CN102061269A - 提高海洋酵母对果实病害防治效力的培养法及所用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体诱导培养基其由以下含量的成分组成：牛肉膏6～8g/L，酵母粉4～5g/L，葡萄糖8～10g/L，几丁质1～20g/L，余量为水。本发明还同时公开了利用上述液体诱导培养基进行的提高海洋酵母对果实采后病害防治效力的培养方法，选用海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman IMI 394084作为酵母菌，包括以下步骤：1)固体活化；2)液体活化；3)液体诱导培养；4)收集菌体及浓度确定：用无菌水悬浮酵母细胞，得浓度为10⁶～10⁹cells/ml的酵母细胞悬浮液。该酵母细胞悬浮液能防治多种果实的多种采后病害。

Description

提高海洋酵母对果实病害防治效力的培养法及所用培养基

技术领域

本发明涉及一种提高海洋生防酵母对果实采后病害防治效力的培养方法，属于果实采后病害防治技术领域。

背景技术

我国是世界第一水果生产大国。然而，我国水果采后损失十分严重。据保守估计，据保守估计，我国水果采后损失为20-25％，每年由此造成的经济损失达到数百亿元人民币。由真菌病害引起的果实采后的腐烂变质是导致水果大量损失的主要原因之一。目前，化学杀菌剂是控制水果采后腐烂最主要和最有效的方法。但是，随着人们对食品安全的关注和环保意识的增强，化学杀菌剂的使用范围越来越受到限制。

利用安全且有拮抗病原菌活性的微生物进行生物防治的方法近10年来已经取得了突破性的进展，被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一(Droby et al.，2009；Janisiewiczand Korsten，2002)。其中拮抗酵母由于具有遗传稳定、抑菌谱广、效价高、不产生抗生素、对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力等优点而成为研究的热点。

但是目前研究的采后拮抗酵母，包括已经商业化的产品对病原菌的控制效力与化学杀菌剂相比还存在较大的差距，其效力受到病原菌浓度、果实成熟衰老生理状态等因素的影响，且一般都不能有效的控制处于潜伏状态的病原菌，这些缺陷给采后拮抗酵母的大规模商业化应用带来了诸多限制(Droby et al.，2009)，因此迫切需要通过安全有效的方法提高采后拮抗酵母的生物防治效力。

目前国内外提高采后拮抗酵母效力的研究主要集中在整合控制上(Droby et al.，2009；Janisiewicz and Korsten，2002；Sharma et al.，2009)，近年来，随着拮抗菌和病原菌之间的细胞学、生物化学和分子生物学研究的不断深入发展，研究者发现通过调节采后拮抗酵母的生理代谢机制可能是增强其拮抗能力的有效途径之一(Janisiewicz and Korsten，2002)。

几丁质(chitin)，又称甲壳素，广泛分布于虾蟹壳、软体动物的外壳与内骨骼，节肢动物的外骨骼及真菌、酵母菌等微生物细胞壁中。几丁质资源丰富，成本低廉，具有多种重要的生物学特性，而且已经被美国EPA和FDA批准作为生物防腐剂和食品添加剂使用。因此几丁质的开发利用深受国内外的关注。

海洋酵母是生活在海水中酵母的通称，是酵母家族的一个生态类群，广泛分布于各种自然海域中。其生物学性质和细胞的组成成分与陆生酵母基本相同。但是，海洋酵母具有较强的耐低温、耐高渗透压等特性，可以在低温下长期贮存，这些特性是一般陆地或果实表面微生物所不具备的，因此开发海洋酵母作为生物保鲜剂的菌种资源，非常具有市场潜力。

目前已知的一种海洋酵母(Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman)被保藏于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心(International Mycological Institute，CABI Genetic Resource Collection)，保藏地址：英国TW209TY萨里郡艾格镇贝克汉姆路国际农业与生物中心英国中心，保藏日期：2006.4.19，保藏编号：IMI 394084。

上述海洋酵母是一株兼性海洋酵母，它能显著抑制番茄、冬枣等多种果实的采后病害(Wang et al.，2009；Wang et al.，2008)，其细胞悬浮液已被用于生产生物保鲜剂，该专利的申请号为200610155209.0。

