PL175708B1 - Biologicznie czysta kultura nowego mikroorganizmu Streptomyces WYEC 108, kompozycja do ochrony przed zakażeniami grzybowymi i sposób polepszania wzrostu roślin - Google Patents

Abstract

1. Biologicznie czysta kultura nowego mikroorganizmu Streptomyces WYEC 108, o numerze identyfikacyjnym ATCC 55445. 2. Kompozycja do ochrony roslin przed zakazeniami grzybowymi skladajaca sie z organizmów Streptomyces, znamienna tym, ze zawiera od 104 do 101 4 cfu/g nowego mikroorganizmu Streptomyces WYEC 108 oraz srodowisko do zabiegów, przy czym srodo- wisko do zabiegów obejmuje co najmniej jeden z nastepujacych skladników: piasek, wode, make zbozowa, torfowiec, zal alginianowy, wermikulit i wypelniacz organiczny i nieorgani- czny oraz ewentualnie dostateczna ilosc zródla azotu. 6. Sposób polepszania wzrostu roslin, znamienny tym, ze podaje sie na nasiona lub sadzonki kompozycje zawierajaca srodowisko do zabiegów i co najmniej jeden skladnik wybrany z grupy obejmujacej komórki Streptomyces WYEC 108, zarodniki Streptomyces WYEC 108 i przeciwgrzybowe metabolity wytwarzane przez Streptomyces WYEC 108. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest biologicznie czysta kultura nowego mikroorganizmu Streptomyces WYEC 108, kompozycja do ochrony przed zakażeniami grzybowymi i sposób polepszania wzrostu roślin. Mikroorganizm ten jest zdolny do inhibicji wzrostu glebowych patogenów roślinnych i polepszania wzrostu roślin.

Grzybowe patogeny roślinne są przyczyną wielu strat ekonomicznych w rolnictwie i ogrodnictwie. Opisano wiele różnych typów grzybowych patogenów roślinnych: patogeny te wywołują choroby roślin, takie jak gnicie, biała zgnilizna, brunatna zgnilizna i zgnilizna korzeni. Choroby te mogą niszczyć wschodzące sadzonki, zmniejszać żywotność roślin i obniżać niekorzystnie plony.

Aby zmniejszyć możliwość występowania grzybowych infekcji, szkółki roślinne mogą hodować sadzonki w sterylizowanej lub poddanej zabiegom chemicznym glebie. Jednak takie zabiegi usuwają także z gleby korzystne mikroorganizmy, w tym mikroorganizmy współzawodniczące normalnie z grzybami. W takich przypadkach, przy przypadkowym wprowadzeniu grzybowego patogenu, może on rozrosnąć się gwałtownie i szeroko rozprzestrzenić chorobę.

W warunkach rolniczych gleby zainfekowane patogenami grzybowymi mogą się nie nadawać dla pewnych upraw. Np. produkcja soi w Michigan i innych stanach jest często ostro ograniczana przez zgniliznę korzeni powodowaną przez grzyb Phytophera megasperma (Filinow i Lockwood, 1985). Grzyby z rodzaju Pythium są szeroko rozpowszechnione w glebach Kalifornii, Washington i Idaho. Pythium ultimum jest najpospolitszym patogenem co wiąże się z gniciem sadzonek zarówno przed, jak i po wzejściu. Gatunek ten jest poważnym patogenem pszenicy, grochu i grochu włoskiego, a także innych upraw rosnących na tych glebach i glebach w innych stanach i krajach (Trapero-Casas i in., 1990; Stanghellini i Hancock, 1970; Kraft i

175 708

Burke, 1971; Westerlund i in., 1988). Stosowanie środków chemicznych do zwalczania grzybowych patogenów roślinnych jest często niepraktyczne wskutek dużych kosztów, braku skuteczności i powstawania odpornych szczepów grzybów. Ponadto stosowanie fungicydów chemicznych nie jest wskazane ze względu na ochronę środowiska. Celowym byłoby zatem uzyskanie takiego środka biologicznego, który skutecznie będzie zwalczał infekcje grzybowe u roślin, i jednocześnie nie będzie szkodliwy dla środowiska.

Cel ten osiągnięto izolując pewną liczbę bakterii promieniowcowatych, które skutecznie zwalczają grzybowe patogeny roślin. W szczególności, jedna z wyizolowanych bakterii promieniowcowatych, nazwana tu Streptomyces WYEC 108 (także WYEC 108), wykazała silny antagonizm wobec szeregu grzybowych patogenów roślin, w tym patogenów powodujących choroby roślin takie jak gnicie, zgnilizna korzeni, biała zgnilizna i brunatna zgnilizna.

Przedmiotem wynalazku jest biologicznie czysta kultura nowego mikroorganizmu Streptomyces WYEC 108, o numerze identyfikacyjnym ATCC 55445.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja do ochrony przed zakażeniami grzybowymi składająca się z mikroorganizmów Streptomyces, charakteryzująca się tym, że zawiera od 104 do 10^W cfu/g nowego mikroorganizmu Streptomyces WYEC 108 i środowisko do zabiegów, przy czym środowisko do zabiegów obejmuje co najmniej jeden z następujących składników: piasek, wodę, mąkę zbożową, torfowiec, żel alginianowy, wermikulit, i wypełniacz organiczny i nieorganiczny i ewentualnie dostateczną ilość źródła azotu. Kompozycje takie są przydatne do zmniejszania podatności roślin na grzybice i polepszają wzrost testowanych roślin. W korzystnej odmianie, taka kompozycja jako źródło azotu zawiera chlorek amonu. Również korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera zarodniki Streptomyces WYEC 108 i ewentualnie ponadto metabolity przeciwgrzybowe wytwarzane przez Streptomyces WYEC 108.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób polepszania, wzrostu polegający na tym, że podaje się na nasiona lub sadzonki kompozycję zawierającą środowisko do zabiegów i co najmniej jeden składnik wybrany z grupy obejmującej komórki Streptomyces WYEC 108, zarodniki Streptomyces WYEC 108, i przeciwgrzybowe metabolity wytwarzane przez Streptomyces WYEC 108.

Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia fotografia spod mikroskopu elektronowego pokazujące spiralne łańcuchy (górne) i powierzchnię zarodników (dolne) Streptomyces WYEC 108, a fig. 2 przedstawia groch włoski rosnący w glebie zainfekowanej gatunkami Pythium. Rośliny z prawej strony wzeszły z nasion traktowanych Streptomyces WYEC 108. Rośliny z lewej strony wzeszły z nasion nie poddanych obróbce.

W niniejszym wynalazku opisano izolowanie pewnej liczby szczepów promieniowców z gleby. Pewna liczba szczepów okazała się skuteczna w redukowaniu skutków działania grzybowych patogenów na rośliny, w tym na sałatę, groch włoski i paprykę. W szczególności wynalazek dotyczy izolowania nowego szczepu nazwanego tu Streptomyces WYEC 108. Szczep WYEC 108 wykazuje silny antagonizm wobec szerokiej gamy grzybowych patogenów roślin, w tym patogenów wywołujących gnicie, zgniliznę korzeni, białą zgniliznę i brunatną zgniliznę. Jako taki szczep WYEC 108 jest szczególnie użyteczny jako czynnik bio-kontrolujący, który może być użyty do ochrony roślin przed infekcją tymi patogenami roślinnymi. Streptomyces WYEC 108 nadaje się też do zmniejszania podatności roślin na zakażenia grzybowe. Zakażenia grzybowe u podatnych, nie poddanych obróbce roślin wpływa na pewne cechy wzrostu takich roślin. Na przykład, nie poddane obróbce rośliny wystawione na działanie grzybowych patogenów roślin wykazują znacznie mniejszą wysokość, wielkość biomasy i wydajność uprawy w porównaniu z roślinami nie wystawionymi na działanie grzybowych patogenów. Rośliny poddane obróbce Streptomyces WYEC 108 zgodnie ze sposobem według wynalazku i wystawione następnie na działanie grzybowych patogenów wykazują mniej znaczną redukcję wysokości, wielkości biomasy i wydajności uprawy w porównaniu z nie poddanymi obróbce roślinami wstawionymi na działanie grzybowych patogenów. Rośliny potraktowane Streptomyces WYEC 108 i wystawione na działanie grzybowych patogenów wykazują charakterystykę wzrostu lepszą, niż rośliny nie poddane obróbce i nie zainfekowane patogenami.

175 708

Szczep WYEC 108 kolonizuje korzenie roślin w obecności współzawodnictwa mikroflory korzeniowej. Wykazano, że szczep WYEC 108 polepsza wzrost sałaty rosnącej na sterylizowanej parą wodną glebie i papryki rosnącej na polu.

W celu realizacji sposobu według wynalazku wytworzono też środki do wytwarzania wegetatywnych komórek lub zarodników szczepu WYEC 108 nadających się do włączania do środowiska do zabiegów. Wykazano, że kompozycja zawierająca wegetatywne komórki i zarodniki WYEC 108 i środowisko do zabiegów wykazuje dużą trwałość przy magazynowaniu i nadaje się do dostarczania szczepu WYEC 108 na rośliny.

Substancje i metodyka

Środowisko wzrostu bakterii

Wszystkie środowiska wzrostu bakterii przygotowano w wodzie destylowanej i sterylizowano przed użyciem w autoklawie. Wszystkie próbki bakterii przygotowywano w standardowych aseptycznych warunkach laboratoryjnych w celu zachowania czystości.

Środowisko YGM (ekstrakt drożdży/glukoza/sole mineralne) zawiera 0,6% (wagowo/objętościowo) ekstraktu drożdży (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), 1,0% (wagowo/objętościowo) glukozy, oraz roztwór soli fosforanowej (5,3 g Na2HPO4, 1,98 g KH2PO4, 0,2 g MgSO4 · 7H2O, 0,2 g NaCl, 0,05 g CaCl2 · 2H2O i 1,0 ml pierwiastków śladowych (Pridham i Gottlieb, 1948) na litr dejonizowanej H2O; pH 7,1 do 7,2). Roztwór pierwiastków śladowych składał się z 0,64 g CuSO4 · 5H₂0,0,11 g FeSO4 · 7H₂0,0,79 g MnCh · 4H₂0,0,15 g ZnSO4 · 7H₂O w 100 ml destylowanej wody.

Środowisko WYEC (woda/ekstrakt drożdży/agar), zmodyfikowane, według Reddi i Rao (1971) zawierało ekstrakt drożdży (Oxoid, 0,25 g/l) jako jedyne źródło węgla i azotu, oraz agar (Oxoid, 18,0 g/l). Środowisko buforowano do pH 7,2-7,4 K2HPO4 (0,5 g/l).

Środowisko WYEC (woda/ekstrakt drożdży/celuloza/agar) było agarem WYE, do którego dodano cienką warstwę agaru. Warstwa agaru zawierała 0,25 g/l celulozy (Solka Floc, Sigma Chemical Co) i 18,0 g/l agaru w wodzie destylowanej.

Środowisko CYD (kwasy kazaminowe/ekstrakt drożdży/agar glukozowy) zawierało kwasy kazaminowe (Difco: 0,5 g/l), ekstrakt drożdży (Oxoid lub Difco: 0,8 g/l), D-glukozę (0,4 g/l), K2HPO4 · (2,0 g/l, pH 7,2-7,4) i 18,0 g/l agaru w wodzie destylowanej.

Środowisko YCED (kwasy kazaminowe/ekstrakt drożdży/glukoza/agar); modyfikacja według Reddi i Rao (1971) zawierało ekstrakt drożdży (Oxoid, 0,3 g/l), kwasy kazaminowe (Difco, 0,3 g/l), D-glukozę (0,3 g/l) i agar (Oxoid, 18,0 g/l). Środowisko buforowano K2HPO4 (2,0 g/l).

