CN102652517B - 柑橘果实生物防腐保鲜方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柑橘果实生物防腐保鲜方法，依次包括以下步骤：1）调节密闭容器内茉莉酸甲酯的浓度为95~105μmol/L，于室温下将柑橘果实放入密闭容器内熏蒸处理22~26小时；2）将步骤1）所得的柑橘果实从密闭容器内取出，然后自然通风；3）将步骤2）所得的通风处理后的柑橘果实放入浓度为1×1010~1×1012细胞/升的罗伦隐球酵母悬浮液中浸泡1～3分钟；取出后自然通风吹干。
Description
技术领域
本发明涉及的是果实采后病害防治技术领域，具体的是一种柑橘果实生物防腐保鲜技术。
背景技术
我国柑橘种植面积2008年已达3046.2万亩，产量2331.3万吨，柑橘种植总面积和总产量居世界第一。我国柑橘的成熟期较为集中，主要在9-12月份，以鲜销为主，旺季时大量柑橘需贮藏保鲜，但柑橘在采后贮藏运输过程中由于真菌侵染造成的病害腐烂严重，导致大量的经济损失。
柑橘采后由真菌引起的病害主要有：指状青霉（Penicillium digitatum）、意大利青霉（Penicillium italicum）、酸腐（Geotrichum Candidum）、蒂腐病（Stem-end rot）等。其中以指状青霉（Penicillium digitatum）引起的柑橘绿霉病是柑橘采后最严重的病害之一。目前市场上控制果实病害主要靠化学杀菌剂，长期使用化学杀菌剂，一些病原菌还进化产生了抗药性菌种，目前允许使用的化学杀菌剂的效果也越来越差，并且杀菌剂在柑橘表面的残留量较大。
柑橘是世界第一大类水果，年贸易额超过65亿美元。目前我国鲜果和以橘片罐头为主的柑橘制品出口量很低，年出口量不到年总产量的5％，远低于世界柑橘出口10％左右的平均值，近年来世界主要柑橘生产大国巴西和美国的种植面积和产量都在逐步萎缩，我国柑橘出口产量仍有很大的上升空间。影响中国柑橘出口的因素较多，其中国际上的检疫壁垒和以农药残留、重金属残留设限的“绿色壁垒”成为制约我国柑橘出口的最主要因素。目前各国对食品安全问题的关注日益提高，对柑橘的检验检疫标准逐渐提高，以及国内柑橘市场产品质量的要求提高，因此迫切需要开发能替代学杀菌剂的果实病害的控制方法和技术。
利用生物或非生物激发子预先处理果蔬产品而诱导果蔬产品对随后贮藏或运输途径中所遭受到的病原菌侵染产生自然抗性免疫反应，通过果蔬产品自身抗病防御系统的活化而有效抵御或杀死病原菌的防治方法近年来引起了人们的极大研究热情，成为采后病害控制研究的热点之一。近十年来，利用微生物进行生物防治取得了突破性的进展，被认为是最有希望的替代化学杀菌剂的方法之一，特别是酵母在果蔬采后病害生物防治的应用研究。但目前单独使用拮抗酵母对病原菌的控制效力与化学杀菌剂相比还存在较大差距，而单独使用非生物激发子诱导果实对病害的控制效力远不如化学杀菌剂，因此如何利用安全有效的方法提高生防酵母的生防效力或通过结合应用安全有效的方法提高对病原菌的拮抗效力，成为研究可替代化学杀菌剂的果实病害有效安全的控制方法和技术的重要热点领域。
罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii）是国内外较广泛研究的应用于果蔬采后生物防治的拮抗微生物菌株。研究结果报道其主要拮抗机理为营养与空间的竞争、诱导果实抗性反应、分泌β-1,3-葡聚糖酶等。Roberts(1990)报道罗伦隐球酵母对苹果采后的灰霉和绿霉病害有抑制效果。刘海波、田世平（2002）报道利用罗伦隐球酵母能够有效抑制葡萄采后的发病率；郑晓冬、张红印（2003）报道罗伦隐球酵母对草莓采后由灰葡萄孢霉引起的灰霉腐烂有较好的抑制效果。Yu T等（2008）报道经几丁质诱导处理后的罗伦隐球酵母可显著提高其对采后梨果由扩展青霉引起青霉病的拮抗效力。Meng XH等（2010）报道采前喷洒罗伦隐球酵母结合采后壳聚糖披膜可显著提高葡萄的抗病性，降低其腐烂率。