中国发明专利(专利号03135134.4，一种防治植物寄生线虫的生防制剂)显示与含有几丁质等成分的物质混合后，能提高中华轮枝菌对防治植物寄生线虫的效果。中国发明专利(专利号：ZL200410075042.8，海洋小单孢菌抗菌活性物质发酵促进剂)将几丁质作为用于海洋小单孢菌(一种放线菌)抗菌活性物质发酵促进剂，可提高对枯草芽孢杆菌和念珠菌的抗菌效价。中国发明专利(专利号200510039128.X，一种抗灰霉病的生物杀菌剂及其制备方法)通过含几丁质等培养基培养木霉菌，可防治植物的灰霉病。此外，中国国家发明申请号：200710057189.8(一种利用表面活性剂提高绿色木霉生防活性的方法)公开了一种利用表面活性剂提高绿色木霉生防活性的方法。该方法在绿色木霉孢子培养后，与含有几丁质等物质混和，可以提高对蔬菜灰霉病、白粉病等的防治效果，提高绿色木霉在植株的定殖能力。中国国家发明申请号：200710300087.4(一种防治烟草黑胫病的菌株及其菌剂)公开了一种以0.8～2.0％胶体几丁质为碳源培养淡紫拟青霉的方法，通过该方法可提高其对烟草黑胫病的防治能力。

以公开的文章Yu Ting(余挺)，Wang Lianping，Yin Yun，Wang Yixi，Zheng Xiaodong.2008.Effect of chitin on the antagonistic activity of Cryptococcus laurentii against Penicilliumexpansum in pear fruit.International Journal of Food Microbiology 122：44-48.(SCI收录)告知了几丁质能提高罗伦隐球酵母的微生物活性。

参考文献：

Droby，S.，Wisniewski，M.，Macarisin，D.，Wilson，C.，2009.Twenty years of postharvestbiocontrol research：Is it time for a new paradigm？Postharvest Biology and Technology 52，137-145.(爵劳比等.，2009.20年采后生物防治研究：采后生物学和技术52，137-145.)

Janisiewicz，W.J.，Korsten，L.，2002.Biological control of postharvest diseases of fruits.Annual Review of Phytopathology 40，411-441.(杰尼斯维茨等.，2002.水果采后病害生物防治.植物生理学年度综述40，411-441.)

Sharma，R.R.，Singh，D.，Singh，R.，2009.Biological control of postharvest diseases offruits and vegetables by microbial antagonists：A review.Biological Control 50，205-221.(夏马尔等.，拮抗微生物对果蔬采后病害生物防治研究综述.生物防治50，205-221.)

Wang，Y.，Yu，T.，Li，Y.，Cai，D.，Liu，X.，Lu，H.，Zheng，X.D.，2009.Postharvest biocontrolof Alternaria alternata in Chinese winter jujube by Rhodosporidium paludigenum.Journal ofApplied Microbiology 107，1492-1498.(王一非等.，2009.Rhodosporidium paludigenum对冬枣链格孢病害采后生物防治研究.应用微生物107，1492-1498.)

Wang，Y.F.，Bao，Y.H.，Shen，D.H.，Feng，W.，Yu，T.，Zhang，J.，Zheng，X.D.，2008.Biocontrol of Alternaria alternata on cherry tomato fruit by use of marine yeast Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman.International Journal of Food Microbiology 123，234-239.(王一非等.，2008.海洋酵母Rhodosporidium paludigenum对樱桃番茄链格孢病害生物防治研究.国际食品微生物123，234-239.)

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高海洋生防酵母对果实采后病害防治效力的培养方法及所用液体诱导培养基。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种液体诱导培养基，该培养基由以下含量的成分组成：

牛肉膏    6～8g/L，

酵母粉    4～5g/L，

葡萄糖    8～10g/L，

几丁质    1～20g/L，

余量为水。

作为本发明的液体诱导培养基的改进：几丁质为10g/L。

本发明还同时提供了利用上述液体诱导培养基进行的提高海洋酵母对果实采后病害防治效力的培养方法，选用海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman IMI394084作为酵母菌，依次包括以下步骤：