Środowisko CYPC (celuloza/ekstrakt drożdży/pepton/ekstrakt kompostowy/agar) zawierało celulozę (Solka Flock, Sigma Chemical Co.; 5,0 g/l), ekstrakt drożdży (1,0 g/l), pepton (Oxoid, 1,0 g/l), bufor fosforanowy (K2HPO4, 0,75 g/l), agar (18,0 g/l), i ekstrakt kompostowy (100 ml/l) zastępujący 100 ml destylowanej wody w środowisku. Dolano go bezpośrednio, a nie stosowano jako cienką warstwą agarową.

Środowisko MSSC (sole mineralne/skrobia/kazeina/agar; Turhan, 1981) zawierało roztwór soli mineralnych złożony z NACl (2,0 g/l), MgSo4 · 17H2O (0,05 g/l), CaCO3 (0,02 g/l), FeSO4 · 18H2O (0,01 g/l), i KNO3 (2,0 g/l), oraz składniki organiczne, w tym rozpuszczalną skrobię (10 g/l) i kazeinę (0,3 g/l) i agar (18,0 g/l). Środowisko buforowano K2HPO4 (2,0 g/l).

Środowisko zarodnikowania (środowisko ATCC #5) zawierało ekstrakt drożdży (1,0 g/l), ekstrakt wołowy (1,0 g/l), tryptozę (2,0 g/l), FeSO4 (0,01 g/l), glukozę (10,0 g/l) i agar (15,0 g/l). Środowisko ustawiono na pH 7,2 przed ogrzewaniem w autoklawie. (ATCC Catalogue of Bacteria i Bacteriophages - 17 wydanie).

Środowisko CYG zawierało kwasy kazaminowe (kwasowy hydrolizat) (5,0 g/l), ekstrakt drożdży (5,0 g/l) i glukozę )10,0 g/l) w wodzie destylowanej, ustawionej na pH 7,1-7,2.

Środowisko do zabiegów (zawierające piasek/mąkę zbożową/wodę lub torfowiec/piasek/mąkę zbożową w proporcjach podanych niżej) sterylizowano parą wodną przed użyciem. Sterylizację prowadzono zwykle w autoklawie 3 razy, za każdym razem przez 90 minut.

Zbieranie narośniętych bakterii

W celu uzyskania grzybniowego rozrostu Streptomyces WYEC 108 kolby Erlenmyera o pojemności 11 zawierające 500 ml środowiska YGM (pH 7,1-7,2) zaszczepiono 20 ml podsta175 708 wowej hodowli (utworzonej zgodnie z opisem w przykładzie Π) i inkubowano z wytrząsaniem przy szybkości 250 obrotów na minutę w temperaturze 30°C przez 3 dni. Grzybnie odwirowano przy szybkości 5000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut. Alternatywnie, grzybnie zebrano odstawiając hodowlę aż do osadzenia się na dnie kolby Erlenmeyera grzybni i zarodników. Supematant zdekantowano i stężoną zawiesinę grzybni i zarodników zastosowano bezpośrednio do szczepienia środowiska do zabiegów.

Komórki i zarodniki wytwarzano także metodą hodowli na stałym środowisku (np. agarze do zarodnikowania). Grzybnie i zarodniki zebrano z agaru do zarodnikowania przez zdrapywanie powierzchni agaru do destylowanej wody. Zawiesinę zarodników i grzybni następnie mieszano bezpośrednio ze środowiskiem do zabiegów.

W celu utworzenia zarodników Streptomyces WYEC 108, kolby Erlenmeyera o pojemności 2 1 zawierające 1200 ml środowiska YGM zaszczepiono 50 ml podstawowej hodowli i inkubowano z wytrząsaniem przy szybkości 250 obrotów na minutę w temperaturze 30° przez 12-18 dni. Zarodniki odwirowywania przy szybkości 9000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut.

Grzybowe patogeny

Pythium ultimum PuMXL otrzymano ze zbioru kultur Departamentu Mikrobiologii i Ochrony Roślin w Horticulture Research International, Worthing Road, Littlehampton, West Sussex BN 17 6LP, Wielka Brytania. Grzyby białej zgnilizny Phanerochaete chrysosporium i Coriolus versicolor, białej zgnilizny Postia płacenia, Caldariomyces fumago i Gloeophyllum trabeum; glebowe grzybowe patogeny Rhizoctonia solani, Fusarium sambucinaum, Geotrichum candidum i Verticillium dahliae otrzymano ze zbioru kultur profesora Dona L. Crawforda, Department Bacteriology, University of Idaho, Moscow, ID. Pythium irregulare, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora parasitica, Sclerotinia cepivorum i Sclerotinia sclerotiorum otrzymano ze zbioru kultur dra Wesleya Chuna, Department of Plant Soil Entomology Science, University of Idaho, Moscow, ID. Fusarium oxysporum otrzymano ze zbioru kultur dra Arthura D. Partridge, Department of Forest Resources, University of Idaho, Moscow, ID. Wszystkie kultury trzymano na agarze z glukozą ziemniaczaną lub agarze z mąką zbożową i hodowano w temperaturze 25°C. Szczepy te określono przy otrzymywaniu jako patogeny, ale nie sprawdzano ich patogenności.

Gleba do biotestów

Do biotestów zebrano glebę naturalnie zarażoną Pythium ultimum z kilku miejsc w regionie Paluose koło Moscow, Idaho. Zebrano ją z górnych 15 cm z pół obsiewanych pszenicą i grochem w ostatnich dwu sezonach. Populację gatunków Pythium określono następująco: Rozcieńczono 1,0 g suszonej na powietrzu gleby w 50 ml sterylizowanej destylowanej wody mieszając starannie w mieszalniku rurowym Vortex. Próbkę 0,1 ml dobrze zmieszanego rozcieńczenia umieszczono jako małe krople na trzydniowych płytkach z 2% agarem wodnym (Stanghellini i Hancock, 1970). Płytki inkubowano w temperaturze 25°C i okresowo odczytywano przy pomocy słabego (x 10) mikroskopu z oświetleniem fluorescencyjnym w celu określenia identyczności i liczebności obecnych gatunków Pythium. Kolonie na każdej płytce sprawdzono po 12,48 i 72 godzinach inkubacji przed oceną końcowej populacji. Identyfikację oparto na charakterystyce morfologicznej grzybni grzyba gatunku Pythium pod mikroskopem i wzoru wzrostu na płytkach z 2% (wagowo/objętościowo) agarem wodnym. Kolonie czystych hodowli grzybów na 2% (wagowo/objętościowo) agarze wodnym służyły jako kontrolne do identyfikacji (Stanghellini i Hancock, 1970; Stasz i in., 1980).

Badanie gleby ujawniło, że gęstości populacji P. ultimum i P. irregulare wynosiły odpowiednio 354±15 i 194±11 cfu/g w suszonej powietrzem glebie w okresie zasiewu (Wiosna, 1992). Gęstości populacji innych gatunków Itythium wynosiły 57±9 cfu/g w suszonej powietrzem glebie. P. ultimum i P. irregulare były przeważającymi gatunkami w zebranej glebie.

Przykład I. Izolowanie szczepów promieniowców wykazujących antagonizm wobec grzybowych patogenów roślin.

Izolowanie szczepów promieniowców z czterech korzeniowych i czterech niekorzystnych próbek roślin. Szczepy te przetestowano na przydatność do inhibicji grzybowych patogenów roślin.

175 708

Izolowanie szczepów promieniowców

Izolaty promieniowców wyizolowano z 8 różnych gleb techniką seryjnych rozcieńczeń i rozprowadzania na płytkach. Rozcieńczenia (10'⁵ do 10‘^Tumieszczono na płytkach w różnych środowiskach agarowych do izolowania. Składy tych środowisk podaje powyższa część Substancje i metodyka jak zacytowano powyżej. Izolaty promieniowców określono według środowiska, na którym były izolowane. Na przykład, WYEC 108 izolowano na środowisku WYEC, a YcEd 9 izolowano na środowisku yCeD. Ogólnie, takie środowiska są ubogie w węgiel organiczny, który skutecznie kontroluje wzrost korzystnych bakterii i grzybów i pomaga w izolowaniu wolniej rosnących promieniowców. Ponieważ agary WYE i YCED były szczególnie skutecznymi środowiskami izolowania, stosowano głównie to środowisko. Płytki z rozcieńczeniami inkubowano w temperaturze 25°C przez 4 do 10 dni, aby promieniowce zarodnikowały, po czym kolonie zebrano i nałożono w celu oczyszczenia na płytki z agarami WYE lub YCED. Czyste kolonie przeniesiono z tych płytek na agarowe skośne hodowle YCED lub CYD, inkubowano w temperaturze 25°C lub 37°C do zarodnikowania i przechowywano w temperaturze 5°C aż do użycia. Kultury podstawowe przenoszono co 3 do 4 tygodni.

Gleby (i) Gleby ze środowiska niekorzeniowego

Próbki (100 do 200 g) gleby pobrano z górnych 7,5 do 10 cm profilu gleby z 4 miejsc w Wielkiej Brytanii, w tym gleby z uprawianego ogrodu różanego (Gleba S1) w Rustington, West Sussex; z miedzy pola pszenicy (Gleba S2) z farmy Horticulture Research International (H.R.I.) w Littlehamton, West Sussex; leśnej gleby (Gleba S6) z rezerwatu leśnego Wynd Cliffhardwood, Południowa Walia; i pastwiska (Gleba S7) niekiedy spasanego owcami w Hastings Hill, South Downs, West Sussex. Te gleby uznano za niekorzeniowe, chociaż zawierały korzenie pewnych roślin w ióżnych ilościach.

(ii) Gleby ze środowiska korzeniowego

Próbki gleby ze środowiska korzeniowego z 4 miejsc przygotowano ściśle sposobem według Millera i in. (1990). Gleba 3 (S3) łączyła się z korzeniami mniszka lekarskiego (Taracum officinale) w ogrodzie różanym H. R. I. w West Sussex w Anglii. Gleba (S5) łączyła się z korzeniami pszenicy, a pobrano ją z tego samego pola, co glebę S2, z pola pszenicy z farmy (H. R. I.) w Littlehampton, West Sussex. Gleba 4 (S4) łączyła się także także z korzeniami pszenicy, ale na Bignor Hill wzdłuż South Down Way, West Sussex. Gleba 8 (S8) łączyła się z korzeniami lnu i pobrano ją z pola sąsiadującego z miejscem pobierania próbek S7, pastwiskiem niekiedy spasanym owcami w Hastingd Hill, South Downs, West Sussex.

Promieniowanie wydzielone z gleb można podzielić na wydzielone z gleb ze środowiska niekorzeniowego (S1, S2, S6, i S7) albo ze środowiska korzeniowego (S3, S4, S5, i S8). Wszystkie gleby zanalizowano na zawartość wody przez wysuszenie próbek 3 g (mokrej masy) (trzy powtórki) w temperaturze 100°C w czasie 58 godzin i ponownej zważono. Odczyn pH gleby określono starannie mieszając zawiesinę gleba : papka woda, w stosunku 1:1 pozwalając na osadzanie ciał stałych przez 2 godziny, następnie mierząc pH roztworu supernatanta. Po zebraniu gleby przechowywano ją w temperaturze 4°C aż do użycia (24 do 48 godzin). W badaniu wizualnym potwierdzono, że izolaty są szczepami promieniowców, która to obserwacja wykazała, że kolonie tworzone przez szczepy były typowymi koloniami promieniowców (twarde i skórzaste, z antenkowymi grzybniami zawierającymi zarodniki).

Określenie zakresu pH przydatnego dla wzrostu

Każdy z promieniowców zbadano na zdolność do wzrostu przy pH 5,5 do 8,0. Kultury przeszczepiono punktowo na płytki z agarem CYD, buforowano do pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 i 8,0 połączeniem buforów K2HPO4 i KH2PO4 w stężeniu 100 mM. Końcowe pH każdego środowiska ustawiono na wartość końcową tuż przed ogrzewaniem w autoklawie. Kultury zbadano na wzrost po 5 do 7 dniach inkubacji w temperaturze 25 lub 37°C. Płytki oceniono wizualnie jako wykazujące słaby wzrost lub nie wzrastające (±), pewien wzrost (+ lub ++) lub doskonały wzrost (+++).