中国国家发明专利申请号：200310115336.4（一种生物拮抗菌及其应用）公开了一种生物拮抗菌及其应用，此发明所提供的生物拮抗菌，是罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii(Kuffer.)Skinner)BAY-3CGMCC №1029，能有效防治果蔬采后的主要病害。中国国家发明专利申请号：200910078858.9（葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂）公开了一种葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂。该方法包括将采摘后的葡萄用下述1)或2)的物质进行处理的过程：1)硼酸盐；2)硼酸盐和生物杀菌剂。该硼酸盐的使用浓度可为0.1～1％，该生物杀菌剂的使用浓度可为1×104-1×109CFU罗伦隐球酵母菌(Cryptococcus laurentii)/ml的菌液。中国国家发明专利申请号：200910079774.7（一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法）公开了一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法。此发明的制备隐球酵母属菌胶囊剂的方法，包括如下步骤：将褐藻酸盐溶液、隐球酵母属菌、多价金属阳离子混合，得到隐球酵母属菌胶囊剂。此方法制备得到的隐球酵母属菌胶囊剂中活菌率高，均在70％以上，高的可达90％，而且菌的活性不会下降。中国国家发明专利申请号：201010152108.4（桃果实病害生物防腐保鲜剂及用途和所用罗伦隐球酵母）公开了一种罗伦隐球酵母，保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10。同时公开了一种桃果实病害生物防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙和水组成，还同时公开了利用上述防腐保鲜剂所进行的桃果实保鲜法，能有效延长桃果实的保鲜时间。中国国家发明专利申请号：201010173206.6（果实病害防腐保鲜剂）公开了一种果实病害防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、嘧霉胺和水组成，每1L保鲜剂中含有1×1010～1×1011个罗伦隐球酵母细胞、4～400mg嘧霉胺，其余为水，该果实病害防腐保鲜剂具有防腐效果好的特点。中国国家发明专利申请号：201010202937.9（防治果实青霉病的生物防腐保鲜剂）公开了一种防治果实青霉病的生物防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙、水杨酸和水组成，每1L保鲜剂中含有1×109～1×1011个罗伦隐球酵母细胞、0.5～2g的壳聚糖、10～20g的氯化钙和2～20mg的水杨酸，其余为水。该生物防腐保鲜剂能有效控制果实的青霉病。
茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是一种包含于素馨花（Jasminum grandiforum L.）及迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）精油中的挥发性化合物，其作为一种天然存在的挥发性植物激素普遍存在于各种植物中。MeJA具有多种生理功能，其对植物在病害及逆境下抗性的诱导得到广泛关注。目前研究报道，采用适当浓度的外源MeJA处理果蔬，可诱导提高果蔬的抗性，减少采后果蔬病害腐烂的发生。MeJA作为植物抗性的激发子，其诱导采后果蔬抗病性的机制主要在于诱导果蔬抗性酶活性的提高、诱导次级代谢物质含量的上升以及病程相关蛋白的表达。Droby S 等（1999）发现用MeJA处理葡萄柚后可显著抑制其绿霉病的发生。Yao HJ等（2005）在应用MeJA处理桃果、甜樱桃后可显著抑制其发病腐烂。Peng Jin等(2009)发现经MeJA处理后桃其青霉病、灰霉病及软腐病的发病情况得到显著抑制。中国国家发明专利申请号：201010500108.9（一种枇杷果实热空气和MeJA复合处理保鲜方法）公开了一种枇杷果实热空气和MeJA复合处理保鲜方法，专用于枇杷果实采后贮运过程中冷害的控制和品质的保持，以延长产品的货架期。该技术将挑选预冷后的枇杷果实置于一定体积的密闭容器，在38℃热空气中用15-20μmol/LMeJA熏蒸6小时，该复合处理保鲜方法可显著抑制枇杷果实采后冷害和品质劣变；其技术为“热空气处理和MeJA处理” 两者的结合处理，其主要目的在于减少枇杷果实冷害的症状。
