CN103468627B

CN103468627B - 提高生防酵母对果实病害防治效力的方法

Info

Publication number: CN103468627B
Application number: CN201310127327.0A
Authority: CN
Inventors: 余挺; 曾丽珍; 郑晓冬; 余辰; 卢黄娉; 朱瑞瑜; 杨林
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-04-11
Also published as: CN103468627A

Abstract

本发明涉及果实采后病害防治技术领域，本发明公开了一种提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，包括将生防酵母菌进行活化，然后将活化后的生防酵母菌进行液体培养；活化中所用的活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、琼脂20g、β-葡聚糖1~10g，水定容至1000 ml，灭菌后得活化培养基；活化中所用的种子培养基以及液体培养中所用的种子培养基均为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、β-葡聚糖1~10g，水定容至1000 ml，灭菌后得种子培养基。采用本发明所提供的培养基能诱导提高生防酵母（罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590）对果实病害防治效力。

Description

提高生防酵母对果实病害防治效力的方法

技术领域

本发明涉及的是果实采后病害防治技术领域，特别涉及提高生防酵母对果实病害防治效力的方法。

背景技术

传统上，国内外对果实采后病害的控制主要依赖于杀菌剂。但是，随着人们对食品安全和环境保护意识的不断增强，化学杀菌剂的使用范围和剂量受到了越来越严格的限制。在欧美发达国家，许多高效但存在食品安全和环境污染隐患的化学杀菌剂被禁止使用。因此，研究、开发能替代化学杀菌剂的方法和技术具有重大的社会意义和广阔的应用前景。

在众多被研究的可能替代化学杀菌剂的方法中，利用拮抗微生物，特别是拮抗酵母抑制采后果实病害的生物防治技术是当前国内外最为关注的新型采后病害控制方法之一。这主要是由于酵母具有遗传稳定、抑菌谱广、效价高、一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物、安全性高等特点；且其对营养要求低，生长快；并有对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，并能与多种其它化学和物理处理相容等优良特性。

但目前国内外已报道，甚至已商业化开发的拮抗酵母对果实病害的控制效力与化学杀菌剂相比还存在差距。而且由于国内外研究的果实病害生防酵母均为非模式酵母，其遗传背景信息大多不明确，对其生防生理代谢的研究也尚少，严重限制了定向提高果实生防酵母活性技术的发展。

专利号201010173206.6的发明《果实病害防腐保鲜剂》中公开了一种罗伦隐球酵母，其保藏名称为：罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）ZJU10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。该罗伦隐球酵母以下简称罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，采用本发明中所提供的培养基能诱导提高生防酵母（罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590）对果实病害防治效力。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，包括将生防酵母菌进行活化，然后将活化后的生防酵母菌进行液体培养；

活化中所用的活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、琼脂20g、β-葡聚糖1～10g，水定容至1000ml，灭菌后得活化培养基；

活化中所用的种子培养基以及液体培养中所用的种子培养基均为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、β-葡聚糖1～10g，水定容至1000ml，灭菌后得种子培养基。

作为本发明的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法的改进：

生防酵母菌为罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）菌株ZJU10，其保藏号为：CGMCCNO.3590。

作为本发明的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法的进一步改进：

活化培养基中β-葡聚糖为1～5g；种子培养基中β-葡聚糖为1～5g。最佳为：活化培养基中β-葡聚糖为5g；种子培养基中β-葡聚糖为5g。

作为本发明的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法的进一步改进：液体培养的时间为24小时。

作为本发明的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法的进一步改进：生防酵母的使用浓度为10⁸个细胞/升～10¹⁰个细胞/升。

本发明利用β-葡聚糖作为拮抗酵母活性激发子，从而来诱导培养生防酵母获得对果实病害控制更高活性的方法。利用本发明的培养基对生防酵母，特别是罗伦隐球酵母CGMCCNO.3590进行培养，所得酵母细胞具有更好的对果实进行防腐保鲜的效果。本发明所得的浓度为10⁸个细胞/升～10¹⁰个细胞/升的悬浮酵母细胞能作为果实生物保鲜剂，将上述果实生物保鲜剂对采前果实进行表面喷洒（果实表面润湿即可）或采后浸泡1～5分钟的方法，可防治果实的青霉病；果实包括苹果、梨和桃等等。

综上所述，本发明所提供的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，能有效激发生防酵母的活性，具有促进生防酵母在果实内生长繁殖，增强抑菌物质分泌和病原菌水解酶活性等作用，从而显著抑制果实（苹果、梨和桃等）病害的发生和发展。本发明具有安全高效、环境友好，病害防治效果突出等优点。本发明的使用有利于转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对确保食品安全，环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要意义。即，本发明所提供的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，能显著提高生防酵母的拮抗活性，具有重要的理论意义和实用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为不同β-葡聚糖浓度诱导培养所得的罗伦隐球酵母对抑制梨果实青霉病发病率的影响对比图；