Jak pokazuje tabela I, gleby ze środowiska korzeniowego dały prawie dwukrotnie więcej izolatów niż gleby ze środowiska niekorzeniowego. Każdy izolat testowano na wzrost na środowisku agaru CYD w zakresie pH od 5,5 do 8,0. Tylko 9 izolatów nie rosło przy pH 6,0, a

175 708 (21%) nie rosło przy pH 5,5. Spośród rosnących przy pH 5,5 w zależności od izolatu wzrost był od słabego do doskonałego. OKreślono też zdolność izolatów do silnego zarodnikowania na agarze CYD wizualnie i pod mikroskopem na koloniach inkubowanych 5-10 dni.

Tabela I

Selektywne środowisko
Gleba	pH gleby	YCED	WYE	Łącznie
Gleby niekorzeniowe	77
1	7,5	8	16	24
2	5, 4	5	6	11
6	7,2	20	8	28
7	7,4	13	1	14
Gleby korzeniowe	140
3	7,0	17	22	39
4	7, 6	32	33	65
5	6, 5	11	15	26
8	7,3	8	2	10
Izolaty łącznie	114	103	217

Test anatgonizmu w warunkach in vitro

Wybrano 82 izolaty uwzględniając ich zdolność do dobrego rośnięcia i silnego zarodnikowania na agarze CYD.

W celu zbadania zdolności izolatów do inhibicji wzrostu P. ultimum zastosowano test wykonany na płytce in vitro. Każdy promieniowiec był nanoszony na płytkach z agarem i mąką zbożową (CMA) jako posiew w postaci smugi od jednej strony do centrum. Hodowlę inkubowano wtemperaturze 25°C przez około 8 dni albo do zarodnikowania. Blok agaru CMA (0,5 cm ) zawierający aktywnie rosnącą grzybnię P. ultimum umieszczono aseptycznie w centrum płytki. Inkubację kontynuowano przez 96 godzin. Po 48 i 96 godzinach płytkę zbadano pod względem inhibicji wzrostu P.ultimum.

Inhibicję stwierdzano, gdy wzrost grzybniowy P. ultimum w kierunku kolonii promieniowców był opóźniony lub zatrzymany. Wyniki pokazuje tabela II.

175 708

Tabela II

Kultura	Źródło	Wzrost dla pH	Antagonizm	obserwowany3
	(gleba)	5,5 (+ lub -)	48 godzin	96 godzin
Antagonistyczne (96 godzin)
WYEC 108	8	+	++ +	+ + +
YCED 1	1	+	+ +	++
YCED 9	2	+	+ + +	+++
YCED 35	4	+	+	+
YCED 48	4	+	+	+
YCED 95	7	+	+	+
YCED 106	7	+	+ +	+++
WYE 21	4	+	+	+
WYE 22	4	+	+	+
WYE 30	4		+	+
WYE 31	4	+	-r	+
WYE 78	1	+	+ +	++
WYE 88	1	+	+	+
WYE 90	6	+	+++	+++
WYE 91	6	+	++ +	++ +
WYE 97	1	+	++	++

175 708 cd. tabeli II

MSSC 1	2	+	+	+
MSSC 2	2	+	+	+
Nieantagonistyczne (96 godzin)
WYE 6	1	+	+	—
WYE 9	3	+	-	—
WYE 11	3	+	+	—
WYE 12	4	+	+	—
WYE 13	4	+	—	—
WYE 20	4	+	—	—
WYE 23	3	+	—	—
WYE 2 7	4	—	—	—
WYE 2 8	3	+		—
WYE 29 ·	4	+	+	±
WYE 34	3	+	—	—
WYE 35	3	+	—	—
WYE 38	4	+
WYE 42	3	+
WYE 43	4	+	—	—
WYE 4 5	3	+		—
WYE 47	3	+
WYE 53	4	+	—	—
WYE 54	3	+	—	—
WYE 56	3	+
WYE 68	5	+		—
WYE 69	6	+	—	—
WYE 73	6	+		—
WYE 7 5	2	+	—	-

175 708 cd. tabeli II

WYE 77	2	+	+	±
WYE 8 4	2	+	—	—
WYE 8 5	2	+	-	—
WYE 93	1	+	—
WYE 94	1	+	-	__
WYE 120	8	+	—
WYE 121	7	+	—
YCED 11	1	+		—
YCED 15	4	+	—	-
YCED 16	4	+	—	-
YCED 17	3	+	—	—
YCED 25	4	+	—
YCED 28	4	+	—	—
YCED 29	3	+
YCED 30	3	+	—	—
YCED 31	3	+	—	—
YCED 32	4	+
YCED 41	4	+
YCED 44	4	+	±	—
YCED 54	4	+	—	—
YCED 56	4	+	—	—
YCED 62	5	+	—
YCED 64	5	—		—
YCED 71	5	+	—	-
YCED 73	5	+	—	-
YCED 85	6	—		—
YCED 88	5	+	-	-

175 708 cd. tabeli II

YCED 93	7	+		—
YCED 96	7	+		—
YCED 98	8	+	—	—
YCED 105	7	+	—	—
WYEC 101	4	+	—	—
WYEC 104	8	+	-	—
WYEC 107	7	—	+	—
WYEC 111	8	+	—	—
WYEC 113	8	+	+	±
WYEC 116	8	+	—
WYEC 118	7	+	—	—
CYPC 2	6	+
CYPC 5	6	+	—	—

Inhibicja P. ultimum zdefiniowana jako wzrost strzępek grzyba mniej obfity lub nieco opóźniony na obszarze płytki w kierunku boku, na której rosły promieniowce +++ Bardzo silna inhibicja ze strefą inhibicji >2,0 cm ++ Silna inhibicja ze strefą inhibicji >1,0 cm + Wzrost praktycznie opóźniony z oczywistą strefą inhibicji w pobliżu kolonii ± Słaba inhibicja P. ultimum (wzrost strzępek grzyba mniej obfity lub nieco opóźniony)

- Brak inhibicji

Po 96 godzinach pięć izolatów (WYEC 108, YCED 9, YWE 91, WYE 90 i YCED 106) wykazało bardzo silny antagonizm wobec P. ultimum, cztery izolaty (YCED 1, YCED 106, WYE 97 i WYE 98) wykazały silny antagonizm, 10 słaby antagonizm. Reszta izolatów nie wykazała antagonizmu lub wykazała go bardzo słabo. Kultury wyraźnie hamujące wzrost P. ultimum dzieliły się mniej więcej po połowie na pochodzące ze środowiska korzeniowego i pochodzące ze środowiska niekorzeniowego.

Siedemdziesiąt izolatów, które rosły przy pH 5,5 przetestowano także na ich antagonizm w warunkach in vitro wobec grzyba białej zgnilizny Phanerochaete chrysosporium na agarze z

175 708 mąką zbożową (CMA). Trzynaście z izolatów wykazało pewien stopień antagonizmu wobec grzyba białej zgnilizny, jak pokazuje tabela III. Stopień antagonizmu wahał się od silnego (+++) do względnie słabego (+), biorąc pod uwagę rozmiar strefy inhibicji. Pięć z kultur, które wykazywały antagonizm wobec P. chrysosporium (WYEC 108, WYE 78, 2YE 90, YCED 9 i MSSC 2) zbadano dalej na CMA wobec dodatkowego grzyba białej zgnilizny (coriolus versizolor) i dwu typów grzybów brunatnej zgnilizny (postia placenta i Gloeophyllum trabeum). Cztery izolaty (MSSC 2, YCED 9, WYE 90, WYEC 108) wykazały bardzo silny antagonizm wobec wymienionych wyżej grzybów białej i brunatnej zgnilizny. Jeden izolat, WYEC78, wykazał silny antagonizm tylko wobec dwu grzybów białej zgnilizny.

Tabela III

Kultura	Źródło (gleba)	Wzrost dla pH 5,5 (+ lub -)	Antagonizm obserwowany3
48 godzin	96 godzin
Antagonistyczne
WYEC 108b	8	+	++ +	+++
WYE 22	4	+	+ +	++
WYE 78C	1	+	+	+
WYE 90b	6	+	+ + +	+++
WYE 97	1	+	++	+ +
YCED 9b	2	+	+++	++ +
YCED 29	3	+	+	+
YCED 41	4	+	+	+
YCED 48	4	+	+	+
YCED 95	7	+	++	+
CYPC 2	6	+	++	+ +
CYPC 5	6	+	+	+
MSSC 2b	2	+	+++	+ +

Inhibicja P. chrysosporium zdefiniowana jako wzrost strzępek grzyba mniej obfity lub nieco opóźniony na obszarze płytki w kierunku boku, na której rosły promieniowce +++ Bardzo silna inhibicja ze strefą inhibicji >2,0 cm

175 708 ++ Silna inhibicja ze strefą inhibicji >1,0 cm + Wzrost praktycznie opóźniony z oczywistą strefą inhibicji w pobliżu kolonii ± Słaba inhibicja P . chrysosporium (wzrost strzępek grzyba mniej ołrfity lub nieco opóźniony)

- Brak inhibicji ^b Inhibicja Coriolus versicolor, Postia płacenia i Gloeophyllum trabeum poza

P. chrysosporium.

^c Inhibicja Postia placenta i Gloeophyllum trabeum poza P . chiysosporium.

Biotest in vivo w celu określenia aktywności izolatów promieniowców na sadzonkach sałaty

Zastosowano procedurę testu zwalczania biologicznego Lyncha i in. (1991, 1992) do testowania 12 izolatów na ich wpływ na kiełkowanie i wzrost sałaty (Latuca sativa).

Dla roślin kontrolnych doniczki plastykowe o średnicy 9 cm napełniono mieszanką glebową dla sałaty i dociśnięto szalką Petriego. Ziarno sałaty umieszczono na wierzchu, lekko wciskano w glebę i pokryto luźną mieszanką. Doniczki umieszczono na podstawkach na warstwie wody i inkubowano w ciemności w temperaturze 20 do 22°C do wyraźnego skiełkowania (około 3 dni). Przeniesiono je następnie na kapilarną matę w cieplarni w temperaturze 15 do 25°C i podlewano w miarę potrzeby. Liczbę skiełkowanych sadzonek w każdej doniczce liczono okresowo do 18 dnia.

W przypadku roślin traktowanych izolatami promieniowców napełniono mieszankę glebową zaszczepioną zarodnikami odpowiedniego promieniowca. Mieszankę glebową zaszczepiono zarodnikami z ukośnych hodowli na CYD do średniego poziomu 10⁸ do 10⁹ cfu/g (sucha masa) mieszanki. Wartość cfu/g mieszanki glebowej określono licząc żywotne kolonie na płytkach agarowych CYD w czasie szczepienia. Ziarno sałaty wysiano jak poprzednio, pokryto niewielką ilością zaszczepionej mieszanki glebowej i potraktowano identycznie jak próby kontrolne.

W przypadku roślin traktowanych poszczególnymi promieniowcami i gnilnym grzybem Pythium ultimum (szczep PuMXL, Lynch i in., 1991), mieszankę także zaszczepiono grzybowym patogenem w ilości około 200 sporangiów na gram (suchej masy) mieszanki. Zastosowano procedurę Lyncha i in. (1991, 1992) do wytworzenia sporangiów patogenu i zaszczepienia mieszanki glebowej. Sporangia policzono hemocytometrem, a patogenność szczepu P. ultimum potwierdzono przed użyciem metodą pasażu przez sałatę.

We wszystkich zabiegach doniczki przygotowano w powtórzeniach pięciokrotnych. W cieplarni doniczki ustawiano w przypadkowych blokach otaczanych przez rośliny strzegące, które służyły do zapewnienia jednorodności warunków i w celu działania jako bufory. W 18 dni po wysianiu, rośliny zebrano, zmierzono wielkość plonu, oraz zważono (masy mokre i suche, nadziemne liście i łodyga). Masy suche i mokre zarejestrowano jako całkowitą biomasę na doniczkę i jako średnią biomasę na doniczkę. Wartości podano jako średnie z pięciu powtórzeń ± odchylenie standardowe. Tak więc każda wartość oparta była na 50 nasionach posadzonych dla każdego zabiegu (5 powtórzeń po 10 nasion każde). Procent wzejścia i końcowe wartości wielkości plonu obliczono podobnie.