中国国家发明专利申请号：200810220332.5（茉莉酸甲酯在蔬菜保鲜方面的应用以及浸种溶液）公开了茉莉酸甲酯在蔬菜保鲜方面的应用以及浸种溶液。茉莉酸甲酯可应用于蔬菜种子播种前进行浸种处理；同时提供了一种蔬菜保鲜浸种溶液，为茉莉酸甲酯的水溶液，茉莉酸甲酯的浓度为0.001μmol.L-1～1000μmol.L-1。此发明用很低浓度的茉莉酸甲酯水溶液浸泡菜心种子，并用这样的种子播种生产菜心，就可以达到提高菜心可溶性固形物和维生素C含量、提高菜心新鲜度、减轻采后菜心发病腐烂率、延长菜心保鲜寿命的目的。中国国家发明专利申请号：201010113769.6（通过茉莉酸甲酯处理提高青蒿中青蒿素含量的方法）公开了一种通过茉莉酸甲酯处理提高青蒿中青蒿素含量的方法。中国国家发明专利申请号：201010505970.9（利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法）公开了一种利用茉莉酸甲酯诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，能大幅缩短雨生红球藻细胞完全变红的时间，并显著增加虾青素产量，从而大大提高雨生红球藻生产虾青素的效率。
参考文献具体如下：
1、 Roberts, R.G. Postharvest biological control ofgray mold of apples by Cryptococcus laurentii.Phytopathology，1990，80： 526-530（罗伯茨，R.G.应用罗伦隐球酵母对采后苹果灰霉病的生物防治，植物病理学，1990，80：526-530）。
2、刘海波, 田世平, 秦国政, 徐勇. 罗伦隐球酵母对葡萄采后病害的拮抗效果，中国农业科学 , 2002,(07)。
3、郑晓冬, 张红印, 席玙芳.. 农业工程学报 , 2003,(05)。
4、 Yu T, Wang LP, Yin Y, et al. Effect of chitinon the antagonistic activity of Cryptococcus laurentii against Penicillium expansum in pear fruit. INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY ,2008,122,(1-2):44-48(余、王、殷等，甲壳素对罗伦隐球酵母拮抗梨果实上扩展青霉的效力影响，国际食品微生物杂志，2008,122,(1-2) :44-48)。
5、Meng XH, Qin GZ, Tian SP. Influences of preharvest spraying Cryptococcus laurentii combined with postharvest chitosan coating on postharvest diseases and quality of table grapes in storage. LWT-FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY，2010,43（4）：596-601(孟、秦、田等，采前喷洒罗伦隐球酵母结合采后壳聚糖涂膜处理对鲜食葡萄采后病害及品质的影响，LWT-食品科学与技术，2010,43（4）：596-601)。