1)、固体活化：

把斜面保存的酵母菌接种到灭菌NYDA斜面培养基中，于25～28℃下培养48～72小时，相同条件下重复传代培养共两次；NYDA斜面培养基组成为：牛肉膏6～8g/L，酵母粉4～5g/L，葡萄糖8～10g/L和琼脂15～20g/L，余量为水；

2)液体活化：

将步骤1)所得的固体活化好的酵母菌接种到灭菌NYDB液体培养基中，于25～28℃、150～200rpm条件下培养18～30小时；NYDB液体培养基组成为：牛肉膏6～8g/L，酵母粉4～5g/L和葡萄糖8～10g/L，余量为水；

3)液体诱导培养：

将步骤2)所得的液体活化好的酵母菌按重量比为2％～5％接种量接种到灭菌后的液体诱导培养基中，于25～28℃、150～200rpm条件下培养18～30小时；然后于上述相同条件下重复诱导培养一次，培养时间为18～80小时(即除了培养时间有区别，其余培养条件均一致)；得酵母发酵液；

4)收集菌体及浓度确定

将步骤3)所得的酵母发酵液于2000～4000rpm下离心5～15分钟，收集酵母菌体；然后用无菌水洗涤酵母菌体(洗涤1～3次，以除去培养基)，接着用无菌水重新悬浮酵母细胞，得浓度为10⁶～10⁹cells/ml的酵母细胞悬浮液。

作为本发明的提高海洋酵母对果实采后病害防治效力的培养方法的改进：步骤3)中重复诱导的培养时间为36小时。

作为本发明的提高海洋酵母对果实采后病害防治效力的培养方法的进一步改进：步骤4)中用血球计数板计数来调整酵母细胞悬浮液的浓度。

本发明所用的海洋生防酵母为Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman：保藏于英国国际真菌研究所(International Mycological Institute)国际农业与生物中心基因资源保藏中心(CABI Genetic Resource Collection)，保藏号为IMI 394084。

本发明所提供的提高海洋生防酵母对果实采后病害防治效力的培养方法，利用几丁质作为拮抗酵母活性激发子，能有效提高海洋生防酵母的拮抗活性，其机理与促进酵母在果实体内快速生长，激发与果实抗性相关的酶活性有关。利用本发明提供的培养方法对海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman IMI 39408进行培养，所得浓度为1×10⁶cells/ml～1×10⁹cells/ml的酵母细胞悬浮液能作为果实生物保鲜剂，将采后的果实直接浸泡在本发明的酵母细胞悬浮液中1～5分钟，可防治多种果实的多种采后病害；包括苹果、梨的青霉病，番茄的黑斑病，柑橘的酸腐病等。

本发明的优点是：(1)本发明中的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman遗传稳定，抑菌谱广，不产生抗生素，无化学污染，安全性高；(2)几丁质资源丰富，成本低廉，具有多种重要的生物学特性，且已经被美国EPA和FDA批准作为生物防腐剂和食品添加剂使用；(3)显著降低多种水果的采后病害，具有经济实用、安全高效、环境友好等特点。

为了获得本发明的实施方案，发明人曾进行了大量的验证实验，主要分成以下二类：

实验一、获得不同浓度几丁质诱导培养对海洋酵母生防效力的影响：

调整液体诱导培养基几丁质浓度分别为0.1％、0.2％、1.0％和2.0％(w/v)，即，每L液体诱导培养基分别含有1、2、10和20；其余内容均相同，最终所得的酵母细胞悬浮液的浓度均为10⁸cells/ml。

实验一.1不同浓度几丁质诱导培养的海洋酵母对苹果青霉病的防治效果：

实验果实为苹果，品种为富士。

病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)。

果实表面用无菌打孔器制造大小和深度统一的伤口(大约直径为5mm，深度为3mm)，每个伤口处分别加入50μl下述液体①无菌水(作为阳性对照)；②在NYDB中培养的R.paludigenum悬浮液(1×10⁸cells/ml)；③本发明所得的R.paludigenum悬浮液(1×10⁸cells/ml)。

