CN104531571B - 荧光假单胞菌及生物制剂和在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用 - Google Patents

荧光假单胞菌及生物制剂和在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物农药领域,公开了一株荧光假单胞菌及其生物制剂和在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。将该株荧光假单胞菌命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)HN58,于2014年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉武汉大学,保藏号为CCTCC No:M2014511。该菌株由甘蔗根际土壤分离得到,能适应本地的自然环境;对甘蔗鞭黑穗病菌具有较好的抑制作用,而且来源环保无毒性,对生态环境影响小;培养条件要求低,具有很好的开发应用前景。

Description

荧光假单胞菌及生物制剂和在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用
技术领域
本发明属于生物农药领域,特别涉及一株荧光假单胞菌及其生物制剂和在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
背景技术
甘蔗(Saccharum officinarum)是我国南方地区重要的糖料作物,80%以上的食糖是以甘蔗作为原料制成的,在国民经济中有着重要的地位和作用。甘蔗原产于高温多湿的热带亚热带地区,非常有利于甘蔗病虫害的发生发展。迄今世界上已发现真菌病害约有80多种,在华南地区,甘蔗鞭黑穗病(sugarcane smut)是目前生产上发生最普遍、为害最严重的真菌性病害,已给甘蔗生产及糖业的产量和品质带来了严重的损失。目前,生产上对该病害的控制主要以化学药剂防治为主。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一种广泛存在于土壤中的生防细菌,产生胞外拮抗物质及诱导植物产生系统抗性是其最主要的特征,因而在植物病害生物防治中具有重要的地位。李爱荣等(2003)筛选到2株对稻瘟病菌有较好抑制作用的2株生防荧光假单胞杆菌。王刚等(2004)研究了荧光假单胞菌P2-5菌株对小麦全蚀病的抑制作用。顾金刚等(2004)报道了2株荧光假单胞杆菌菌株对烟草黑胫病病原菌的抑制作用。李国俊等(2008)报道荧光假单胞杆菌菌株7-5对烟草炭疽病菌抑制作用。Hossain等(2009)的研究也表明荧光假单胞菌可抑制苹果黑星病菌孢子的萌发。而对于甘蔗鞭黑穗病的生防菌的筛选,廖咏梅等(2004)进行过研究,但只鉴定到假单胞菌属。
因此,荧光假单胞菌作为一类重要的生防自然资源,已引起国内外研究者的广泛关注,具有开发生物农药的潜力。
发明内容
为了克服上述现有技术防治甘蔗鞭黑穗病的缺点与不足,开发荧光假单胞菌的应用,本发明的首要目的在于提供一株以甘蔗根际微生物为筛选对象,分离得到的对甘蔗鞭黑穗病菌有抑制作用的荧光假单胞菌,命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)HN58,为甘蔗鞭黑穗病的生物防治奠定基础。另外,本发明从甘蔗根际筛选到的生防菌,将其用于甘蔗病害的防治,其主要生防机制表现为抑制甘蔗鞭黑穗病菌+、–两个单倍体菌系的有性配合,因形成不了具有侵染致病力的双核菌丝体,从而达到生防效果。同时又较少或不影响病原菌的两个无致病性单倍体菌丝本身的形态生长。这种生防机制具有较大的创新意义。将其应用到甘蔗病害的防治,对甘蔗的食用及其加工产品来说更加安全可靠。
本发明另一目的在于提供一种基于上述荧光假单胞菌制备得到的生物制剂。
本发明再一目的在于提供上述荧光假单胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
本发明再一目的在于提供上述生物制剂在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现:
一株荧光假单胞菌,将其命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)HN58,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉武汉大学,保藏号为CCTCC No:M2014511,保藏时间为2014年10月24日。
所述的荧光假单胞菌在LB培养基上28℃培养,其单菌落为圆形,乳白色,表面光滑,不透明,略隆起,粘质,边缘整齐无皱褶。
所述的荧光假单胞菌从甘蔗根际土壤中分离、纯化得到。
一种生物制剂,基于上述荧光假单胞菌制备得到。
所述的生物制剂由荧光假单胞菌经液体发酵制备得到,优选包含以下步骤:将荧光假单胞菌接种至LB液体培养基培养,即可获得生物制剂。
所述LB液体培养基的pH值优选为7.0。
所述的培养指在28℃,摇床震荡速率为180~200rpm下培养24h。
上述生物制剂在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