6、 Droby S, Porat R, Cohen L, Weiss B, Shapio B,Philosoph-Hadas S, et al, Suppressing green mold decay in grapefruit with postharvest jasmonate application. AmSocHort Sci, 1999,124:184–188.（爵劳比等，采后应用茉莉酸抑制柚子绿霉腐烂，美国社会园艺学，1999,124:184–188.）。
7、Peng Jin,Yonghua Zheng,Shuangshuang Tang, et al, Enhancing disease resistance in peach fruit with methyljasmonate. Journal of the science of food and agriculture,2009,89:802-808（金、郑等，应用茉莉酸甲酯处理提高桃果实抗病性，食品与农业科学，2009,89:802-808）。
8、Yao HJ and Tian SP, Effects of a biocontrol agent and methyl jasmonate on postharvestdisease of peach fruit and the possible mechanism involved. Appl Microbiol, 2005,98:941–950（姚、田，生防菌和茉莉酸甲酯对采后桃果实病害的影响及其可能机制，应用微生物学，2005,98:941–950）。
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于拮抗酵母和天然的植物抗性激发子结合施用的柑橘果实生物防腐保鲜方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种柑橘果实生物防腐保鲜方法，依次包括以下步骤：
1）、调节密闭容器内茉莉酸甲酯的浓度为95~105μmol/L，于室温下将柑橘果实放入密闭容器内熏蒸处理22~26小时；
2）、将步骤1）所得的柑橘果实从密闭容器内取出，然后自然通风；
3）、将步骤2）所得的通风处理后的柑橘果实放入浓度为1×1010~1×1012细胞/升的罗伦隐球酵母悬浮液中浸泡1～3分钟；取出后自然通风吹干。
作为本发明的柑橘果实生物防腐保鲜方法的改进：所述步骤1）将柑橘果实放入密闭容器内时，需保证密闭容器内的空气体积为密闭容器容量的50%~75%。
作为本发明的柑橘果实生物防腐保鲜方法的进一步改进：罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii ）ZJU10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。
作为本发明的柑橘果实生物防腐保鲜方法的进一步改进：步骤1）中调节密闭容器内茉莉酸甲酯的浓度为100μmol/L（熏蒸处理24小时为最佳）；所述步骤3）中罗伦隐球酵母悬浮液的浓度为1×1011细胞/升。
采用本发明方法处理后的柑橘果实可按照常规方式在常温或低温下贮藏。
在本发明的步骤1）中，可将茉莉酸甲酯（MeJA）试剂滴于滤纸或干燥的脱脂棉上，从而使密闭容器内茉莉酸甲酯的浓度达到所需浓度。
步骤1）将柑橘果实放入密闭容器内时，需保证密闭容器内的空气体积为密闭容器容量的50%~75%（较佳为70%），即，柑橘果实的体积一般占密闭容器容量的25~50%，这样能保证密闭容器的含氧量约占密闭容器容量的10.5%-15.75%。
步骤2）的自然通风时间一般为1~2小时。步骤3）的自然通风吹干时间为1~2小时。
本发明所用的罗伦隐球酵母悬浮液是指经过菌种活化后制备而成。活化后的菌体在3000rpm条件下离心分离10min，用无菌蒸馏水洗2次，去除培养基质；用无菌蒸馏水悬浮罗伦隐球酵母细胞，用血球计数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到所需的浓度。
本发明的柑橘果实生物防腐保鲜方法只有在保证茉莉酸甲酯熏蒸浓度、柑橘果实呼吸所需氧含量和确保酵母活性的基础上才能发挥最佳防腐效应，通过复合处理增效，能显著提高对柑橘果实病害的控制效果。