注：②在NYDB中培养的R.paludigenum悬浮液：是将本发明步骤3)的液体诱导培养改用NYDB培养基(其余步骤均相同)制备而得。

2小时后，在每个伤口处加入30μl的P.expansum孢子悬浮液，浓度为1×10⁴cells/ml。用PE塑料膜密封作保湿处理，并在室温(20～25℃)下贮藏，6天后观察发病率。每处理3个平行，每平行包括12个果实。

不同浓度几丁质诱导培养的海洋酵母对苹果青霉病的防治效果如图1所示。

实验一.2不同浓度几丁质诱导培养的海洋酵母对梨青霉病的防治效果：

实验果实改为梨，品种为水晶，其余均同实验一.1。

不同浓度几丁质诱导培养的海洋酵母对苹果青霉病的防治效果如图2所示。

实验一.1和实验一.2说明：利用本发明提供的液体诱导培养基(几丁质浓度为0.1％～2.0％)诱导培养海洋酵母R.paludigenum后，能显著降低苹果和梨青霉病的发病率，减小病斑直径，其生防活性显著提高。尤其在几丁质浓度为1.0％的液体诱导培养基诱导培养后，苹果和梨青霉病的发病率仅为28.5％和17.9％，分别仅为NYDB对照发病率的52.8％和51.1％，这也说明几丁质浓度为1.0％是本发明提供的液体诱导培养基的优选方案，即每L液体诱导培养基中含有几丁质10g为最佳。

实验二、获得步骤3)重复诱导培养的最佳时间：

均选用每L中含有10g几丁质的液体诱导培养基，调整步骤3)重复诱导培养的时间；其余内容均相同，最终所得的酵母细胞悬浮液的浓度均为10⁸cells/ml。

实验二.1、不同诱导培养时间的海洋酵母对苹果青霉病的防治效果

在本实验中，果实表面用无菌打孔器制造大小和深度统一的伤口(大约直径为5mm，深度为3mm)，每个伤口处分别加入50μl下述液体①无菌水(作为阳性对照)；②在NYDB中培养24～48小时的R.paludigenum悬浮液(1×10⁸cells/ml)；③本发明所得的R.paludigenum悬浮液(1×10⁸cells/ml)，液体重复诱导培养时间分别为24、36、48、72小时。

其余同实验一。

不同诱导培养时间的海洋酵母对苹果青霉病的防治效果如图3所示。

实验二说明：利用本发明提供的培养方法(液体重复诱导培养时间分别为24、36、48、72小时)诱导培养海洋酵母R.paludigenum后，能显著提高其对苹果青霉病的拮抗效力，尤其是液体重复诱导培养时间为36小时的时候，苹果青霉病的发病率仅为17.4％，分别仅为NYDB对照发病率的44.7％；这也说明液体重复诱导培养时间为36小时是本发明提供的培养方法的优选方案。

综上所述，虽然有已公开的文章告知了几丁质能提高罗伦隐球酵母的微生物活性，但由于罗伦隐球酵母为陆地来源的生防酵母，而本发明中所用的为海洋来源的酵母。海洋来源的生防酵母具有陆地来源酵母不具有的诸多特点，如耐受渗透压、低温等逆境能力强等等。因此，能提高陆地来源生防酵母的微生物活性的物质并不必然能提高海洋来源的酵母的微生物活性。发明人在大量筛选验证实验的基础上，获得了本发明的技术方案，本发明获得的酵母细胞悬浮液适用多种果实病害，而现有技术报道均集中在扩展青霉等单一病原菌。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为不同浓度几丁质诱导培养的海洋酵母对苹果青霉病的防治效果对比图；

图1中：(a)为发病率，图(b)为病斑直径。

图2为不同浓度几丁质诱导培养的海洋酵母对梨青霉病的防治效果对比图；

图2中：(a)为发病率，图(b)为病斑直径。

图3为不同诱导培养时间的海洋酵母对苹果青霉病的防治效果图。

图4为几丁质诱导培养对海洋酵母在果实伤口处生长动态的影响图：

图4中：图(a)为几丁质诱导培养对海洋酵母在苹果果实伤口处生长动态的影响图；

图(b)为几丁质诱导培养对海洋酵母在梨果实伤口处生长动态的影响图。

图5为几丁质诱导培养的海洋酵母对番茄黑斑病的防治效果图。

图6为几丁质诱导培养的海洋酵母对柑橘酸腐病的防治效果图：

图6中：图(a)为发病率，图(b)为病斑直径。

具体实施方式

以下实施例中所用的酵母菌均为保藏号为IMI 39408的海洋酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman)。