175 7Ο8

Tabela IV

Szczep promieniowców	stężenie x105 cfu/g	Liczba zdrowych roślin	Masa pędu
	suchego	na doniczkę	świeże	suche
	kompostu
		-P1	+ P1	-P1	+P1	-P1	+P1
kontrolna nieszczepiona	9,8	3,6	1,34	0,75	0, 074	0, 034
YCED 85	5,19	10,0	6, 6a	1,44	0,98	0, 087	0,054a
WYE27	3,02	10,0	5,0	1,54	0,72	0,090	0,039
YCED 64	3,21	1- kO OO	5,6a	1, 44	0,91	0,084	0,057a
WYEC 107	2,88	9,8	5,6a	1, 68a	0,81	0,096a	0,041
WYE41	1,18	10,0	4,2	1,45	0,73	0,087	0, 047
YCED 106	1, 30	10, 0	5, 4a	1,49	0,69	0,088	0,040
YCED 71	5,25	10,0	6,2a	1,42	0, 85	0, 082	0,050
WYE 88	1,44	10,0	6,2a	1, 42	0,73	0, 082	0,042
MSSC 1	2, 13	9,8	4,6	1, 38	1,16a	0, 079	0,060a
WYE 21	9,56	10, 0	6, 6a	1,49	1,09a	0,091	0,059a
WYE 30	18,90	10,0	5,0	1,53	0,86	0,088	0,046
WYE 28	0,18	10,0	3,6	1,39	0,90	0,079	0, 049

P1 P. ultimum : 200 sporangiów na g suchej masy mieszanki

Gdzie:

n = średnia liczbazdrowych roślin na doniczkę ze wszystkich 5 powtórzeń po 10 roślin ^a Znacząco różne od odpowiedniej kontrolnej wartości na poziomie istotności

P = 0,05.

Stopni swobody =100

W nieobecności patogenów (oznaczonej jako -P1, w tabeli IV) nie stwierdzono znaczących różnic pomiędzy doniczkami z roślinami szczepionymi promieniowcami i próbami kontrolnymi (bez promieniowców) w procentowej ilości nasion dających zdrowe rośliny. Kiełkowanie i wzrost osiągnęły we wszystkich przypadkach >98%. Jednak obecność promieniowców opóźniała niekiedy wzrost z nasiona o 1 do 3 dni (dane nie pokazane). Podobnie w nieobecności patogenów zwykle nie było znaczącej różnicy pomiędzy roślinami szczepionymi promieniowcami i próbami kontrolnymi pod względem masy pędu, zarówno suchej, jak i mokrej. Wyjątkiem

175 708 były 4 doniczki szczepione WYEC 107, u których obecność promieniowców znacznie polepszała wydajność biomasy.

W obecności patogenu (+P1) liczba roślin na doniczkę wynosiła średnio 3,6 z 10 w doniczkach kontrolnych w porównaniu z 9,8 z 10 w doniczkach bez patogenu. W obecności specyficznych promieniowców w doniczkach zaszczepionych patogenem znacząco zwiększyła się liczba zdrowych roślin.

Siedem z dwunastu promieniowców (YCED 85, YCED 64, WYEC107, YCED 106, YCED 71, WYE 88 i wYe 21) znacząco zwiększały wydajność zdrowych roślin. Spośród wymienionych YCED 85, YCED 64 i WYE 21 także znacząco zwiększały wydajność suchej masy roślin względem, zawierających tylko patogen, roślin kontrolnych. WYE 21 także znacząco zwiększał wydajność świeżej masy roślin względem, zawierających tylko patogen, roślin kontrolnych. Jeden ze szczepów, który nie poprawiał znacząco liczby zdrowych roślin (MSSC 1), zwiększał znacząco wydajność świeżej i suchej masy pędów roślin (tabela IV, kolumny 5 i 7. Tak więc MSSC 1 może się okazać przydatny do ochrony roślin przed niższymi dawkami P. ultimum niż stosowanej tutaj.

Przykład II. Wydzielanie Streptomyces WYEC 108.

Szczep WYEC 108 zidentyfikowano jako gatunek Streptomyces na podstawie morfologicznej charakterystyki rodzaju Streptomyces, jak definiuje Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986). WYEC 108 jest nitkowatą bakterią wytwarzającą łańcuchy zarodników w antenkowych grzybniach. Jak opisano powyżej, Streptomyces WYEC 108 wydzielono jako jeden ze szczepów promieniowców z gleby pobranej z ośmiu różnych miejsc w Wielkiej Brytanii. Wraz z innymi promieniowcami Streptomyces WYEC 108 wydzielono metodą kolejnych rozcieńczeń i wymazów na płytkach z gleby ze środowiska korzeniowego związanego z korzeniami lnu z pół Hastings Hill, South Downs, West Sussex, Anglia. Rozcieńczenia (10~⁵ do 10‘⁷) tej gleby umieszczano na płytkach na agarowym środowisku do wydzielania WYE. Płytki z rozcieńczeniami inkubowano w temperaturze 25°C przez 4 do 10 dni, aby pozwolić koloniom na rozrost i zarodnikowanie. Kolonie pobierano następnie i rozmazywano na płytkach z agarem WYEC w celu oczyszczenia. Czyste kolonie WYEC 108 przenoszono z tych płytek na ukośne kultury z agarem CYD, inkubowano w temperaturze 25°C do zarodnikowania i przechowywano w temperaturze 4°C aż do użycia. Kultury podstawowe przenoszono co 3 do 4 tygodni.

Identyczność Streptomyces WYEC 108

Jak opisano powyżej, wyizolowane szczepy promieniowców zbadano na ich zdolność do dobrego rośnięcia i silnego zarodnikowania na agarze CYD. Następnie pewną liczbę izolatów zbadano na zdolność do inhibicji wzrostu, w warunkach patogenu roślin Pythium ultimatum. Izolaty zbadano też w warunkach in vitro na zdolność do antagonizmu wobec grzybów białej zgnilizny Phanerochaete chrysosporium i Coriolus versicolor i grzybów brunatnej zgnilizny Postia placenta i Gloeophyllum trabeum. W wyniku tych testów wybrano jeden z tych szczepów, nazwany Streptomyces WYEC 108, w oparciu o jego korzystną charakterystykę.

Kolonie Streptomyces WYEC 108 hodowane na płytkach ze środowiskiem kwasy kazaminowe/ekstrakt drożdży/glukoza (CYD) zbadano pod mikroskopem elektronowym. Próbki przygotowano w następujący sposób:

(1) kolonie Streptomyces WYEC 108 na płytkach z CYD pokryto 1,5% roztworem aldehydu glutarowego w 0,2 M roztworze buforu kakodylanu sodu i utrwalano przez co najmniej 2 godziny;

(2) kolonie całkowicie przemyto (2 x) 0,2 M roztworem buforu kakodylanu sodu odciągając poprzedni płyn pipetą i zastępując go roztworem bufora. Zachowano ostrożność, aby upewnić się, że próbka nie wyschła;

(3) kolonie usunięto pobierając bryłki agaru z koloniami;

(4) bryłki umieszczono w indywidualnych pojemnikach sitowych i odwodniono 100% etanolem (2 x) (J.T. Baker Inc., Phillipsberg, Nj);

(5) próbki osuszono następnie w temperaturze krytycznej stosując bombę i umieszczono w pojedynczych pręcikach do próbek stosując koloidową srebrną farbę przewodzącą. Powleczono je złotem/palladem 60/40 i obserwowano pod skanującym mikroskopem elektronowym.

175 708

Figura 1 przedstawia mikrofotografie ze skanującego mikroskopu elektronowego pokazujące łańcuchy spiral (u góry) i powierzchnię zarodników (dół) Streptomyces WYEC 108. Obserwowana powierzchnia zarodników była względnie gładka.

Określono różne fizjologiczne cechy: szczep WYEC 108 nie wytwarza melaminy lub H2S odpowiednio na agarze pepton-drożdże-żelazo i agarze pepton-żelazo (Difco Lab. Detroit, Michigan). Kolor masy zarodników Streptomyces WYEC 108 na CYD był szary. Szczep ten nie wzrastał w temperaturze 45°C. Streptomyces WYEC 108 może należeć do gatunku Streptomyces lydicus zgodnie z definicją Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (1986). Odpowiednio organizm ten można określać jako Streptomyces lydicus WYEC 108. W skrócie określa się go tutaj nazwą Streptomyces WYEC 108 lub po prostu WYEC 108.

Numer dostępu ATCC

Depozytu Streptomyces WYEC 108 dokonano na warunkach Układu Budapeszteńskiego w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD 29 czerwca 1993. Szczep oznaczono numerem dostępu ATCC 55445.

Wytwarzanie kultur podstawowych Streptomyces WYEC 108

Do krótkoterminowego stosowania Streptomyces WYEC 108 inkubowano na agarze CYD lub ukośnej hodowli na agarze do zarodnikowania w temperaturze 25°C aż do zarodnikowania i pozostawiano do użycia w temperaturze 4°C. Do długoterminowego przechowywania kultur wytworzono 10 ml zawiesiny zarodników z jednej ukośnej hodowli agarowej lub płytki w 10 ml sterylnego środowiska YGM. Zawiesinę zaszczepiono kolby Erlanmayera 250 ml zawierające 100 ml YGM (ekstrakt drożdży/glukoza/sole mineralne). Kolby inkubowano z wytrząsaniem przy szybkości 250 obrotów na minutę przez 32-36 godzin w temperaturze 30°C dla wytworzenia standardowej mieszaniny szczepiącej.

Próbki wyrośniętej na YGN standardowej mieszaniny szczepiącej zastosowano także do wytwarzania glicerynowych kultur odpowiednich do długoterminowego przechowywania w temperaturze -70°C i do liofilizacji.

Przykład III. Antagonizm in vitro Streptomyces WYEC 108 wobec grzybowych patogenów roślin.

Zdolność Streptomyces WYEC 108 do inhibicji wzrostu pewnej liczby wybranych grzybkowych patogenów roślinnych zmierzono w kategoriach inhibitacji kolonii. Streptomyces WYEC 108 zaszczepiono pasmowo na jednej stronie aż do środka płytek z agarem z mąką zbożową (CMA) (Difco Lab., Detroit, Michigan). Zaszczepione płytki inkubowano w temperaturze 25°C przez około 8-12 dni aż do zarodnikowania kultur. Zarodnikowanie wykryto obserwując gołym okiem szarą masę antenkowej grzybni i zarodników. Zarodnikowanie obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym (x 1000). Pobrano tarczkę agaru CMA o średnicy 5 mm zawierającą aktywnie rosnącą grzybnię specyficznego grzybowego patogenu roślin z przedniego skraju kultury grzyba i umieszczono aseptycznie w centrum płytki agarowej. Płytki inkubowano w temperaturze 25°C, aż badany grzyb osiągnął skraj płytki kontrolnej nie zawierającej Streptomyces WYEC 108. Inhibicję wzrostu grzyba zmierzono określając stosunek radialnego wzrostu grzybowego patogenu roślin pod wpływem Streptomyces WYEC 108 do wzrostu samego patogenu na kontrolnej płytce. Procent inhibicji zarejestrowano po 48, 96 i 192 godzinach inkubacji w zależności od patogennego grzyba. Biotest powtarzano na pięciu płytkach, inhibicję mierzono oddzielnie i rejestrowano jako średnią ± standardowe odchylenie.