需要特别说明的是：虽然已有论文报道利用茉莉酸甲酯对枇杷果实在常温下进行熏蒸处理，其熏蒸处理浓度为10μmol/L，对桃果实熏蒸处理浓度为1μmol/L，0.1μl/L茉莉酸甲酯熏蒸处理鲜切小苍兰花花瓣。但是由于不同果实对茉莉酸甲酯的最佳响应浓度是不同的，且果实的熏蒸处理效果并非浓度越高越好。因此在发明过程中，首先需要找到柑橘果实对应的合适的处理浓度。本发明通过大量试验找到了对于柑橘果实合适的处理浓度为100μmol/L。现有技术均没有考虑熏蒸处理时含氧量的要求，而发明人在发明过程中发现：由于果实采后仍进行呼吸作用，若密闭容器中含氧量过低会加速果实衰老，引起病害，因此本发明在处理过程中注意了容器中的空气含量，其空气体积为容器的50%-75%，其含氧量约为容器体积的10.5%-15.75%。
本发明的优势还在于：利用在室温下进行茉莉酸甲酯熏蒸处理，能减少对果实处理条件控制的难度及对处理设备的要求，操作简单；同时结合罗伦隐球酵母，成功使两种主要的抗菌防病原理不同的处理方式结合，显著抑制了果实的腐烂率，且抑制效果显著好于两者的单一处理；本发明对采收成熟度及成熟度较高的果实均有较好的防腐效果。
综上所述，本发明提供的结合施用的生物防腐保鲜剂有效整合了茉莉酸甲酯对柑橘果实抗性的诱导效应和生防酵母的抑菌活性，从而有效抑制了柑橘果实病害的发生和发展。本方法简易了茉莉酸甲酯试剂的施用方式，简化了结合施用的生物防腐保鲜剂的操作方法。本发明具有安全高效、环境友好、果实防治病害、防腐保鲜效果显著的优点。该方法的使用有利于逐步替代化学杀菌剂为主的果实真菌病害的防治方法。对保证食品安全、环境保护、农民增收、果实出口创汇等具有重要意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是实验1中不同空气含量（氧含量）及MeJA处理浓度对柑橘果实绿霉病发病率的控制效果对比图。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施案例。
选用本地早、椪柑果实。茉莉酸甲酯购自美国Sigma-Aldrich公司。
罗伦隐球酵母悬浮液的配制过程如下：
以下所用的NYDA培养基为：牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20g，水定容1000ml，高压（0.1MPa,121℃,30分钟）灭菌。所用的NYDB液体培养基为：牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，水定容1000ml，高压（0.1MPa,121℃,30分钟）灭菌。
罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在低温（4℃）下保存在NYDA培养基中。培养程序依次为：
⑴、活化：罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590先在NYDA培养基中28℃培养48h，然后重复传代培养2次（每次均为在NYDA培养基中28℃培养48h）；
⑵、液体培养：将上述重复传代2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYDB液体培养基中，于200rpm、28℃下培养24h，然后在相同条件下重复培养1次（即将NYDB液体培养基中培养所得的酵母用无菌移液器接种到NYDB液体培养基中于200rpm、28℃下培养24h）；
⑶、离心分离：将步骤⑵所得的培养所得物于3000rpm条件下离心分离10min，用无菌蒸馏水洗2次，去除培养基质；
⑷、酵母细胞悬浮和确定浓度：用无菌蒸馏水悬浮罗伦隐球酵母细胞，用血球计数板确定酵母细胞的浓度，并用无菌蒸馏水调整到所需的浓度，使最终每L罗伦隐球酵母悬浮液中含有1×1010~1×1012个罗伦隐球酵母细胞。
实施例1、一种柑橘果实生物防腐保鲜方法，柑橘果实为椪柑柑橘果实，依次进行以下步骤：
1）、调节密闭容器内茉莉酸甲酯（MeJA）的浓度为100μmol/L，于室温下将柑橘果实放入所述密闭容器内熏蒸处理24小时；柑橘果实的体积占密闭容器容量的30%，即，密闭容器内的空气体积为密闭容器容量的70%，此时密闭容器内的含氧量约为密闭容器容量的12.8%（体积比）；
