CN102787085B - 一株山药内生利迪链霉菌dor3-2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株山药内生利迪链霉菌DOR3-2及其在山药炭疽病生物防治中的应用，本发明的山药内生利迪链霉菌DOR3-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2012237，是从山药植株的根分离培养得到。本发明所提供的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) DOR3-2具有广谱的抗丝状真菌活性，对薯蓣科薯蓣属藤本植物尤其是山药炭疽病具有良好的防治效果，为山药的规模化生产提供技术支持，为山药的生物防治提供一条有效的防治途径。
Description
技术领域
本发明涉及一株山药内生利迪链霉菌及其应用，特别涉及一株用于山药炭疽病生物防治的山药内生利迪链霉菌DOR3-2及其应用。
背景技术
山药（Dioscorea opposita Thunb.）又名淮山、薯蓣，为薯蓣科薯蓣属藤本植物，是我国传统的中药材。具有治疗肾虚病症、高血压、糖尿病、哮喘、神经衰弱和腰腿痛等药理功效。山药营养丰富，风味独特，口感好，不含任何有害物，为当今世界绿色保健食品之王，也是我国重要的特产出口蔬菜之一。中国热带、亚热带地区是山药的原产地和驯化中心，目前在我国大部分地区都有栽培。近年来，随着山药栽培面积的扩大, 山药上各种病害的发生与危害也越趋频繁和严重, 其中以炭疽病的危害最大, 在一些山药种植地甚至造成山药连片落叶、枯死，严重地影响了山药的产量和品质。目前报道的山药炭疽菌的病原菌，有辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和薯蓣盘长孢菌(Gloeosporiumpestis)，其中胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是引起山药炭疽病的主要病原菌。对山药炭疽病的防治主要通过化学药剂来预防，一旦发病后很难控制；此外，化学防治污染较为严重，化学农药残留影响山药品质，生物防治技术被认为是最具发展潜力的防治方法，是当前生产上一条有效的防治途径。
植物内生菌（endophyte）是指整个生活周期或大部分生活周期在植物体内度过的微生物。许多植物体内都含有内生菌，内生菌能增强寄主植物的抗虫性、抗病性、抗旱性、以及生长和竞争能力。因此，内生菌已逐渐被用作植物生物保护剂。利用植物内生放线菌进行植物病害防治的研究已经有一些成功地报道，而尚未见利用山药内生放线菌进行防治山药炭疽病的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种山药内生利迪链霉菌及其在防治山药炭疽病中的应用。
本发明所采用的技术方案：
一株山药内生利迪链霉菌，从山药植株的根中分离得到，命名为利迪链霉菌(Streptomyces lidicus )DOR3-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2012年6月24日；保藏编号：CCTCC NO:M2012237。
上述利迪链霉菌(Streptomyces lidicus )DOR3-2的生物学特征如下：
1、菌株的16S rRNA基因序列分析
利迪链霉菌DOR3-2的16S rRNA基因序列有效片段长度为 1405bp,提交 GenBank 数据库序列号为JF718661。在 EzTaxon 数据库中进行有效种的序列相似性搜索, 发现利迪链霉菌DOR3-2与链霉菌属的菌株高度相关，是链霉菌属的放线菌，并且利迪链霉菌DOR3-2与利迪链霉菌标准菌株NRRL2433（Streptomyces lydicus NRRL2433T））的相似性最高，相似性为99.715%，与Streptomyces chattanoogensisDSM 40002T的相似性为 99.63%，Streptomyces chrestomyceticus DSM 40545T的相似性为99.2%，Streptomyces rimosus subsp. Paromomycinus DSM 41429T的相似性为99.2%，而与其他链霉菌属的相似性在97.95-99%之间。