Wyniki testów in vitro podaje tabela V. Dane te pokazują, że Streptomyces WYEC 108 wykazuje bardzo silny antagonizm wobec szerokiego spektrum grzybowych patogenów roślin, w tym gnicia (Pythium ultimum), zgnilizny korzeni (Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Fusarium solani i Phytophthora cinnamomi), białej zgnilizny (Phanerochaete chrysosporium i Coriolus versicolor), brunatnej zgnilizny (Postia placenta i Gloeophyllum trabeum) oraz zgnilizny liści i łodyg (gatunki Sclerotinia).

155 508

Tabela V

Patogeny grzybowe	% inhibicji±odchylenie standardowe3
zaobserowane	antagonizmy0
48 godzin	96 godzin
Pythium irregulare	700±0,0	100±0, 0
Pythium ultimum	100±0,0	100±0,0
Rhizoctonia solani	700±0,0	84±0,0
Fusarium oxysporum	2β±2,5	26±3, 6
Fusarium sambucinetum	44±2,4	35±2,4
Fusarium solani	36±2,5	19±2,5
Phytophthora capsici	700±0,0	100±0,0
Phytophthora cinnamomi	100±0,0	100±0,0
Phytophthora parasitica	700±0,0	100±0,0
Selerotinia cepivorum	100±0,0	95±1,5
Selerotinia selerotiorum	700±0,0	100±0,0
Phanerochaete chrysosporium	700±0,0	100±0,0
Coriolus versicolor	100±0,0	100±0,0
Postia placenta	100±0,0C	100±0,0d
Caldariomyces fumago	700±0, 0C	100 + 0,0d
Gloeophyllum trabeum	100±0,0C	1000,0d
Geotrichum candidum	47±2,1	45±2,1
Verticillium dahliae	73±2,0C	59±2,0d

a Wartości oparte na średnich z indywidualnych wartości z pięciu powtórzeń na płytkach. Indywidualne wartości określono odrębnie mierząc wzrost grzybni na każdej płytce.

Inhibicja grzybowych patogenów zdefiniowana jako wzrost strzępek grzyba pod wpływem Streptomyces WYEC 108 względem wzrostu na kontrolnych płytkach CMA.

c d i % inhibicji, odpowiednio po 96 i 192 godzinach.

175 708

Przykład IV. Stosowanie Streptomyces WYEC 108 do zabiegów na nasionach.

Skuteczność komórek Streptomyces WYEC 108 w ochronie roślin przed roślinnymi patogenami określono stosując szczep WYEC 108 na nieskiełkowanych nasionach grochu włoskiego i wysiewając nasiona w glebie zainfekowanej grzybowymi patogenami roślin P. ultimatum i P. irregulare. Pozakomórkowe metabolity wytwarzane przez szczep WYEC 108 ekstrahowano z hodowli metodą ekstrakcji eterowej.

Określono także wpływ tych metabolitów na zakażenie grzybowe wschodzących sadzonek grochu włoskiego.

Wzrost Streptomyces WYEC 108

W celu wyhodowania komórek szczepu WYEC 108 komórki, 1 l kolby Erlenmeyera zawierające 500 ml YGM (pH 7,1-7,2) zaszczepiono 20 ml kultury podstawowej i inkubowano z wytrząsaniem przy szybkości 250 obrotów na minutę w temperaturze 30°C przez 3 dni w celu wytworzenia masy komórkowej. W celu wytworzenia metabolitów przeciw-grzybowych 1 l kolby Erlenmeyera zawieraj ące 500 ml CYD (pH 7,1 -7,2) zaszczepiono 20 ml kultury podstawowej i inkubowano z wytrząsaniem przy szybkości 250 obrotów na minutę w temperaturze 30°C przez 7 dni.

Zabieg na nasionach przy użyciu Streptomyces WYEC 108 i przeciwgrzybowych metabolitów.

Zawiesinę grzybniową Streptomyces WYEC 108 zebrano metodą odwirowania przy szybkości 5000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut z trzydniowej kultury 500 ml z yGm. Zebrane grzybnie umieszczono w zawiesinie w 200 - 300 ml sterylizowanego 3% (wagowo/objętościowo) roztworu alginianu sodu do gęstości hodowli 1,0-1,2x10⁴ cfu/ml. Nasiona grochu włoskiego dodano do dobrze mieszanej zawiesiny komórek i alginianu i nasiona przeniesiono po jednym do sterylizowanego roztworu 0,25 M CaCi? w wodzie destylowanej. Nasiona zastosowano w teście biologicznego zwalczania opisanym poniżej.

Metabolity przeciwgrzybowe wytwarzane przez Streptomyces WYEC 108 otrzymano w oczyszczonej postaci w poniższy sposób. Siedmiodniową kulturę 500 ml przesączono w celu usunięcia komórek i następnie ekstrahowano 150 ml eteru stosując lejek ekstrakcyjny. Eter usunięto przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem i powstałe ekstrakty rozpuszczono w 1,5 ml wody destylowanej. Roztwór wysterylizowano przez przesączenie przez filtr 0,45 gm i dodano do 10 ml 3% (wagowo/objętościowo) roztworu alginianu sodu. Oczyszczone metabolity przeciwgrzybowe można stosować do ochrony roślin przed zakażeniami grzybowymi. Korzystnie metabolity przeciwgrzybowe będą oczyszczane w taki sposób, aby były całkowicie wolne od komórek WYEC 108. Jednak kompozycja komórek i/lub zarodników WYEC 108 wraz z przeciwgrzybowymi metabolitami jest także uważana za skuteczną wobec grzybowych patogenów roślin. Przeciwgrzybową zawiesinę metabolit-alginian podawano w opisany sposób na nasiona grochu włoskiego w sposób opisany w teście biologicznego zwalczania.

Test biologicznego zwalczania w warunkach in vivo

Glebę naturalnie zainfekowaną P.ultimum i P. irregulare opisano w części Substancje i metodyka. Glebę tę zastosowano w testach biologicznego zwalczania w warunkach in vivo. Odczyn pH gleby określono na 5,6 starannie mieszając zawiesinę gleba/papka wodna (1:1), pozwalając osiąść częściom przez 2 godziny i badając pH roztworu supernatanta. Glebę rozdrobniono, zmieszano starannie i umieszczono w doniczkach do sadzonek (10 cm głębokości i 10 cm średnicy).

Test biologicznego zwalczania in vivo przeprowadzono sądząc w niezainfekowanej glebie nieskiełkowane nasiona grochu włoskiego potraktowane Streptomyces WYEC 108 lub przeciwgrzybowymi metabolitami.

Nietraktowane nasiona umieszczone w tej samej glebie zastosowano jako kontrolne. Procedura obejmowała następujące kroki:

1) Jeden cm torfowca umieszczono na dnie każdej doniczki w celu zabezpieczenia się przed utratą gleby przy jednoczesnym napowietrzaniu i drenażu;

2) Doniczki napełniono zainfekowaną glebą;

3) Glebę nawodniono do nasycenia od strony dennej. Po nasyceniu powierzchni gleby, nietraktowane i traktowane nasiona grochu włoskiego umieszczono w glebie i pokryto 1,5-2,0

175 708 cm tej samej gleby. Pozwolono aby dodana gleba zwilżyła się w sposób kapilarny, od strony umieszczonej poniżej wilgotnej gleby. Nasiona posadzono w każdej z trzech jednakowych doniczek. Do gleby nie dodawano nawozu. W celu minimalizacji wysychania i tworzenia skorupy doniczki przykryto czystym tworzywem aż do czasu wzejścia sadzonki. Po wzejściu sadzonek, wierzch doniczek spryskiwano w razie potrzeby. Doświadczenia prowadzono w cieplarni w temperaturze 15-30°C przy cyklu oświetlenia 12 godzin dnia i 12 nocy (16000 lx).

Okresowo zliczano wzeszłe sadzonki, a końcowe przeliczenie wykonano po 20 dniach. Dane te były średnimi z każdego rodzaju zabiegu. Zdolność Streptomyces WYEC 108 do działania jako biologiczny czynnik zwalczający oceniano na podstawie całkowitej liczby wzejść, wysokości roślin, masy świeżych roślin, w porównaniu z kontrolnymi roślinami rosnącymi z nasion nietraktówanych środkiem biologicznego zwalczania. Wyniki testu biologicznego zwalczania pokazano w tabeli VI.

Tabela VI

Zabieg	Gnicie (%)	Kiełkowanie (%)	Wysokość (cm)	Świeża masa (g/roślina)
Przed wzejściem	Po wzejściu
kontrolna	86, 7	6, 6	6,7	4,3X	0, 34x
Streptomyces	36, 7	O o	63, 3	11, 3	1,05
WYEC 108C
3% alginianud	83, 3	10, 0	6,7	4,1x	0,32x
przeciwgrzy-	63, 3	3,3	33,3	8,9	0, 66
bowe metabo-
lityc

^c w 3% alginianie jako powłoce na nasionach ^d nie zawiera WYEC 108 ^x tak zaznaczone średnie w kolumnie nie były znaczące.

Zarówno komórki Streptomyces WYEC 108, jak i przeciwgrzybicze metabolity powstające w tych komórkach zmniejszały intensywność gnicia grochu włoskiego spowodowanego przez Pythium.

Rośliny wykazywały żywiołowy wzrost, gdy nasiona pokryto komórkami Streptomyces WYEC 108. Znacznej redukcji ulegała wysokość i masa świeżych roślin wyrastających z kontrolnych (nietraktowanych) nasion grochu włoskiego w porównaniu z roślinami kiełkującymi z nasion pokrytych komórkami Streptomyces WYEC 108. Wschodzenie nietraktowanych nasion grochu włoskiego było bardzo zredukowane (6,7% wzejść) ze względu na zgniliznę korzeni i gnicie przed wzejściem powodowane przez P. ultimum, gdy nasiona sadzono w glebie naturalnie infekowanej P. ultimum i P. irregulare. W przeciwieństwie do tego, wschodzenie nasion traktowanych Streptomyces WYEC 108 zachodziło w 63,3%. Nasiona traktowane tylko alginianem nie wykazały zwiększenia liczby wzejść. Objawy typowe dla zgnilizny korzeni Pythium, w tym utraty włosów i odbarwienia korzenia, były widoczne na zebranych korzeniach

175 708 grochu włoskiego z nasion kontrolnych, ale objawy te nie występowały w przypadku roślin wyrosłych z nasion traktowanych komórkami Streptomyces WYEC 108. W próbach kontrolnych uszkodzenia grochu włoskiego miały głównie postać psucia się nasion i gnicia przed wzejściem. Sadzonki grochu włoskiego, które wschodziły i rosły, były skarłowaciałe, a ich korzenie silnie zainfekowane P. ultimum. Figura 2 przedstawia porównanie roślin grochu włoskiego z testu biologicznego zwalczania. Kontrolna roślina, pokazana po lewej stronie, kiełkująca z nietraktowanego nasiona, wykazuje daleko posuniętą infekcję korzenia i brak wtórnych korzeni i włosków korzeniowych, a roślina wschodząca z nasiona powleczonego Streptomyces WYEC 108 pokazana po prawej wykazuje dobry wzrost i normalnie utworzone wtórne korzenie i włoski korzeniowe.

Wschodzenie nasion grochu włoskiego traktowanych przeciwgrzybowym metabolitem w postaci rozpuszczalnego w eterze metabolit było intensywniejsze (33,3%) niż nasion kontrolnych (6,7%), ale niższe niż nasion traktowanych komórkami Streptomyces WYEC 108 (63,3%). Rośliny wschodzące z nasion traktowanych przeciwgrzybowym metabolitem wykazywały żywiołowy wzrost, miały dłuższe korzenie i większą gęstość włosków korzeniowych w porównaniu z roślinami kontrolnymi.

Przykład V. Wpływ Streptomyces WYEC 108 na infekcję korzeni i zgniliznę nasion spowodowane Pythium ultimum.

Sadzonki grochu włoskiego, jak opisano w przykładzie IV, w glebie naturalnie infekowanej Pythium ultimum, ze wstępnym traktowaniem lub bez traktowania WYEC 108 zbadano w celu określenia wpływu szczepu WYEC 108 na infekcję P. ultimum.