实施例1、一种提高海洋生防酵母对果实采后病害防治效力的培养方法，依次进行以下步骤：

1)固体活化：

把斜面保存的酵母菌接种到灭菌NYDA斜面培养基中，25～28℃下培养60小时。

NYDA斜面培养基组成为：牛肉膏7g/L，酵母粉4.5g/L，葡萄糖9g/L和琼脂18g/L，余量为水。即，将牛肉膏7g、酵母粉4.5g、葡萄糖9g和琼脂18g放入去离子水中，并用去离子水定容至1L。然后将NYDA斜面培养基进行灭菌，灭菌条件为：在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20分钟；得灭菌NYDA斜面培养基。

将上述培养所得的酵母菌在上述相同条件下重复传代培养(即共培养两次)；得固体活化好的酵母菌。

2)液体活化

将步骤1)所得的固体活化好的酵母菌接种到灭菌NYDB液体培养基中，25～28℃、180rpm条件下培养25小时；得液体活化好的酵母菌。

NYDB液体培养基组成为：牛肉膏7g/L，酵母粉4.5g/L，葡萄糖9g/L，余量为水。然后将NYDB液体培养基进行灭菌，灭菌条件为：在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20分钟；得灭菌NYDB液体培养基。

3)液体诱导培养

液体活化好的酵母菌按4％接种量(重量比)接种到灭菌后的液体诱导培养基中，于25～28℃、180rpm条件下培养25小时。然后在上述相同条件下重复诱导培养一次，但培养时间改为36小时。得酵母发酵液。

液体诱导培养基组成为：牛肉膏7g/L、酵母粉4.5g/L、葡萄糖9g/L和几丁质10g/L，余量为水。然后将液体诱导培养基进行灭菌，灭菌条件为：在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20分钟；得灭菌后的液体诱导培养基。

4)收集菌体及浓度确定

如步骤3)所得的酵母发酵液于3000rpm下离心10分钟，收集酵母菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体两次除去培养基，接着用无菌水重新悬浮酵母细胞，并用血球计数板计数后调整成浓度为10⁷cells/ml的酵母细胞悬浮液。

实验1、几丁质诱导培养对海洋酵母在果实伤口处生长动态的影响(利用上述实施例1所得的酵母细胞悬浮液)：

实验1.1几丁质诱导培养对海洋酵母在苹果果实伤口处生长动态的影响：

实验果实为苹果，品种为富士。

果实表面用无菌打孔器制造大小和深度统一的伤口(大约直径为5mm，深度为3mm)，每个伤口处分别加入50μl下述液体：①在NYDB中培养36小时的R.paludigenum悬浮液(1×10⁷cells/ml)；②实施例1所得的R.paludigenum悬浮液(1×10⁷cells/ml)。用PE塑料膜密封作保湿处理，并在室温(20～25℃)下贮藏，定期取样对酵母数量进行测定。测定方法是用50μl无菌水反复清洗果实伤口处组织，重复清洗三次，将洗涤液统一收集于1.5ml离心管中，最后定容至1ml，取样在显微镜下用血球计数器对酵母菌数量进行统计，结果以每个伤口处总酵母数量为单位(log cells per wound)。每个处理重复3次，每重复6个果实。

注：①在NYDB中培养36小时的R.paludigenum悬浮液(1×10⁷cells/ml)是指将实施例1步骤3)中的液体诱导培养改用NYDB(其余步骤均相同)，制备而得。

几丁质诱导培养对海洋酵母在苹果果实伤口处生长动态的影响如图4(a)所示。

实验1.2几丁质诱导培养对海洋酵母在梨果实伤口处生长动态的影响：

实验果实为梨，品种为水晶，其余均同实验1.1。

几丁质诱导培养对海洋酵母在梨果实伤口处生长动态的影响如图4(b)所示。

实验1.1和1.2说明：利用实施例1提供的培养方法培养的海洋酵母R.paludigenum在苹果和梨果实伤口处的生长明显优于在普通NYDB培养基中培养的R.paludigenum。