2、菌株的形态与培养特征
利迪链霉菌DOR3-2的气生菌丝和基内菌丝高度分支，营养菌丝不断裂，孢子丝颜色早期白色，培养后期灰褐色，孢子链呈螺旋状。在ISP2、ISP4、ISP5三种培养基上生长良好，气生菌丝均白色；在ISP3、ISP6培养基上生长中等，在ISP7培养基上生长较差；在所有培养基上均未产色素。菌株DOR3-2与利迪链霉菌NRRL2433在培养特征上存在差异（见表1）。
表1利迪链霉菌 DOR3-2与利迪链霉菌NRRL2433培养特征的比较
3、菌株的生理生化特征
利迪链霉菌DOR3-2与利迪链霉菌NRRL2433在生理生化特征上极为相似，均可对多种碳源进行利用，但二者也存在差别。利迪链霉菌DOR3-2能利用纤维素和淀粉作为碳源生长，但利迪链霉菌NRRL2433对二者均不能利用（见表2）。
表2 利迪链霉菌DOR3-2与相似性菌株的生理生化特征比较
* Data fromKarwowski etal.1992.；+ 表示能生长；- 表示不能生长。
综合上述形态培养特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列相似性的结果，利迪链霉菌DOR3-2与利迪链霉菌标准菌株NRRL2433（Streptomyces lydicus NRRL2433T）高度相似又略有差别，因此利迪链霉菌DOR3-2为一株新利迪链霉菌。
本发明所提供的利迪链霉菌DOR3-2可通过如下方法从山药植株分离培养得到：
（1）采集健康的山药植株的根经表面消毒处理后，切成1-2 cm小块，将组织研成匀浆液，涂布于IMA-2培养基，28℃培养1-4周。
（2）挑取小型菌丝紧密的放线菌特征菌落，于ISP2培养基平板划线纯化分离，置于28℃培养1周。
（3）将所得纯菌株与山药病原菌胶孢炭疽菌作平板对峙试验，从中选择对病原菌具抗性的菌株，通过山药组培苗接种试验进一步验证其抗病活性后，鉴定并保存菌种。
本发明的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) DOR3-2具有广谱的抗丝状真菌活性。平板对峙培养试验表明该菌株对山药胶孢炭疽菌、参薯胶孢炭疽菌、米曲霉、黄曲霉、青霉都有抗菌活性。
发明人针对该利迪链霉菌DOR3-2发展了一套培养技术，并能把该菌重新回接山药组培苗，增强了山药组培苗对胶孢炭疽病的抗性。
本发明所述的于IMA-2培养基成分组成通常为：葡萄糖5 g，淀粉5g，牛肉浸膏1 g，酵母浸膏1 g，N-Z-Amine 2 g，NaCl 2g, CaCO3 2g, 蒸馏水1000 mL，琼脂20g, pH7.2；抑制剂的组成：50mg/L放线菌酮+50mg/L制霉菌素+100mg/L重铬酸钾；所述的ISP2培养基成分为：酵母粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，蒸馏水1000ml，琼脂20g，pH7.3。
本发明还涉及所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) DOR3-2在防治山药炭疽病中的应用。
本发明所提供的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) DOR3-2具有广谱的抗丝状真菌活性，对薯蓣科薯蓣属藤本植物尤其是山药炭疽病具有良好的防治效果，为山药的规模化生产提供技术支持，为山药的生物防治提供一条有效的防治途径。
附图说明
图1利迪链霉菌DOR3-2对炭疽病菌的平板对峙拮抗活性。
图2炭疽菌在培养基表面生长旺盛。
图3利迪链霉菌DOR3-2抑制炭疽菌菌丝生长。
图4 14d后对照组培苗枯萎死亡。
图5 14d后回接菌株DOR3-2的组培苗生长良好。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一 利迪链霉菌DOR3-2的分离培养方法