Infekcję korzeniową P. ultimum zbadano na kontrolnych (traktowanych) sadzonkach grochu włoskiego zebranych po 20 dniach wzrostu. P. ultimum powodujący zgniliznę korzeni wyizolowano także z uszkodzonych korzeni roślin kontrolnych. Wydzielanie P. ultimum prowadzono spłukując najpierw glebę z korzeni grochu włoskiego (korzonków i włosków korzeniowych) wodą z kranu, a następnie przemywając dwukrotnie sterylną wodą destylowaną. Odbarwione i zgniłe korzenie pocięto brzytwą w warunkach aseptycznych i umieszczono na 3 dniowych płytkach z 2 % agarem wodnym. Płytki inkubowano przez 24-48 godzin w temperaturze pokojowej i obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym (x 40). P. ultimum wyhodowany z zarażonych korzeni grochu włoskiego poddano hodowli na płytkach z 2% agarem wodnym i zidentyfikowano zgodnie z poprzednim opisem (Ingram i Cook, 1990).

Zgniliznę korzeni powodowaną przez P. ultimum przestudiowano na uszkodzonych kontrolnych nasionach zebranych po 20 dniach. Część zgniłych nasion umieszczono w warunkach aseptycznych na 3-dniowych płytkach z 2% agarem wodnym przy pomocy sterylizowanej wykałaczki i inkubowano przez 24-28 godzin w temperaturze pokojowej, następnie zbadano je jak opisano powyżej.

Zaobserwowano, że Pythium infekuje korzenie nietraktowanych nasion grochu włoskiego rosnące w naturalnie zainfekowanej glebie. P. ultimum był przeważającym gatunkiem wydzielanym ze zgniłych nasion i korzeni. P. irregulare był gatunkiem najrzadziej obserwowanym.

Kolonizację korzeni przez Streptomyces WYEC 108 badano na korzeniach 20-dniowych roślin grochu włoskiego, kiełkujących z nasion traktowanych komórkami Streptomyces WYEC 108, w zawiesinie w alginianie opisanej w przykładzie II. Rośliny usunięto z doniczek i łagodnie przemyto wodą z kranu w celu usunięcia gleby korzeniowej. Następnie przemyto je sterylną wodą destylowaną. Próbki korzeni przygotowano do mikroskopii umieszczając część korzenia na szkiełku, dodając kroplę błękitu metylenowego i następnie przykrywając szkiełkiem pokrywkowym. Przygotowane próbki obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym (x 1000).

Streptomyces WYEC 108 obecne na nasiona stykają się z wyrastającymi korzeniami. W czasie ich wydłużania Streptomyces przenosi się wzdłuż wydłużających się włosków i stożków. Zaobserwowano, że Streptomyces WYEC 108 w szerokim zakresie kolonizował korzeń główny, korzenie wtórne, włoski korzeniowe i stożki. Rośliny wyrastające z nasion powlekanych Streptomyces WYEC 108 były zdrowsze, miały dłuższe korzenie i włoski korzeniowe i występowały z większą gęstością niż na roślinach kontrolnych wyrastających z nasion nie powlekanych WYEC 108. Różnica ta była wyraźnie związana z kolonizacją korzeni przez środek biologicz175 708 nego zwalczania. Korzenie skolonizowane przez ten środek nie wykazywały żadnych objawów chorób korzeni. Streptomyces WYEC 108 doskonale kolonizował korzeń w obecności współzawodnictwa tubylczej mikroflory korzeniowej.

Aktywność przeciw grzybicza

Poza zdolnością Streptomyces WYEC 108 do kolonizacji korzeni roślin i wytwarzaniem przeciwgrzybiczych metabolitów, zaobserwowano, że WYEC 108 rozpuszcza ścianki komórkowe i oospory grzybów. Stosując skaningową mikroskopię elektronową wykazano, że grzybnie Streptomyces WYEC 108 kolonizuj ą powierzchnię nici grzybów lub oospor, w tym nici grzybów lub oospor Pythium ultimum. Skolonizowane nici grzybów lub oospor są degradowane przez Streptomyces WYEC 108, najprawdopodobniej wskutek wydzielania zewnątrzkomórkowych enzymów przez WYEC 108, takich jak chitynazy i celulazy. Wykazano, że Streptomyces WYEC 108 wytwarza oba te enzymy. Możliwe, że Streptomyces WYEC 108 także wytwarza inne zewnątrzkomórkowe enzymy degradacyjne.

Przykład VI. Umieszczanie Streptomyces WYEC 108 w środowisku do zabiegów.

Kompozycję nadającą się do długoterminowego przechowywania zawierającą żywotne zarodniki Streptomyces WYEC 108 i do stosowania do zabiegów agrotechnicznych wytworzono w następujący sposób.

Jedną litrową kolbę Erlenmeyera zawierającą 500 ml YGM (pH 7,0-7,1) zaszczepiono 20 ml kultury podstawowej i inkubowano z wytrząsaniem przy szybkości 250 obrotów na minutę w temperaturze 30°C przez 3 dni. Po inkubacji kulturę zebrano metodą odwirowania przy szybkości 5000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut. Zebraną substancję umieszczono w zawiesinie w 1600 ml 10% YGM i zawieszano z 8 g sterylizowanego NH4Cl rozpuszczonego w 400 ml wody destylowanej. Dwa litry mieszaniny komórek i NHąCl zaszczepiono w plastykowym pojemniku zawierającym 4 kg sterylizowanego środowiska do zabiegów złożonego z mieszaniny piasek-woda-mąka zbożowa w stosunku 9-2-1 (wagowo). Środowisko do zabiegów sterylizowano dwukrotnie (3 godziny w temperaturze 121°C) przed inkubacją kultury. Mieszaninę inkubowano przez 10-14 dni w temperaturze 25°C w celu zmaksymalizowania liczby zarodników w mieszaninie. Streptomyces WYEC 108 wytwarzał zarodniki w czasie 10-14 dniowej inkubacji, co spowodowało zwiększenie cfu/g środowiska do zabiegów (do średniej 108 do 10⁹ cfu/g w środowisku (sucha masa)). Mieszaninę przechowywano następnie w temperaturze 4°C przed użyciem.

Alternatywnie zamiast środowiska YGM komórki i zarodniki można wytwarzać w środowisku CYG. Jako alternatywę do odwirowania kolby z hodowlą, można ją także odstawiać do osadzenia grzybni i zarodników bakterii. Następnie czysty supernatant dekantuje się i zatężoną zawiesinę grzybnia/zarodniki szczepi bezpośrednio w środowisku do zabiegów. Gdy korzysta się z takiej metody zbierania, nie jest konieczne dodawanie NH4CI do środowiska, ponieważ środowisko wzrostu bakterii (YGM lub CYG) jest odpowiednim źródłem azotu.

Przykład VII. Wpływ Streptomyces WYEC 108 na wschodzenie i masę świeżych sadzonek sałaty.

W celu określenia wpływu Streptomyces WYEC 108 na wzrost sałaty nasiona sałaty, hodowano albo w środowisku do zabiegów zawierającym Streptomyces WYEC 108 jak w przykładzie VI powyżej, albo w glebie sterylizowanej parą wodną. Łącznie 30 nasion posadzono w każdym ze środowisk wzrostu (jedno nasiono na doniczkę 4 x 13,5 cm) i notowano wzejścia po 21 dniach. Masę świeżych roślin określono po 35 dniach po zebraniu ich, znad powierzchni gleby. Masę świeżych roślin określono jako wartość średnią. Wyniki pokazano w tabeli poniżej.

175 708

Tabe 1 a VII

Zabieg	Liczba wschodzących roślin	wzejścia (%)	Świeża masa ZL . )
7 dzień	9 dzień	21 dzień
Sterylne gleba + nasiona	13	17	21	(21/30) 70	0, 81
Środowisko + WYEC 108 + nasiona	23	27	29	(29/30) 97	1,41

Wyniki wskazują, że zabieg na nasionach sałaty Streptomyces WYEC 108 polepsza zarówno liczbę wzejść, jak i masę świeżych roślin.

Przykład VIII. Stosowanie Streptomyces WYEC 108 w środowisku do zabiegów na polu.

Przeprowadzono test zwalczania biologicznego in vivo w celu określenia skuteczności Streptomyces WYEC 108 jako środka zwalczania biologicznego po wprowadzeniu go do opisanego wyżej środowiska do zabiegów.

Streptomyces WYEC 108 wytworzono i włączono do środowiska do zabiegów w sposób opisany w przykładzie VII powyżej, stosując Streptomyces WYEC 108 hodowane przez 3 dni w środowisku YGM. Początkowa populacja Streptomyces WYEC 108 wynosiła około 1,0-1,2 x 10⁵ cfu/g gleby po obliczeniu na płytkach CYD bezpośrednio przed posadzeniem sadzonek w doniczkach. Potraktowaną glebę zastosowano do wypełnienia doniczek (4 x 13,5 cm).

Kontrolne rośliny hodowano w doniczkach zawierających glebę sterylizowaną parą wodną (w temperaturze 100°C przez 60 minut).

Sadzonki papryki (zielona ostra papryka) posadzono w doniczkach z glebą sterylizowaną parą wodną lub z mieszaniną gleby sterylizowanej parą wodną zaszczepionej środowiskiem do zabiegów zawierającym Streptomyces WYEC 108. Po 6 tygodniach hodowli w cieplarni rośliny przeniesiono na pole. W pewnych przypadkach przed przeniesieniem 100 g środowiska do zabiegów, zawierające 450± 17 cfu/g Phytophthora parasitica dodawano do otworu na sadzonkę.

Wysokości roślin określono 55 dni po przeniesieniu i zarejestrowano jako średnie. Biomasę roślin określono zbierając i mierząc masę świeżych roślin po 110 dniach od przeniesienia. W tym czasie liczbę utworzonych owoców papryki na każdej roślinie i ich wagę zarejestrowano jako wartość średnią. Wyniki testu polowego podano w tabeli VIII.

175 708

T a b e 1 a νίΠ

Zabieg	Wysokość rośliny (cm)	Masa świeżej bimasy (g/roślinę))	% papryki na roślinę	Wydajność papryki świeżej (g/roślinę)
^Kontrola nietraktowana	22,4k7	274,lkV	19,lk^	158,8ky
cZabieg WYEC 108	29,lm	353,3m	36, 5m	279,8m
^nietraktowane + P. para- sitica^	20,3k	238,5k 13,8k	13,8k	151.2k
cZabieg WYEC 108 + P. para- sitica^	28,6m	266,6k 22,7k	22,7	221,6k

^b Rośliny papryki rosnące w doniczkach (4 cm x 13,5 cm) zawierające tylko glebę sterylizowaną parą wodną.

^c Rośliny papryki rosnące w doniczkach zawierające mieszaninę gleby sterylizowanej parą wodną i środowiska do zabiegów z Streptomyces WYEC 108.

100 g środowiska do zabiegów z Phytophthora parasitica wprowadzono do otworu przed przeniesieniem (450± 17 cfu/g środowiska do zabiegów) ^y Średnie w kolumnie przed taką samą literą nie są znacząco różne na poziomie istotności P=0,05.

Jak pokazuje tabela VIII, zabieg na sadzonkach papryki WYEC 108 w nieobecności P. parasitica dał statystycznie znaczące zwiększenie wysokości roślin, biomasy, liczby owoców papryki i wydajności papryki w porównaniu z kontrolnymi roślinami nie otrzymującymi WYEC 108. Porównanie wiersza 3 i 4 tabeli V pokazuje, że szczep WYEC 108 chronił paprykę przed szkodliwym działaniem P. parasitica. Ponadto zaszło znaczne polepszenie wzrostu roślin traktowanych szczepem WYEC 108 w nieobecności P. parasitica w porównaniu z roślinami nietraktowanymi i bez P. parasitica.

Poza doświadczeniami opisanymi w tym przykładzie WYEC 108 okazał się skuteczny w chronieniu szeregu roślin przed zakażeniami grzybowymi. Testowane rośliny obejmują rośliny wymienione w poniższej tabeli IX.