2）、将步骤1）所得的柑橘果实从密闭容器内取出，然后自然通风1~2小时；
3）、将步骤2）所得的通风处理后的柑橘果实放入浓度为1×108个细胞/毫升的罗伦隐球酵母悬浮液中浸泡1～3分钟；取出后自然通风吹干（1~2小时）。最后将柑橘果实放入薄膜保鲜袋装箱贮藏。
实施例2、一种柑橘果实生物防腐保鲜方法，柑橘果实为椪柑柑橘果实，依次进行以下步骤：
1）、调节密闭容器内茉莉酸甲酯（MeJA）的浓度为100μmol/L，于室温下将柑橘果实放入所述密闭容器内熏蒸处理24小时；柑橘果实的体积占密闭容器容量的70%，即，密闭容器内的空气体积为密闭容器容量的30%，此时密闭容器内的含氧量约为密闭容器容量的5%（体积比）；
步骤2）~步骤3）同实施例1。
实验1、保鲜效果评价：
分别设置以下处理进行对比：
处理1（即空白对照）：为未经茉莉酸甲酯熏蒸处理和罗伦隐球酵母悬浮液中浸泡处理的椪柑柑橘果实。
处理2（实施例1）：按照本发明的实施例1进行处理的椪柑柑橘果实。
处理3（实施例2）：按照本发明的实施例2进行处理的椪柑柑橘果实。
处理4（对比组1）：将实施例1的步骤1）中茉莉酸甲酯（MeJA）的浓度改为150μmol/L，其余均同实施例1；按此方式处理而得的椪柑柑橘果实。
处理5（对比组2）：将实施例1的步骤1）中茉莉酸甲酯（MeJA）的浓度改为50μmol/L，其余均同实施例1；按此方式处理而得的椪柑柑橘果实。
备注：上述处理1~处理5中的椪柑柑橘果实均为：无机械损伤、未感染、大小和成熟度基本一致，用自来水冲洗后室温下放干至果实表面无水滴的椪柑柑橘果实。
用消过毒的打孔器在上述每个处理后柑橘果实皮层表面打出孔径大小、深度同一的伤口（可加30～50μL液体），果实伤口处加入同体积的无菌水，孔风干后加入20μL、浓度为1×104个孢子/毫升的指状青霉（Penicillium digitatum）孢子悬浮液。柑橘果实处理完毕后用PE塑料膜密封保湿处理，于常温（25℃）贮藏。每天定时对果实发病情况进行观察和统计，结果以平均病害发生率（%）表示。每处理重复4次，每个重复12个果实，整个试验重复2次以上。
以下结果为处理后第3~5天检测所得，对椪柑柑橘果实绿霉病的控制效果如表1所示，具体比较分析见图1。
表1对椪柑柑橘果实绿霉病的控制效果对比
实验2、将实验1中的处理1~处理5中的椪柑柑橘果实改成本地早柑橘果实，其余同实验1。
备注：上述处理1~处理5中的本地早柑橘果实均为：无机械损伤、未感染、大小和成熟度基本一致，用自来水冲洗后室温下放干至果实表面无水滴的本地早柑橘果实。
以下结果为处理后第3~4天检测所得，对本地早柑橘果实绿霉病的控制效果如表2所示。
表2、对本地早柑橘果实绿霉病的控制效果
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.柑橘果实生物防腐保鲜方法，其特征是依次包括以下步骤：
1）、调节密闭容器内茉莉酸甲酯的浓度为95~105μmol/L，于室温下将柑橘果实放入所述密闭容器内熏蒸处理22~26小时；
将柑橘果实放入密闭容器内时，需保证密闭容器内的空气体积为密闭容器容量的50%~75%；
2）、将步骤1）所得的柑橘果实从密闭容器内取出，然后自然通风；
3）、将步骤2）所得的通风处理后的柑橘果实放入浓度为1×1010~1×1012细胞/升的罗伦隐球酵母悬浮液中浸泡1～3分钟；取出后自然通风吹干。
2.根据权利要求1所述的柑橘果实生物防腐保鲜方法，其特征是：所述罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii ）ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。
3.根据权利要求2所述的柑橘果实生物防腐保鲜方法，其特征是：所述步骤1）中调节密闭容器内茉莉酸甲酯的浓度为100μmol/L；所述步骤3）中罗伦隐球酵母悬浮液的浓度为1×1011细胞/升。
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