处理方法，将本发明的生物防腐保鲜剂溶液喷在果实表面(湿润即可)，待干后取下果实放入保鲜薄膜袋中在室温(25℃左右)下保持20～24小时，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。
附图说明
图1是生物防腐保鲜剂对梨果实青霉病的控制的时间动态效应(病害发生率)图；
图1中，对照为：水；
杀菌剂对照为：扑海英(浓度为1000μg/ml)；
酵母单独为：单独使用Cryptococcus laurentii悬浮液(浓度为108cells/ml)；
防腐增效剂单独为：每L溶液中含有2g壳聚糖、10g氯化钙和20mg水杨酸，其余为水；
生物防腐保鲜剂(即本发明)为：每L溶液中含有1011个罗伦隐球酵母细胞(Cryptococcus laurentii)、2g壳聚糖、10g氯化钙和20mg水杨酸，其余为水；
图2是生物防腐保鲜剂对梨果实青霉病的控制的时间动态效应(病斑直径)图；
图2中，对照为：水；
杀菌剂对照为：扑海英(浓度为1000μg/ml)；
酵母单独为：单独使用Cryptococcus laurentii悬浮液(浓度为108cells/ml)；防腐增效剂单独为：每L溶液中含有2g壳聚糖、10g氯化钙和20mg水杨酸，其余为水；
生防保鲜剂(即本发明)为：每L溶液中含有1011个罗伦隐球酵母细胞(Cryptococcuslaurentii)、2g壳聚糖、10g氯化钙和20mg水杨酸，其余为水；
图3是生物防腐保鲜剂对苹果果实青霉病的控制的时间动态效应(病斑直径)图；
图3中，对照为：水；
杀菌剂为：扑海英(浓度为1000μg/ml)；
酵母单独为：单独使用Cryptococcus laurentii悬浮液(浓度为108cells/ml)；
生防保鲜剂(即本发明)为：每L溶液中含有1011个罗伦隐球酵母细胞(Cryptococcuslaurentii)、2g壳聚糖、10g氯化钙和20mg水杨酸，其余为水；
图4是生物防腐保鲜剂对预先接种病原菌的控制效应(梨)图；
图4中，对照为：水；
杀菌剂为：扑海英(浓度为1000μg/ml)；
酵母单独为：单独使用Cryptococcus laurentii悬浮液(浓度为108cells/ml)；
生防保鲜剂(即本发明)为：每L溶液中含有1011个罗伦隐球酵母细胞(Cryptococcus laurentii)、2g壳聚糖、10g氯化钙和20mg水杨酸，其余为水；
图5是生物防腐保鲜剂对预先接种病原菌的控制效应(苹果)图；
图5中，对照为：水；
杀菌剂为：扑海英(浓度为1000μg/ml)；
酵母单独为：单独使用Cryptococcus laurentii悬浮液(浓度为108cells/ml)；
生防保鲜剂(即本发明)为：每L溶液中含有1011个罗伦隐球酵母细胞(Cryptococcus laurentii)、2g壳聚糖、10g氯化钙和20mg水杨酸，其余为水；
具体实施方式
以下实施例中的果实为苹果果实或梨果实，苹果果实的试验品种为富士，梨果实试验品种为水晶；
拮抗酵母为罗伦隐球酵母〔Cryptococcus laurentii(Kufferath)Skinner〕；病原菌为扩展青霉(Penicillium expansum)。壳聚糖可购自浙江澳兴生物科技有限公司，氯化钙为分析纯无水氯化钙，水杨酸(SA)，赤霉素(GA)为分析纯试剂。
罗伦隐球酵母悬浮液的制备方法如下：
以下所用的NYDA培养基为：牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，高压灭菌。所用的NYDB种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，高压灭菌。
罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在低温(4℃)下保存在NYDA培养基中。培养程序依次为：
①、活化：罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590先在NYDA培养基中28℃培养48小时，然后重复传代培养2次(每次均为在NYDA培养基中28℃培养48小时)；
将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYDB种子培养基中，于200rpm、28℃下培养24小时；然后在相同条件下重复培养1次(即将NYDB种子培养基中培养而得的酵母再次用接种环接到NYDB种子培养基中，200rpm、28℃下培养24小时)；
②、液体培养：用步骤①活化所得的酵母按照5％(重量比)的接种量接到NYDB种子培养基中，在200rpm、28℃条件下培养24小时；
③、离心分离：将步骤②液体培养后的所得物在3000rpm条件下，离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；
④、悬浮和确定浓度：用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。
在以下实施例及实验中，1％(w/v)的壳聚糖溶液是代表每L壳聚糖溶液中含有10g壳聚糖，10％(w/v)的氯化钙溶液是代表每L氯化钙溶液中含有100g氯化钙。其余类同。
实施例1、生物防腐保鲜剂
在浓度为5×108个细胞/ml、体积为2升的罗伦隐球酵母悬浮液中缓慢加入浓度为1％(w/v)的壳聚糖溶液2升(即每L壳聚糖溶液中含有10g壳聚糖)，壳聚糖溶液加入完毕后继续搅拌混匀5分钟；然后在保持搅拌的条件下，缓慢加入浓度为10％(w/v)的氯化钙溶液1升，氯化钙溶液加入完毕后继续搅拌混匀5分钟，再缓慢加入浓度为2000mg/L水杨酸100ml，继续搅拌混匀5分钟，加水稀释到10升备用。该最终所得的每L生物防腐保鲜剂中含有1×1011个罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)细胞、2g壳聚糖、10g氯化钙和20mg水杨酸，其余为水。