175 708

Tabela IX

Uprawy chronione przed grzybicą przez WYEC 108 Rośliny testowane z wYEc 108^a

Roślina	Test polowy (+/-)	Test szklarniowy- /laborat. (+/-)
sałata	—	+
groch włoski	—	+
groszek zielony		+
papryka	+	—
bawełna	+	+
trawa	+	+
cebula	+	+
ziemniak	+	+

^a Testy prowadzono albo w cieplarni, albo na polu, albo w obu miejscach. W testach porównywano rośliny traktowane WYEC 108 z nietraktowanymi kontrolnymi i/lub traktowanymi WYEC 108 i konkretnym patogenem grzybowym (Pythium, Aphanomyces, Rhizoctonia, Fusarium, Phytophthora lub Phytomatotrichum). W każdym przypadku WYEC 108 chronił rośliny przed zakażeniami grzybowymi.

Przykład IX. Wytwarzanie zarodników Streptomyces WYEC 108 w ciekłym środowisku.

Środki zwalczania biologicznego muszą potrafić przetrwać przez dłuższy czas, aby sprostać wymaganiom związanym z transportowaniem i okresami zabiegów rolniczych. Stosowanie zarodników szczepu WYEC 108, a nie wegetatywnych komórek, w konkretnych kompozycjach do zwalczania biologicznego wydłuża czas przechowywania kompozycji, ponieważ zarodniki zachowują żywotność w trudnych warunkach i przez dłuższy czas.

Typowo zarodniki gatunków Streptomyces są wytwarzane na stałych środowiskach. Jednak, jak podano dalej, poniższy sposób okazał się odpowiedni do wytwarzania zarodników w ciekłej kulturze.

Kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l zawierające 1200 ml środowiska YGM (pH 6,5) zaszczepiono 50 ml podstawowej hodowli (wytworzonej jak w przykładzie II) i inkubowano z wytrząsaniem przy szybkości 250 obrotów na minutę w temperaturze 30°C przez 12 - 18 dni. Wytwarzanie zarodników w kulturze obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym (x 1000, z zabarwieniem błękitem metylenowym). Zarodniki odwirowano przy szybkości 9000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut.

Następnie zarodniki umieszczono w zawiesinie w 1600 ml 10% ciekłego YGM i dodano 400 ml sterylizowanego roztworu zawierającego 8 g NH4Cl w wodzie destylowanej (do końcowej gęstości zarodników 1,0-1,2x10⁷ cfu/ml). Mieszaniną bezpośrednio zaszczepiono 4 kg sterylizowanego środowiska do zabiegów złożonego z mieszaniny piasek-woda-mąka zbożowa w stosunku 9-2-1 (wagowo). Środowisko do zabiegów sterylizowano dwukrotnie w autoklawie (3 godziny w temperaturze 121°C) przed zaszczepieniem zarodnikami.

175 708

Wytwarzanie zarodników bezpośrednio w ciekłej hodowli w opisany sposób pozwala na uniknięcie dalszej inkubacji mieszaniny. Środowisko do zabiegów zawierające zarodniki przechowuje się w temperaturze 4°C przez użyciem.

Zarodniki wytwarzane w ciekłej hodowli, w opisany sposób, testowano na żywotność po 4 miesiącach przechowywania w temperaturze 4°C. Jeden ml zawiesiny zarodników zaszczepiono w kolbach zawierających 100 ml ciekłego sterylizowanego 10% YGM (pH 6,5) i inkubowano z wytrząsaniem przy szybkości 250 obrotów na minutę w temperaturze 30°C. Wytwarzanie zarodników w kulturze obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym (x 1000, z zabarwieniem błękitem metylenowym). Zarodniki skiełkowały po około po około 8 dniach. Prosty test obserwacyjny wykazał brak utraty żywotności po tym okresie przechowywania.

Streptomyces WYEC 108 połączone że środowiskiem do zabiegów (piasek-woda-mąka zbożowa 9-2-1) przetestowano na żywotność w następujący sposób.

Próbkę 1,0 g środowiska do zabiegów z Streptomyces WYEC 108 seryjnie rozcieńczono i nałożono na płytki z agarem CYD. Płytki inkubowano w temperaturze 25°C do powstania kolonii. Zarejestrowano średni poziom 10⁸ do 10⁹ cfu/g środowiska do zabiegów (sucha masa) dla próbek przechowywanych 30 dni.

Alternatywnie zarodniki z płytek agarowych zarodnikujących umieszczono w zawiesinie w 10-20 ml sterylnej destylowanej wody lub bulionu YGM i zmieszano z 10-100 g środowiska do zabiegów otrzymując liczbę żywotnych zarodników 10¹² do 10¹⁴ cfu/g środowiska. Mieszaninę osuszono na powietrzu, zmieszano starannie i przechowywano w temperaturze 4°C przed użyciem. Kompozycja jest produktem stężonym, który można rozcieńczać dodatkiem środowiska do zabiegów do dowolnego poziomu końcowej żywotności cfu/g.

Przykład X. Trwałość kompozycji z żelem alginianowym.

Grzybnie Streptomyces WYEC 108 zebrano przez odwirowania przy szybkości 5000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut z 500 ml 3-dniowej ciekłej kultury YGM. Zebrane grzybnie umieszczono w zawiesinie w 125 ml 10% YGM i dodano 125 ml sterylizowanego 5% (wagowo/objętościowo) roztworu alginianu sodu do gęstości kultury 1,0-1,2x104 cfu/ml. granulki alginianu zawierające grzybnie Streptomyces WYEC 108 utworzono dodając zawiesinę komórki-alginian po kropli do sterylizowanego roztworu 0,25 M CaCl2 w destylowanej wodzie.

W celu określenia żywotności granulek alginianu utworzonych tym sposobem, rozprowadzono je na sterylizowanej plastykowej szalce Petriego (10 cm x 10 cm) i suszono przez godzinę w laminarnym strumieniu sterylnego powietrza pod kołpakiem. Granulowany Streptomyces WYEC 108 zarodnikował łatwo po przechowywaniu w temperaturze 25°C przez 6 do 8 miesięcy (do poziomu średniego 10⁸ do 10⁹ cfu/g suchych kulek alginianu). Zarodniki te łatwo kiełkowały przy inkubacji w sterylizowanej wodzie w temperaturze 25°C. Kiełkowanie zarodników obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym (x 1000, z zabarwieniem błękitem metylenowym).

Przykład XI. Korzystne kompozycje środowiska do zabiegu z Streptomyces WYEC 108.

Po zapoznaniu się z powyższymi sposobami izolowania szczepów promieniowców, testowania szczepów na przydatność jako biologiczne środki zwalczające, sposobami wytwarzania biologicznych środków zwalczających w postaci grzybniowej i jako zarodniki, odpowiednimi środowiskami do zabiegu i w korzystnej odmianie Streptomyces WYEC 108, będzie oczywiste dla fachowca, że niniejszy wynalazek można zmodyfikować na wiele sposobów.

Poniżej podano przykłady alternatywnych odmian wynalazku wraz z opisem szczególnie korzystnych odmian.

Optymalne warunki hodowli

Optymalne warunki wzrostu szczepu WYEC 108 obejmują temperatury pomiędzy 20°C i 30°C, pH od 5,5 do 7,5 i szybkość mieszania przy fermentacji od 200 do 300 obrotów na minutę. Streptomyces WYEC 1θ8 typowo osiąga maksymalną masę komórek około 5,3 g (suchej) biomasy/l ciekłego środowiska YGM przy warunkach hodowli 30°C, pH 6,5 i wytrząsania przy 200 obrotach na minutę przez 72 godziny (do końca fazy logarytmicznej). Podwojenie czasu w fazie logarytmicznej wynosi około 10 godzin. Inkubacja przez 72 godziny może być znacznie skrócona przez stosowanie wyższego stężenia szczepionki komórek w fazie logarytmicznej.

175 708

Alternatywnie, zarodniki mogą powstawać na stałym środowisku agarowym takim jak agar do zarodnikowania. Zarodniki można zbierać bezpośrednio przez zdrapywanie do odpowiedniej cieczy takie jak 10% YGM i bezpośrednio wprowadzać do środowiska do zabiegu. Takie podejście pozwala uniknąć etapu wzrostu kultury w cieczy i skraca w ten sposób proces wytwarzania.

Korzystne i alternatywne środowiska do zabiegu

Streptomyces WYEC 108 można włączać w środowisko do zabiegu do zastosowań w ogrodnictwie i rolnictwie. Przykład VI opisywał jedną z kompozycji środowiska do zabiegu, zawierającego piasek-wodę-mąkę zbożową w stosunku 9-2-1 (wagowo). Fachowcy zrozumieją, że skład środowiska do zabiegu będzie podyktowany przez konkretne zastosowanie środka do zwalczania biologicznego. Np. do środowiska do zabiegu można dodawać różne organiczne i nieorganiczne wypełniacze, takie jak glinka, wermikulit, otręby pszenne, kaczany kukurydzy lub chityna. Stosunek składników środowiska do zabiegu będzie określony przez żądaną teksturę i właściwości fizyczne. Np. właściwości takie jak zdolność utrzymania wody, niewielka masa dla ułatwienia manipulacji i transportu, porowatość pozostawiająca miejsce dla wzrostu grzybni i korzeni rośliny mogą być ważne.

Alternatywnie można dodawać wegetatywne grzybnie lub zarodniki Streptomyces WYEC 108 do alginianowej zawiesiny w celu wytworzenia uwięzionego w alginianie granulowanego szczepu. Sposoby wytwarzania granulek alginianowych są znane fachowcom i opisano je szerzej w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4668512 Lewisa i in. Do granulek można dołączać inne składniki, takie jak nawozu.

W korzystnej odmianie wynalazcy stwierdzili, że szczególnie przydatne jest środowisko do zabiegu złożone z torfowca-piasku i mąki zbożowej w stosunku wagowym 1:3,5:1. Stosunek ten daje odpowiednią gęstość i zdolność utrzymania wody dla produktu do zastosowań rolniczych i ogrodniczych. Jednak, jak powiedziano wcześniej, inne stosunki tych składników i inne składniki są także dopuszczalne w środowisku do zabiegu. Np. skuteczne alternatywne środowisko do zabiegu składa się z torfowca (620 g) - piasku (3380 g) - mąki zbożowej (270 g) chityny (10 g).

W jednej z odmian około 1,61 zebranego bulionu z hodowli (komórki fazy logarytmicznej, np. po około 72 godzinach hodowli) zawierającego grzybnię Streptomyces WYEC 108 hodowaną na pożywce YGM opisanej powyżej uzupełnionej 400 ml sterylnego roztworu NH4G (zawierającego 8 g NH4G wody destylowanej) zaszczepiono w plastykowym pojemniku zawierającym 4 kg sterylizowanego środowiska do zabiegów złożonego z mieszaniny torfowiec-piasek-mąka zbożowa. Środowisko do zabiegów sterylizuje się dwukrotnie w autoklawie (3 godziny w temperaturze 121°C) przed zaszczepieniem Streptomyces WYEC 108. Zaszczepione zasobniki inkubuje się w temperaturze 30°C przez 10 do 14 dni w celu zmaksymalizowania wytwarzania zarodników. Pojemniki przechowuje się w temperaturze 4°C przed użyciem.

Stosowanie NH4Cl w środowisku do zabiegów daje źródło azotu dla kiełkujących zarodników Streptomyces WYEC 10. Dla fachowca będzie oczywiste, że można w tym celu stosować inne źródła azotu poza NH4CL Np. jak opisano powyżej, gdy zarodniki zawiesza się w środowisku do hodowli bakterii (takim jak 10% YGM) przez dołączeniem do środowiska do zabiegów, dodanie źródła azotu jest zbędne. W korzystnych odmianach wynalazku środowisko do zabiegów zawiera dostateczną ilość źródła azotu. Fachowiec zrozumie, że określenie dostateczna ilość źródła azotu można sprecyzować określając wpływ na częstość kiełkowania zmniejszenia lub zwiększenia zawartości danego źródła azotu lub wpływ zmiany źródła azotu. Dostateczna ilość źródła azotu to ilość danego źródła azotu, która ułatwia kiełkowanie zarodników Streptomyces WYEC 108.