1、采取健康山药根样品，自来水冲洗干净，室温风干，切成1-2 cm小块，0.1%的吐温20淋洗几秒，5%的次氯酸钠消毒10min，2.5%的无菌Na2S2O3溶液洗10分钟，70%的酒精消毒5min，无菌水淋洗2遍，10%的无菌 NaHCO3溶液洗10分钟，风干后，加少量无菌水和石英沙用无菌研钵将组织研成匀浆液，
2、将匀浆液两层纱布过滤后，稀释10，100倍，每稀释度取0.2 ml涂布于IMA-2 分离培养基，28℃培养1-4周。
3、根据分离培养基上菌株的培养特征，挑取明显分开的放线菌单菌落，进一步ISP2平板划线纯化后， 4℃保存或挑取菌丝或孢子于20%无菌甘油，-20℃保存。
4、将所得纯菌株与山药病原菌胶孢炭疽菌作平板对峙试验，从中选择对病原菌具抗性的菌株，通过山药组培苗接种试验进一步验证其抗病活性后，鉴定并保存菌种。
实施例二 利迪链霉菌DOR3-2的平板对峙抗丝状病原真菌试验
1、接种利迪链霉菌DOR3-2于ISP2平板上28℃恒温箱培养1周，供试病原丝状真菌接种于PDA培养基上28℃恒温箱培养1周。
2、用接种环挑取直径2 mm的放线菌单菌落菌块接种在PDA培养基固体培养基的一侧（距平板中心点1.5 cm），置于28℃恒温箱培养3-4d，
3、待放线菌菌落长成绿豆大小时，在距离放线菌3cm的位置接种直径6mm的丝状真菌菌丝块（两接种点呈中心对称）。以不接放线菌菌株做对照，每个菌株3次重复，28℃培养5-7 d后观察并测量放线菌与丝状真菌菌落边缘的距离。通过抑菌带的大小评价利迪链霉菌DOR3-2的抗菌能力。
4、结果利迪链霉菌DOR3-2对本实验室保存的13种薯蓣植物炭疽病原菌分离物都具有良好的拮抗活性（图1），对米曲霉、黄曲霉、青霉等丝状真菌表现出广谱的拮抗活性，其抑菌带距离和抑制等级如表3。
表3利迪链霉菌 DOR3-2对丝状真菌的抗菌谱
抑制活性等级：+++，20mm ＜；++，11-19 mm；+，2-19 mm；±，＜1 mm；-，0 mm。
实施例三 利迪链霉菌DOR3-2回接山药组培苗抗山药炭疽病试验
1、接种利迪链霉菌DOR3-2 于ISP2平板上28℃恒温箱培养1周，用无菌刀将利迪链霉菌DOR3-2的菌落从平板上刮下，并用无菌水洗脱做成菌丝或孢子悬液（3-4×106cfu/ml）。
2、取1-2ml菌悬液注入到山药组培苗生长的培养基表面，以无菌水做对照，在光照培养箱中培养14d，取出组培苗的茎叶部分，无菌条件下切成小块，再接种到IMA-2培养基固体培养基，培养1-4周，观察放线菌是否从组织块长出，判断放线菌回接山药组培苗是否成功。
3、接种山药炭疽菌于PDA培养基上28℃恒温箱培养1周。用无菌刀将山药炭疽菌的菌落从平板上刮下，并用无菌水做成菌丝或孢子悬液（3-4×106cfu/ml），取1-2ml菌悬液注入到已回接成功利迪链霉菌DOR3-2的山药组培苗培养基表面，以未回接放线菌DOR3-2的山药组培苗为对照，在光照培养箱中培养14d，调查组培苗的生长、发病情况。
4、结果发现利迪链霉菌DOR3-2能成功回接山药组培苗，从山药组培苗的茎、叶组织块中长出了放线菌菌落；并且利迪链霉菌DOR3-2能够抑制山药炭疽菌菌丝在山药组培苗培养基表面的生长，防止山药炭疽菌感染山药组培苗（图3），而对照培养基表面炭疽菌生长旺盛（图2），并且感染了组培苗，14 d后组培苗枯萎死亡（图4），已回接利迪链霉菌DOR3-2的山药组培苗却生长健康（图5）
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种利迪链霉菌(Streptomyces lidicus )DOR3-2的应用，所述利迪链霉菌(Streptomyces lidicus )DOR3-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年6月24日；保藏编号：CCTCC NO:M2012237，其特征在于：其在防治山药炭疽病中的应用。
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