为了证明本发明的生物防腐保鲜效果，发明人分别进行了如下实验：
实验一、果实青霉病生物防腐保鲜剂的筛选
用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和的深度的伤口。将C.laurentii细胞悬浮在含有各种不同成分及含量的病害控制物中，从而获得不同的组合试剂；各取30μl不同的组合试剂分别添加到不同的果实伤口处。病原菌接种在以上处理2小时后在每个伤口加入等量(30μl)的病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为104spores/ml)。处理完毕后在常温(20～25℃)下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理每重复12个果实，每处理重复3次。
实验处理采用L9(34)正交实验设计方法，其表头设计见表1。实际处理安排和试验结果分别见表2(苹果)和表3(梨)。
表1.L9(34)正交试验因素水平*
具体处理安排如下：
处理1：处理液所含成分为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.05％(w/v)；即每L处理液中含有1010个罗伦隐球酵母细胞和0.5g的壳聚糖。
处理2：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.05％(w/v)，氯化钙1％(w/v)，水杨酸(SA)浓度为2μg/ml和赤霉素(GA3)浓度为20μg/ml。
处理3：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.05％(w/v)，氯化钙2％(w/v)，水杨酸(SA)浓度为20μg/ml和赤霉素(GA3)浓度为200μg/ml。
处理4：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.1％(w/v)水杨酸(SA)浓度为20μg/ml和赤霉素(GA3)浓度为20μg/ml。
处理5：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.1％(w/v)，氯化钙1％(w/v)和赤霉素(GA3)浓度为200μg/ml。
处理6：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.1％(w/v)，氯化钙2％(w/v)和水杨酸(SA)浓度为2μg/ml。
处理7：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％(w/v)，水杨酸(SA)浓度为2μg/ml和赤霉素(GA3)浓度为200μg/ml。
处理8：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％(w/v)，氯化钙1％(w/v)和水杨酸(SA)浓度为20μg/ml。
处理9：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％(w/v)，氯化钙2％(w/v)和赤霉素(GA3)浓度为20μg/ml。
处理10：对照，水。
处理11：对照，处理液所含成分浓度分别为107ells/ml低浓度酵母单独使用。
处理12：对照，处理液所含成分浓度分别为108ells/ml高浓度酵母单独使用。
从表2正交试验的极差R值可以看出，影响生防促进因子对苹果青霉病控制效力的因素依次为：壳聚糖、CaCl2、SA和GA3，其中获得的较佳处理组合(处理8)为壳聚糖0.2％+CaCl21％+SA20μg/ml能使107cells/ml的酵母控制力提高到与108cells/ml酵母效力相当的水平。从表3可知，影响对梨青霉病控制效力的因素也依次为：壳聚糖、CaCl2、SA和GA3，其中获得的较佳处理组合(处理8)为：0.2％壳聚糖、1％CaCl2和20μg/ml SA能使107cells/ml的酵母控制力提高到与108cells/ml酵母效力相当的水平。这一个较佳组合不仅与极差分析一致，而且在苹果和梨上也得到一致的结果。
表2.苹果L9(34)正交试验结果
表3.梨果L9(34)正交试验结果
实验二使用不同浓度生防酵母的生物防腐保鲜剂对果实青霉病的控制效应：
用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和的深度的伤口。选用以下不同处理所对应的，并各取30μl分别添加到果实伤口处。
具体处理安排如下：
处理1：水对照。
处理2：杀菌剂对照，处理液所含成分浓度为扑海英，浓度为1000μg/ml。
处理3：处理液所含成分浓度为C.laurentii，浓度为106cells/ml。
处理4：生防保鲜液所含成分浓度分别为C.laurentii(浓度为106cells/ml)，壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
处理5：处理液所含成分浓度为C.laurentii，浓度为107cells/ml。
处理6：生防保鲜液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
处理7：处理液所含成分浓度为C.laurentii，浓度为108cells/ml。
处理8：生防保鲜液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为108cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