W alternatywnej odmianie opisanej w przykładzie XI zarodniki Streptomyces WYEC 108 wytwarza się w ciekłym środowisku i bezpieczeństwo dołącza do korzystnego środowiska do zabiegów, przechowywanego następnie w temperaturze 4°C.

W korzystnej odmianie wynalazku Streptomyces WYEC 108 dodaje się do środowiska do zabiegów w końcowym stężeniu Streptomyces WYEC 108 co najmniej 1x10⁵ cfu/g. W korzystniejszej odmianie wynalazku końcowe stężenie Streptomyces WYEC 108 wynosi od 1x1)5 do 1x 108 cfu/g.

175 708

Przykład XII. Szczegółowy opis kompozycji środowiska do zabiegów zawierającego Streptomyces WYEC 108.

Korzystną kompozycję środowiska do zabiegów zawierającego Streptomyces WYEC 108 wytwarza się na dużą skalę opisaną niżej procedurą. Wszystkie opisane procedury prowadzi się stosując standardowe techniki aseptyczne (np. komorę przepływu laminarnego sterylizowaną nadfioletem) dla zapewnienia sterylności do czasu otwarcia opakowania przez użytkownika.

Wytwarzanie komórek

1) Zawiesić zarodniki z ukośnej kultury na CYD Streptomyces WYEC 108 w 10 ml sterylnego bulionu YGM lub CYG (pH 6,5). Ta zawiesina szczepiąca służy do szczepienia kultur w kolbach.

2) Zaszczepić 6 kolb zawierających po 100 ml YGM (pH 6,5). Użyć 10 ml zawiesiny zarodników na kolbę. Po zaszczepieniu inkubuje się kolby z wytrząsaniem przy szybkości 200 obrotów na minutę w temperaturze 30°C przez około 36 godzin.

3) Zaszczepić 6 kolb o pojemności 2,0 l zawierających po 1,1 l bulionu YGM (pH 6,5) grzybniową szczepionkę przygotowaną powyżej (100 ml na kolbę). Po zaszczepieniu inkubuje się kolby z wytrząsaniem przy szybkości 200 obrotów na minutę w temperaturze 30°C przez około 24 do 48 godzin lub dłużej (do 4 dni). Jest to szczepionka do fermentatora.

Fermentacja

Około 7,2 l podstawowej kultury otrzymanej opisaną powyżej metodą zaszczepiono fermentator zawierający 401 sterylnego bulionu YGM (pH 6,5) (=15% szczepionki objętościowo, podejściem jest stosowanie wysokiej gęstości zawiesiny komórek, jak to tylko praktyczne). Fermentator pracuje z mieszaniem (200 obrotów na minutę) w temperaturze 30°C przez około 72 godziny (prawie do końca fazy logarytmicznej).

Zbiór po fermentacji

1) Bulion pofermentacyjny zawierający komórki WYEC 108 (po około 72 godzinach inkubacji) zbiera się aseptycznie do sterylnych butelek plastykowych o pojemności 20 l.

2) Sterylny roztwór NH4Cl dodaje się do bulionu hodowli zawierającego komórki WYEC 108 (16 g NH4Cl rozpuszczone w 800 ml destylowanej wody na 3,21 zebranego bulionu hodowli, wstępnie sterylizowana w autoklawie). Powstałą objętość 121 zawiesiny komórek zawierającej NHąCl miesza się dokładnie przez wytrząsanie butelek przed zaszczepieniem przygotowanego wcześniej środowiska do zabiegów.

Przygotowanie środowiska do zabiegów

1) Każdy składnik środowiska do zabiegów odmierza się oddzielnie i dodaje się do dużego naczynia nadającego się do sterylizacji. Połączoną mieszaninę określa się nazwą środowiska do zabiegów. Składa się ono z torfowca, piasku i mąki zbożowej (540 g : 2700 g : 540 g; 1:5:1 wagowo).

2) Środowisko do zabiegów miesza się starannie i przykrywa twardą aluminiową folią lub watą bawełnianą i sterylizuje dwukrotnie (po 90 minut w temperaturze 121°C z 12 godzinami przerwy pomiędzy sterylizacjami).

3) Środowisko do zabiegów ochładza się do temperatury pokojowej po drugiej sterylizacji i przed zaszczepieniem zebranym bulionem zawierającym szczep WYEC 108 i roztwór NHąCl (wytworzony jak powyżej).

Wprowadzenie Streptomyces WYEC 108 do środowiska do zabiegów w celu utworzenia kompozycji torfowca, piasku, wody, mąki zbożowej i NH4CL

1) Około 0,5 l zebranego bulionu zawierającego szczep WYEC 108 i roztwór NHCl (wytworzonego powyżej) wprowadza się dokładnie do tylu, ile potrzeba, sterylizowanych pojemników plastykowych zawierających 3,78 kg środowiska do zabiegów.

2) Zaszczepione pojemniki inkubuje się w temperaturze 30°C przez 10-14 dni (do 20 dni inkubacji może być optimum), po czym przechowuje się w temperaturze 4°C przed użyciem (kompozycja jest trwała przez miesiące).

755 508

Manipulacje i transport

1) Kompletną kompozycję zawierającą Streptomyces WYEC 108 aseptycznie przenosi się do sterylnych trójwarstwowych plastykowych toreb przy pomocy małej sterylizowanej szufelki lub innego narzędzia, korzystnie pod kapturem laminarnego przepływu sterylizowanym nadfioletem.

2) Napełnione torby zawiązuje się następnie i umieszcza w ruchomych pudłach o pojemności 0,042 m³ do transportu. Każde pudło zamyka się mocną taśmą.

Przykład XIII. Włączanie kompozycji zawierającej Streptomyces WYEC 108 do rozsadników.

Kompozycję zawierającą czynnik zwalczania biologicznego Streptomyces WYEC 108 i środowisko do zabiegów opisane w przykładzie XII miesza się glebą rozsadnikową lub doniczkową do końcowego stężenia Streptomyces >1,^-1,2x10⁵ cfu/g gleby lub więcej). Procedura siania jest następująca.

1) Około 1,0 cm torfowca umieszcza się na dnie każdej doniczki (lub rozsadnika) w celu zabezpieczenia się przed utratą gleby (mieszanki doniczkowej) przy jednoczesnym napowietrzaniu i drenażu;

2) Doniczki napełnia się rolniczą (rozsadnikową lub doniczkową) glebą do około 3,0 cm poniżej krawędzi doniczki (rozsadnika). Doniczki (rozsadniki) podlewa się do nasycenia.

3) Około 1,5 cm kompozycji zawierającej Streptomyces WYEC 108 i środowisko do zabiegów dodaje się na szczyt każdej doniczki (rozsadnika). W razie potrzeby kompozycję miesza się wstępnie z glebą rozsadnikową lub doniczkową dla zwiększenia objętości i doprowadzenie do wartości cfu/g. Jednak optymalna skuteczność wymaga co najmniej 105 cfu/g w końcowej mieszaninie.

4) Nasiona umieszcza się na powierzchni doniczek lub rozsadnika i pokrywa dodatkową warstwą około 1,5 cm gleby rozsadnikowej lub doniczkowej.

5) Dodaje się małą ilość wody w celu zwilżenia gleby i nasion.

6) Dla zminimalizowania wysychania i tworzenia skorupy doniczki przykrywa się zwykle czystym czarnym tworzywem aż do czasu wzejścia sadzonek (może to nie być konieczne przy kontroli wilgotności).

7) Spryskiwano wierzch doniczek (rozsadnika) w razie potrzeby wodą po wzejściu sadzonek.

Literatura

ATCC Catalogue ofBacteria i Bacteriophages, wydanie 17,1989. American Type Culture Collection, Rockville, MD.

Locci, R. 1989. Streptomyces end Related Genera in Bergey' Manual of Systemaric Bacteriology; Williams i Wilkens, Baltimore, MD. 4:2451-2492.

Filnow, A. B. i J. L. Lockwood. 1985. Evaluation of several actinomycetes and the fungus Hypochytrium catenoides as biocontrol agents of Phytophthora root rot of soybean. Plant Disease 69 :1033-1036.

Ingram, D.M. i R. J. Cook. 1990. Pathogenicity of four Pythium species to wheat, barley, peas, i lentils. Plant Pathology 39:110-117.

Kraft, J. M. i D. W. Burke. 1971. Pythium ultimum as a pathogen of beans and peas in Washington. Plant Dis. Rep. 55:1056-1060.

Lynch, J.M., R. D. Lumsden, P. T. Atkey, i M.A. Ousley. 1992. Prospects for control of Pythium damping-off of lettuce with Trichoderma, Gliocladium, and Enterobacter spp. Biol. Fertil. Soils 12:95-99 .

Lynch, J. M., K. L. Wilson, M. A. Ousley, i J. M. Whipps. 1991. Response of lettuce to Trichoderma treatment. Lett. Appl. Microbiol. 12:59-61.

Miller, J. J. E. Liljeroth, G. Henken, i J. A. van Veen, 1990. Fluctuations in the fluorescent pseudomonad and actinomycete populations of rhizosphere and rhizoplane during the growth of spring wheat. Can. J. Microbiol. 36:254-258.

175 708

Pridham, T.G. i D. Gottlieb. 1948. The utilization ofcarbon compounds by some actinomycetales as an aidfor species determination. J. Bacteriol. 56:107-114.

Reddi, G. S., i A. S. Rao 1971. Antagonism of soil actinomycetes do some soil borne plant pathogenic fungi. Indian Phytopathol. 24: 649-657.

Stanghellini, M. E. i J. G. Hancock. 1970. A Quantitative Method for the Isolation of Pythium ultimumfrom Soil. Phytopathology. 60:551-552.

Stasz, T. E., G. E. Harman i G. A. Marx. 1980. Time and site of infection of resistant i susceptible germinating pea seeds by Pythium ultimum. Phytopathology. 70:730-733.

Trapero-Casas, A., W. J. Kaiser i D. M. Ingram. 1990. Control of Pythium seed rot and preemergence damping-off of chickpea in the U. S. pacific northwest and Spain. Plant Dis. 74:563-569.

Westerlund, F. V., Jr., R. N. Campbell i K. A. Kimble. 1974. Fungal root rots and wilt of chickpea in California. Phytopathology 64: □ 32-436.

175 708

FIG. 2

175 708

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz Cena 6,00 zł.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Biologicznie czysta kultura nowego mikroorganizmu Streptomyces WYEC 108, o numerze identyfikacyjnym ATCC 55445.
2. 2. Kompozycja do ochrony roślin przed zakażeniami grzybowymi składająca się z organizmów Streptomyces, znamienna tym, że zawiera od 104 do jo^cfu/g nowego mikroorganizmu Streptomyces WYEC 108 oraz środowisko do zabiegów, przy czym środowisko do zabiegów obejmuje co najmniej jeden z następujących składników: piasek, wodę, mąkę zbożową, torfowiec, żal alginianowy, wermikulit i wypełniacz organiczny i nieorganiczny oraz ewentualnie dostateczną ilość źródła azotu.

   2. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako źródło azotu zawiera chlorek amonu.
3. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera zarodniki Streptomyces WYEC 108.
4. 5. Kompozycja według zastrz. 2 albo 3, znamienna tym, że zawiera ponadto metabolity przeciwgrzybowe wytwarzane przez Streptomyces WYEC 108.
5. 6. Sposób polepszania wzrostu roślin, znamienny tym, że podaje się na nasiona lub sadzonki kompozycję zawierającą środowisko do zabiegów i co najmniej jeden składnik wybrany z grupy obejmującej komórki Streptomyces WYEC 108, zarodniki Streptomyces WYEC 108 i przeciwgrzybowe metabolity wytwarzane przez Streptomyces WYEC 108.