图1中：

□代表空白对照；

■代表使用对比例1（β-葡聚糖为0g）所述方法制备而得的C.laurentii；

○代表使用实施例3（β-葡聚糖为1g）所述方法制备而得的C.laurentii；

●代表使用实施例4（β-葡聚糖为2g）所述方法制备而得的C.laurentii；

◆代表使用实施例1（β-葡聚糖为5g）所述方法制备而得的C.laurentii；

△代表使用实施例2（β-葡聚糖为10g）所述方法制备而得的C.laurentii；

图2为不同β-葡聚糖浓度诱导培养所得的罗伦隐球酵母对抑制柑橘果实青霉病发病率的影响对比图；

图3为不同β-葡聚糖浓度诱导培养所得的罗伦隐球酵母对抑制柑橘果实青霉病病斑直径的影响对比图；

图4为本发明（使用β-葡聚糖）诱导培养所得的罗伦隐球酵母在不同浓度下抑制梨果实青霉病的影响对比图；

图4中：

□代表空白对照；

△代表使用对比例1所得的C.laurentii悬浮液（浓度为1×10⁸个细胞/升）；

▲代表使用实施例1所得的C.laurentii悬浮液（浓度为1×10⁸个细胞/升）；

○代表使用对比例1所得的C.laurentii悬浮液（浓度为1×10⁹个细胞/升）；

●代表使用实施例1所得的C.laurentii悬浮液（浓度为1×10⁹个细胞/升）；

◇代表使用对比例1所得的C.laurentii悬浮液（浓度为1×10¹⁰个细胞/升）；

◆代表使用实施例1所得的C.laurentii悬浮液（浓度为1×10¹⁰个细胞/升）；

图5为本发明（使用β-葡聚糖）在不同的诱导培养时间下所得的罗伦隐球酵母控制梨果实青霉病发病率的影响对比图；

图6为本发明（使用β-葡聚糖）在不同的诱导培养时间下所得的罗伦隐球酵母控制梨果实青霉病病斑直径的影响对比图。

图5和图6中：

每组从左至右依次是：

空白对照；

按照对比例1的方式，液体培养时间为24小时；

按照对比例1的方式，液体培养时间改成36小时；

按照对比例1的方式，液体培养时间改成48小时；

按照实施例1的方式，液体培养时间为24小时；

按照实施例1的方式，液体培养时间改成36小时；

按照实施例1的方式，液体培养时间改成48小时。

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施例。

实施例1、提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，依次进行以下步骤：

一、培养基的配置：

活化培养基：将牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、琼脂20g和β-葡聚糖5g，用水定容至1000ml，灭菌（121℃，1.1个大气压，30分钟）后得活化培养基；

种子培养基：将牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g和β-葡聚糖5g，用水定容至1000ml，灭菌（121℃，1.1个大气压，30分钟）后得种子培养基。

二、菌种活化和制备：

1）、活化：

①、选用于低温（4）℃下保存在活化培养基中的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590。

将上述罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在活化培养基中28℃培养48小时，然后在相同条件下重复传代培养2次（每次均为在活化培养基基中28℃培养48小时）；

②、将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到种子培养基中，于200rpm、28℃的条件下培养24小时。

然后在上述相同条件下重复培养1次，即将种子培养基中培养而得的酵母再次用接种环接到种子培养基中，于200rpm、28℃条件下培养24小时。

2）、液体培养：

将步骤1）活化所得的酵母按照5%重量比的接种量接到种子培养基中（即酵母与种子培养基的重量比为5%），于200rpm、28℃的条件下培养24小时。

3）、离心分离：

将步骤2）液体培养后的所得物在3000rpm条件下离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；

4）、悬浮和确定浓度：

用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到浓度为1×10⁸个细胞/升～1×10¹⁰个细胞/升；得C.laurentii悬浮液。

实施例2、仅将活化培养基和种子培养基作如下更改，其余同实施例1；

将活化培养基中的β-葡聚糖由5g改成10g，其余同实施例1中的活化培养基；

将种子培养基中的β-葡聚糖由5g改成10g，其余同实施例1中的种子培养基。

实施例3、仅将活化培养基和种子培养基作如下更改，其余同实施例1；

将活化培养基中的β-葡聚糖由5g改成1g，其余同实施例1中的活化培养基；

将种子培养基中的β-葡聚糖由5g改成1g，其余同实施例1中的种子培养基。

实施例4、仅将活化培养基和种子培养基作如下更改，其余同实施例1；

将活化培养基中的β-葡聚糖由5g改成2g，其余同实施例1中的活化培养基；

将种子培养基中的β-葡聚糖由5g改成2g，其余同实施例1中的种子培养基。

对比例1、仅将活化培养基和种子培养基作如下更改，其余同实施例1；

取消活化培养基中的5gβ-葡聚糖的使用，其余同实施例1中的活化培养基；

取消种子培养基中的5gβ-葡聚糖的使用，其余同实施例1中的种子培养基。

实验1、对上述实施例1～实施例4以及对比例1所得的C.laurentii悬浮液作为试剂分别进行以下实验（浓度均为1×10⁸个细胞/升）：

以相同品种及成熟度的梨果实作为实验对象，用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。

先加入30μl试剂，加入试剂2小时后在每个伤口加入等量（30μl）的P.expansum孢子悬浮液（浓度为1×10⁴spores/ml）。处理完毕后在常温下（20-25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每天定时对果实伤口处病害发生和发展情况进行观察和记录，结果以平均病害发生率（%）表示。每处理重复3次，每个重复24个果实。