病原菌接种在以上处理2小时后，在每个伤口加入等量(30μl)的病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为104spores ml-1)。处理完毕后在常温(20～25℃)下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理每重复12个果实，每处理重复3次。
结果如表4所示。考察了106、107、108cells/ml三种浓度的拮抗酵母和最佳添加剂组合对梨青霉病的抑制作用的影响。从表4可以看出C.laurentii浓度是影响其控制青霉病效果的关键因素。当C.laurentii浓度为108cells/ml时，对梨青霉病病害早期(3天内)症状能与杀菌剂(1000μg/ml扑海英)一样有效，而当酵母浓度下降到106cells/ml时，则不能产生对病害的抑制效果。107cells/ml浓度的C.laurentii与高浓度相比，其效力显著下降，但比106cells/ml的效力要强。添加剂组合(0.2％壳聚糖+1％氯化钙+20μg/mlSA)能显著增强低浓度罗伦隐球酵母水平(106cells/ml和107cells/ml)对果实病害的控制，并达到高浓度罗伦隐球酵母水平(108cells/ml)对病害的控制水平。
表4生物防腐保鲜剂对梨青霉病的控制效应
| 平均病斑直径(毫米) | 显著性分析 | |
| 处理1：水对照 | 13.3±0.5 | a |
| 处理2：杀菌剂对照 | 1.0±1.0 | c |
| 处理3：C.laurentii(106cells/ml) | 11.5±0.5 | a |
| 处理4C.laurentii(106cells/ml)+0.2％壳聚糖+1％氯化钙+20μg/mlSA | 0±0 | c |
| 处理5：C.laurentii(107cells/ml) | 9.4±0.2 | b |
| 处理6：C.laurentii(107cells/ml)+0.2％壳聚糖+1％氯化钙+20μg/mlSA | 0±0 | c |
| 处理7：C.laurentii(108cells/ml) | 0±0 | c |
| 处理8：C.laurentii(108cells/ml)+0.2％壳聚糖+1％氯化钙+20μg/mlSA | 0±0 | c |
表中数字为平均数±标准误；不同字母表示经过邓肯多重比较处理之间存在显著性差异(P＝0.05)。
实验三、生物防腐保鲜剂对果实青霉病的控制的时间动态效应
用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和的深度的伤口。选用以下不同处理所对应的，并各取30μl分别添加到果实伤口处。
具体处理安排如下：
梨果实设置以下处理：
对照为水。
杀菌剂：处理液所含成分为扑海英，浓度为1000μg/ml。
酵母单独使用：处理液所含成分为Cryptococcus laurentii，浓度为108cells/ml。
病害增效剂单独使用：处理液所含成分浓度分别为壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
生防保鲜剂(本发明)处理：生防保鲜液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为108cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
苹果果实设置以下处理：
对照为水。
杀菌剂：处理液所含成分为扑海英，浓度为1000μg/ml。
酵母单独使用：处理液所含成分为Cryptococcus laurentii，浓度为108cells/ml。
病害增效剂单独使用：处理液所含成分浓度分别为壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
生防保鲜剂处理：生防保鲜液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为108cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
病原菌接种在以上处理2小时后，在每个伤口加入等量(30μl)的病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为104spores ml-1)。处理完毕后在常温(20～25℃)下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理每重复36个果实，每处理重复3次。
梨果实上的结果如图1和图2所示：C.laurentii(108cells/ml)能抑制梨果实伤口青霉病，特别是对早期病害的控制(5天内)。但随着时间的进程，其效力持续下降，到第8天时仅能降低30％左右的的病害发生率。添加剂组合(0.2％壳聚糖+1％氯化钙+20μg/mlSA)单独使用仅在第5天对青霉病的发生率有所降低(15％左右，P＜0.01)，但不能抑制其后病害的进一步的发生(P＞0.05)。但添加剂组合单独使用能显著降低病害的严重程度(平均病斑直径，P＜0.01)；不过其控制水平明显低于C.laurentii单独使用的效果(P＜0.01)。而添加剂与C.laurentii处理能显著增强对病害的控制：到第8天，生防保鲜剂处理后的果实发病率仅25％左右，与C.laurentii单独使用的相比，降低45个百分点(P＜0.0001)。
苹果果实上的结果如图3所示：生防保鲜剂处理对苹果青霉病的控制效力，在7天内与1000μg/ml扑海英效果基本相当(由于病害增效剂单独使用时没有抑菌效力，图3中未显示)。
实验四、生物防腐保鲜剂对预先接种病原菌的控制效应