实施例2、将酵母细胞悬浮液的浓度由10⁷cells/ml改成10⁸cells/ml，其余同实施例1。

实验2、几丁质诱导培养的海洋酵母对番茄黑斑病的防治效果：

实验果实为樱桃番茄，品种为杭樱1号。

病原菌：链格孢(Alternaria alternata)。

果实表面用无菌打孔器制造大小和深度统一的伤口(大约直径为5mm，深度为3mm)，每个伤口处分别加入30μl下述液体①无菌水(作为阳性对照)；②在NYDB中培养36小时的R.paludigenum悬浮液(1×10⁸cells/ml)；③实施例2所得的R.paludigenum悬浮液(1×10⁸cells/ml)。

2小时后，在每个伤口处加入20μl的A.alternata孢子悬浮液，浓度为5×10⁴cells/ml。用PE塑料膜密封作保湿处理，并在室温(20～25℃)下贮藏，4天后观察发病率。每处理3个平行，每平行包括30个果实。

几丁质诱导培养的海洋酵母对番茄黑斑病的防治效果如图5所示。

实验3、几丁质诱导培养的海洋酵母对柑橘酸腐病的防治效果：

实验果实为柑橘，品种为宫川。

病原菌：酸腐菌(Geotrichum citri-aurentii)，病原菌使用浓度为1×10⁵cells/ml。

其余均同实验2。

几丁质诱导培养的海洋酵母对柑橘酸腐病的防治效果如图6所示。

实验2和3说明：在优选了液体诱导培养基中的几丁质浓度和液体重复诱导培养时间之后，利用本发明提供的培养方法(如实施例2所示)培养的海洋酵母R.paludigenum对番茄黑斑病和柑橘酸腐病的防治效力显著提高，在第4天时的发病率为41.3％和20％，分别仅为NYDB对照发病率的60.7％和60.0％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.液体诱导培养基，其特征是：该培养基由以下含量的成分组成：

牛肉膏    6～8g/L，

酵母粉    4～5g/L，

葡萄糖    8～10g/L，

几丁质    1～20g/L，

余量为水。

2.根据权利要求1所述的液体诱导培养基，其特征是：所述几丁质为10g/L。

3.利用如权利要求1或2所述的液体诱导培养基进行的提高海洋酵母对果实采后病害防治效力的培养方法，其特征是：选用海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman IMI394084作为酵母菌，依次包括以下步骤：

1)、固体活化：

把斜面保存的酵母菌接种到灭菌NYDA斜面培养基中，于25～28℃下培养48～72小时，所述NYDA斜面培养基组成为：牛肉膏6～8g/L，酵母粉4～5g/L，葡萄糖8～10g/L和琼脂15～20g/L，余量为水；然后于上述相同条件下进行重复传代培养；

2)、液体活化：

将步骤1)所得的固体活化好的酵母菌接种到灭菌NYDB液体培养基中，于25～28℃、150～200rpm条件下培养18～30小时；所述NYDB液体培养基组成为：牛肉膏6～8g/L，酵母粉4～5g/L和葡萄糖8～10g/L，余量为水；

3)、液体诱导培养：

将步骤2)所得的液体活化好的酵母菌按重量比为2％～5％接种量接种到灭菌后的液体诱导培养基中，于25～28℃、150～200rpm条件下培养18～30小时；然后于上述相同条件下重复诱导培养一次，培养时间为18～80小时；得酵母发酵液；

4)、收集菌体及浓度确定

将步骤3)所得的酵母发酵液于2000～4000rpm下离心5～15分钟，收集酵母菌体；然后用无菌水洗涤酵母菌体，接着用无菌水重新悬浮酵母细胞，得浓度为10⁶～10⁹cells/ml的酵母细胞悬浮液。

4.根据权利要求3所述的提高海洋酵母对果实采后病害防治效力的培养方法，其特征是：所述步骤3)中重复诱导的培养时间为36小时。

5.根据权利要求4所述的提高海洋生防酵母对果实采后病害防治效力的培养方法，其特征是：所述步骤4)中用血球计数板计数来调整酵母细胞悬浮液的浓度。

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