结果如图1所述。

β-葡聚糖为5g时的效果远远高于β-葡聚糖为0g、1g、2g时的效果，且β-葡聚糖为5g时的效果与β-葡聚糖为10g的效果非常接近，说明：实施例1相对于实施例2具有使用效果基本一致的前提下能降低生产成本的优势。

实验2、将实验1中的果实由梨改成柑橘，其余同实验1。第5天时的发病率如图2所示，病斑直径如图3所示。实验结论同实验1。

实验3、将实施例1和对比例1所得的C.laurentii悬浮液按照不同的浓度，如同实验1进行检测，病斑直径的检测结果的对比如图4所示。

实验4、分别选用以下方式所得的C.laurentii悬浮液：

按照对比例1的方式，液体培养时间为24小时；

按照对比例1的方式，液体培养时间改成36小时；

按照对比例1的方式，液体培养时间改成48小时；

按照实施例1的方式，液体培养时间为24小时；

按照实施例1的方式，液体培养时间改成36小时；

按照实施例1的方式，液体培养时间改成48小时；

按照实验1的方法对苹果进行检测，所得的结果如图5和图6所示。经过0.5%浓度β-葡聚糖诱导培养24小时的罗伦隐球酵母，其与普通培养的罗伦隐球酵母相比，对苹果果实青霉病病害控制效力的提升最为显著；其次为48小时，而36小时诱导培养对罗伦生防酵母效力的提升不明显。

对比实验1、

将实施例1中的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590改成粘红酵母CGMCC NO.3591，将对比例1中的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590改成粘红酵母CGMCC NO.3591，所得的悬浮液作为试剂（浓度均为1×10⁸个细胞/升）分别如同实验1进行检测。

所得结果如下表1和表2所示：

表1、粘红酵母经过添加β-葡聚糖后对梨果实青霉病的抑制（发病率，%）

表2、粘红酵母经过添加β-葡聚糖后对梨果实青霉病的抑制（病斑直径，毫米）

备注说明：所用粘红酵母的保藏名称为：粘红酵母（Rhodotorula glutinis）ZJU11，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3591；。

对比实验2、

将实施例1中的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590改成红冬孢酵母IMI394084，将对比例1中的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590改成红冬孢酵母IMI394084，所得的悬浮液作为试剂（浓度均为1×10⁸个细胞/升）分别如同实验1进行检测。

所得结果如下表3和表4所示：

表3、红冬孢酵母经过添加β-葡聚糖后对梨果实青霉病的抑制（发病率，%）

表4、红冬孢酵母经过添加β-葡聚糖后对梨果实青霉病的抑制（病斑直径，毫米）

备注说明：红冬孢酵母的保藏名称为：红冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenum Fell &Tallman IMI394084〕，保藏单位：英国国际真菌研究所（IMI）国际农业与生物中心(CABI)基因资源保藏中心（Genetic Resource Collection），保藏日期：2006年11月1日，保藏号：IMI394084。保藏地址：国际农业与生物中心（CABI）英国中心（UK Centre），贝克汉母路（BakehamLane），艾格镇（Egham），萨里郡（Surrey），TW209TY（邮编），英国（UK）。

对比实验3、

将实施例1中的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590改成酿酒酵母，将对比例1中的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590改成酿酒酵母，所得的悬浮液作为试剂（浓度均为1×10⁸个细胞/升）分别如同实验1进行检测。

所得结果如下表5和表6所示：

表5、酿酒酵母经过添加β-葡聚糖后对梨果实青霉病的抑制（发病率，%）

表6、酿酒酵母经过添加β-葡聚糖后对梨果实青霉病的抑制（病斑直径，毫米）

备注说明：所用酿酒酵母为普通面包酵母。

综上所述，经过β-葡聚糖培养后的罗伦隐球酵母对果实青霉病的生防大幅度提高。而通过β-葡聚糖培养，并不能有效提高粘红酵母、红冬孢酵母和普通酿酒酵母对果实青霉病的控制效力。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，包括将生防酵母菌进行活化，然后将活化后的生防酵母菌进行液体培养；其特征是：

活化中所用的种子培养基以及液体培养中所用的种子培养基均为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、β-葡聚糖1～10g，水定容至1000ml，灭菌后得种子培养基；

所述生防酵母菌为罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)菌株ZJU 10，其保藏号为：CGMCC NO.3590。

2.根据权利要求1所述的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，其特征是：所述活化培养基中β-葡聚糖为1～5g；所述种子培养基中β-葡聚糖为1～5g。

3.根据权利要求2所述的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，其特征是：所述活化培养基中β-葡聚糖为5g；所述种子培养基中β-葡聚糖为5g。

4.根据权利要求2或3所述的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，其特征是：所述液体培养的时间为24小时。

5.根据权利要求4所述的提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，其特征是：所述生防酵母的使用浓度为10⁸个细胞/升～10¹⁰个细胞/升。