用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和的深度的伤口。先在每个伤口加入等量(30μl)的病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为104spores/ml)，6小时以后再选用下述处理，并各取30μl分别添加到果实伤口处。
设置以下处理：
对照为水。
杀菌剂：处理液所含成分为扑海英，浓度为1000μg/ml。
酵母单独使用：处理液所含成分为Cryptococcus laurentii，浓度为108cells/ml。
病害增效剂单独使用：处理液所含成分浓度分别为壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
生防保鲜剂处理：生防保鲜液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为108cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％，氯化钙浓度为1％和SA浓度为20μg/ml。
处理完毕后在常温(20～25℃)下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理每重复48个果实，每处理重复3次。
梨果实的试验结果如图4所示，当病原菌比C.laurentii提前6小时接种于果实伤口后，生防保鲜剂处理对病害的控制效力与其先于(2小时)病原菌接种的处理相比，对病害的控制效力大幅度下降，但在5天时间内仍显著高于对照和C.laurentii单独处理的效果(P＜0.05)。而杀菌剂扑海英(1000μg/ml)对预先接种的病原菌控制也较稳定。(由于病害增效剂单独使用时没有抑菌效力，图中未显示)
苹果果实上的结果如图5所示：与酵母单独使用的相比，生防保鲜剂处理能显著增强对提前6小时接种于果实伤口处病原菌的侵染，且其抑制效果7天时间内明显高于对照和C.laurentii单独处理的效果(P＜0.05)。(由于病害增效剂单独使用时没有抑菌效力，图中未显示)
为进一步验证本发明中SA的效果，设置了以下实验五：
1、处理液1：处理液所含成分浓度为病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为105sporesml-1)，其余水，作为对照；
2、处理液2：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.25％(w/v)，氯化钙2％(w/v)，病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为105spores ml-1)，其余为水。
3、处理液3(本发明)，处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为107cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％(w/v)，氯化钙1％(w/v)，水杨酸(SA)浓度为20μg/ml，病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为105spores ml-1)，其余为水。
4、处理液4：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为106cells/ml，壳聚糖浓度为0.25％(w/v)，氯化钙2％(w/v)，病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为105spores ml-1)，其余为水。
5、处理液5(本发明)：处理液所含成分浓度分别为C.laurentii浓度为106cells/ml，壳聚糖浓度为0.2％(w/v)，氯化钙1％(w/v)，水杨酸(SA)浓度为20μg/ml，病原菌孢子悬浮液(P.expansum浓度为105spores ml-1)，其余为水。
用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和的深度的伤口，分别在1个对应伤口中加入等量(30μl)的上述处理液；处理完毕后在常温(20～25℃)下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理每重复30个果实，每处理重复3次。实验结果显示的是第6天观测值。结果如表5所示，本发明在使用较高浓度酵母和较低浓度酵母时，对果实青霉病的控制，均比对比例显著有效。
表5生物防腐保鲜剂对梨青霉病的控制的对比实验
| 平均病斑直径(毫米) | 显著性分析 | |
| 处理1对照 | 25.7±0.4 | a |
| 处理2 | 2.6±1.2 | d |
| 处理3(本发明) | 0±0 | e |
| 处理4 | 15.8±2.7 | b |
| 处理5(本发明) | 6.7±1.9 | c |
表中数字为平均数±标准误；不同字母表示经过邓肯多重比较处理之间存在显著性差异(P＝0.05)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种防治果实青霉病的生物防腐保鲜剂，其特征是：所述保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙、水杨酸和水组成，每1L保鲜剂中含有1×109～1×1011个罗伦隐球酵母细胞、0.5～2g的壳聚糖、10～20g的氯化钙和2～20mg的水杨酸，其余为水；所述罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
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