上述荧光假单胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果:
1、本发明得到的荧光假单胞菌来源于本地甘蔗根际土壤,能适应本地的自然环境;另外,本发明从甘蔗根际筛选到的生防菌,将其用于甘蔗病害的防治,其主要生防机制表现为仅抑制甘蔗鞭黑穗病菌+、–两个单倍体菌系的有性配合,因形成不了能侵染致病的双核菌丝体,从而达到生防效果。同时又较少或不影响病原菌的两个无致病性单倍体菌丝本身的生长。这种生防机制具有较大的创新意义。将其应用到甘蔗病害的防治,对甘蔗的食用及其加工产品来说更加安全可靠。
2、本发明的生物制剂对甘蔗鞭黑穗病菌具有强烈的抑制作用,而且该生物制剂来源环保无毒性,对生态环境影响小。
3、本发明得到的荧光假单胞菌,培养条件要求低,具有很好的开发应用前景。
附图说明
图1为荧光假单胞菌对甘蔗鞭黑穗病菌的抑制作用结果图。
图2为荧光假单胞菌滤液对甘蔗鞭黑穗病菌的抑制作用结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1:荧光假单胞菌的分离、纯化和保藏
(1)LB培养基的配置:LB培养基的配置:称取胰蛋白胨(Tryptone,Oxoid LTDLP0042,England)10g,酵母提取物(Yeast extract,Oxoid LTD LP0021,England)5g,氯化钠(NaCl,国药集团化学试剂有限公司,10019318)10g,加水1000mL搅拌均匀,再加15g琼脂,充分加热溶解后分装,121℃灭菌20min后贮存备用。
(2)荧光假单胞菌的分离、纯化:
称取华南农业大学跃进农场蔗田甘蔗根际土样10g,加到装有90mL无菌水的三角瓶中,于28℃、200rpm振荡1h,静置1~2h后,吸取1mL的土壤浸渍上清液以浓度梯度法,用0.9%的生理盐水依次稀释至10-6的浓度,分别吸取100μL 10-4、10-5、10-6等3个浓度的溶液均匀涂布在LB平板上以分离细菌,每个浓度涂3个平板。
在无菌超净台上充分吹干后,于28℃、黑暗、倒置培养,1~2d后即有大量细菌菌落长出。用灭菌牙签挑取菌落特征不同的单菌落于LB平板上纯化培养,得到多种不同生物形态的菌株,将其中四种分别编号为A1、A2、A3、A4,并作为生防实验待测菌株保存备用,对其进行生防活性检测后,选取A1为本发明的新菌株。
所述纯化所得A1菌株经16SrDNA序列分析,其序列(如下所示)与NCBI数据库进行核苷酸序列同源性比对,结果显示,在亲缘关系相近的前100个序列中,76个为假单胞菌属(Pseudomonas spp.)的菌株,本菌株与它们都具有99%的同源性。再通过构建16SrDNA序列的系统发育树,本菌株与P.fluorescens Pf0-1(NC_007492.2)菌株处于同一分支,菌株间的相似性达到了99.4%,证实其分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)HN58。16SrDNA序列片段如下:
AAACTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAACATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATaCAGAATGTCGCGGGAATACTTCCCCGGCT
荧光假单胞菌在LB培养基上28℃培养,其单菌落为圆形,乳白色,表面光滑,不透明,略隆起,粘质,边缘整齐无皱褶。
(3)荧光假单胞菌的保藏:将该菌株于2014年10月24日保藏于中国湖北武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC No:M2014511。
实施例2:对峙培养法测定荧光假单胞菌的活性
(1)LB培养基的制备同实施例1;LB液体培养基的制备除不加琼脂,其他与LB固体培养基的配方相同,将称得的试剂充分溶解后分装于锥形瓶(每瓶100mL培养液),加塞包扎,121℃灭菌20min,冷却后贮存备用。
(2)PDA培养基的制备:称取200g马铃薯切成小块,加水煮沸20~30min,至能被玻璃棒戳破,用八层纱布过滤;滤液加热,加入葡萄糖20g,琼脂粉20g,搅拌均匀,稍冷却后再补足水分至1000mL,分装于锥形瓶(每瓶100mL培养液),加塞、包扎,121℃灭菌20min,冷却后贮存备用。
(3)荧光假单胞菌单菌落的制备:将荧光假单胞菌划线接种至LB培养基平板上活化培养24h后,挑取单菌落进行划线保存。
(4)荧光假单胞菌培养液(生物制剂)和培养滤液的制备:取步骤(3)制备得到的荧光假单胞菌单菌落接入步骤(1)制备得到的LB培养液锥形瓶中,置于28℃,摇床速率为200rpm下培养24h,即可得到荧光假单胞菌的培养液;取1mL培养液作为种子液加在100mL的LB液体培养基中培养48h,再于12,000rpm离心10min,取上清液,再用0.2μm的过滤器滤除菌体,获得荧光假单胞菌培养滤液。
(5)甘蔗鞭黑粉菌的+、–两个单系菌悬液及其混合菌悬液的制备:
甘蔗鞭黑粉菌孢子粉采自湛江甘蔗产区大田发鞭黑穗病的甘蔗病株并风干。挑少量上述甘蔗鞭黑穗病新鲜标本病部的黑色粉状物,用无菌水配成病菌孢子悬浮液均匀涂布在PDA(含链霉素50μg/mL)平板上,无菌风干,于28℃、黑暗条件下培养。24h后开始镜检,有担孢子产生,即在平板中加入无菌水,轻轻振荡并稀释即得到担孢子悬浮液,取50μL担孢子悬浮液均匀涂布到PDA(含链霉素50μg/mL)平板上,28℃培养,挑出多个单菌落至PDA(含链霉素50μg/mL)平板上分别进行培养,即得到了多个黑粉菌的单性系。将单性系两两混在一起,能在PDA平板、28℃培养1~2d后菌落呈白色的即表明二者之间是亲合的,该二个单性系菌株则分别以+、-菌系表示。再挑取+、-菌系分别涂匀在PDA平板上,28℃培养48h,各刮取少量用无菌水配制成相近浓度的单系菌悬液,分别取等体积混在一起得到混合菌悬液。
(6)活性测定:
①荧光假单胞菌对甘蔗鞭黑粉菌有性配合的抑制作用测定:先将混合培养基(PDA:LB=1:1)平板划成条状,再挑取步骤(3)制得的荧光假单胞单菌落接种到条的一端,过夜后,再将步骤(5)制得的甘蔗鞭黑粉菌+、–两个单系的混合菌悬液点在条面上,以其它细菌菌株(实施例1中分离纯化得到的另外三种菌株A2、A3、A4)的菌悬液分别点样为对照,每个平行两个样。结果如图1所示,培养基条块1和2为本发明的HN58、3和4为A2菌株、5和6为A3菌株、7和8为A4菌株。图1中培养基条块1和2上的细菌能抑制条面上的鞭黑粉菌的配合,即为筛选所需的菌株,编号为HN58,而培养基条块3和4、5和6、7和8条面上的细菌无抑制作用,属于其它非靶标分离菌株,弃用。
②荧光假单胞菌培养滤液对甘蔗鞭黑粉菌有性配合的抑制作用的测定:将PDA培养基划成并保留5个长条,在一端放置牛津杯,依次加入0μL(无菌水)、50μL、100μL、150μL和200μL不同体积的由步骤(4)制得的荧光假单胞菌的培养滤液,再将步骤(5)制得的甘蔗鞭黑粉菌+、–两个单系的混合菌悬液点在面上,以加无菌水为对照。结果如图2所示,其中,1为无菌水,2~5依次分别为加入了50μL、100μL、150μL和200μL的生防菌HN58的培养滤液。由图2可知,随着培养滤液体积的增加,2、3、4、5长条表面上表现为菌丝稀少和色淡的菌落数量越来越多,表明黑粉菌有性配合受到了明显的抑制且作用也相应加强;而加无菌水的对照长条1的菌落上菌丝较多,呈白色,表明进行了有性配合及产生了双核菌丝体且生长不受影响。
结果分析:由图1和图2可知,荧光假单胞菌及其培养滤液对甘蔗鞭黑粉菌具有明显的抑制作用,且作用主要表现为抑制其有性配合。
实施例3:荧光假单胞菌防治甘蔗鞭黑穗病
(1)LB培养基的制备同实施例1。LB培养液的制备同实施例2。
(2)荧光假单胞菌生物制剂的制备同实施例2。
(3)采用拌种法接种。1)将生防菌株HN58在LB平板上划线活化,1~2天后挑其单菌落用LB液体培养基于28℃、200rpm摇菌至OD600为1.5左右;2)按每1kg土壤中加入0.25g病原菌黑粉菌孢子(见实施例2),再分别设置加入5mL、20mL、100mL生防细菌培养液的三个处理,每个处理3个重复。每个重复由于选用30段种蔗茎节,故需分别配制4kg含黑粉菌1g和生防菌20mL、80mL、400mL的带菌土;3)设单独加黑粉菌、清水共2个对照,也各重复3次。4)甘蔗种茎放入盘子中在温室中做催芽处理;5)催芽后转入大田种植,2~3个月之后观察甘蔗苗的生长情况并做病害调查(见表1)。
表1生防菌对田间甘蔗鞭黑穗病的防治试验效果
从表1的结果来看,清水空白对照没有发病,没有接种生防细菌的对照发病最为严重,发病率平均为33.3%。三个处理,无论是用20、80、400mL进行拌种处理,发病率都比不接生防菌的对照要轻,分别为20.0%、3.30%、0.00%,说明HN58在田间能够表现出良好的防治效果。在三个处理当中,尤其以接种了400mL生防菌的处理防治效果最好,没有出现发病植株,说明了随着生防菌接种量的加大,在田间的防治效果也越来越好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株荧光假单胞菌,其特征在于:将其命名为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)HN58,保藏于中国典型培养物保藏中心,简称CCTCC,地址:中国武汉武汉大学,保藏号为CCTCC No:M2014511,保藏时间为2014年10月24日。
2.根据权利要求1所述的荧光假单胞菌,其特征在于:从甘蔗根际土壤中分离、纯化得到。
3.一种生物制剂,其特征在于基于权利要求1~2任一项所述的荧光假单胞菌制备得到。
4.根据权利要求3所述的生物制剂,其特征在于通过包含以下步骤的方法制备得到:将荧光假单胞菌接种至LB液体培养基培养,获得生物制剂。
5.根据权利要求4所述的生物制剂,其特征在于:所述LB液体培养基的pH值为7.0;所述的培养指在28℃,摇床震荡速率为180~200rpm下培养24h。
6.根据权利要求3~5任一项所述的生物制剂在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
7.根据权利要求1~2任一项所述的荧光假单胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
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