CN104651278B - 一株米修链霉菌及其在防治核桃、冬枣炭疽病方面的应用 - Google Patents

一株米修链霉菌及其在防治核桃、冬枣炭疽病方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株米修链霉菌及其在防治核桃、冬枣炭疽病方面的应用。该菌株为米修链霉菌(Streptomyces misionensis)菌株JT01，其保藏号为CGMCCNo.8126。实验表明，本发明的米修链霉菌菌株JT01具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，其发酵原粉防治核桃炭疽病、冬枣炭疽病效果显著，防治效果分别达到75.65％、73.27％，且核桃、冬枣生长健壮，无药害产生。同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少化学农药的使用，因而在生物防治核桃、冬枣炭疽病中具有重要应用前景。

Description

一株米修链霉菌及其在防治核桃、冬枣炭疽病方面的应用
技术领域
本发明属于微生物应用领域。具体而言，本发明涉及一株米修链霉菌及其用途。
背景技术
核桃是重要的经济树种，居世界四大坚果之首。核桃果仁含油量高达60％～75％，蛋白质含量在15％左右；含有丰富的维生素和钙、铁、锌等多种营养元素，对防治心血管病、防癌、补脑等方面有良好的功效。核桃种植具有重要的经济效益、社会效益和生态效益。全国各地正在大力推广核桃种植。山东省核桃种植面积逐年上升，至2013年已达137万亩。冬枣为中国特有的晚熟枣品种，营养丰富，含有Vc、环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷等，对人类多种疾病具有良好的医疗保健作用。冬枣是黄三角流域主要经济果木，也是当地的主导产业之一，发展势头迅猛，仅沾化县种植面积就达50万亩，产量3亿kg。但近年来，由于气候、品种及种植模式的原因，冬枣盲目追求产量，核桃以早实为主，抗病性较差；管理粗放或矮化密植栽培方式使冬枣、核桃病害发生日趋严重。核桃炭疽病(Walnut anthracnose)、冬枣炭疽病(winter jujube anthracnose)是由炭疽菌属(Colletotrichum Corder)真菌引起的一类重要病害，各核桃、冬枣产区均有发生，已成为制约核桃、冬枣产业快速健康发展的主要障碍之一。
炭疽菌属真菌是一类重要的植物病原菌，全球性分布，寄主范围广，可以侵染许多木本植物和禾本植物，特别是造成一些像草莓、芒果、柑橘、鳄梨等高档水果以及香蕉等普通水果的减产。由于其重要的科学及经济价值，炭疽菌属真菌是公认的全球第八类最重要的植物病原菌。分布范围十分广泛，对全球农林业生产构成了严重威胁。
关于核桃、冬枣炭疽病的防治，目前的防治方法就是盲目使用化学杀菌剂。长期使用化学杀菌剂，带来的一系列严重问题：农药残留、环境污染、抗药性产生、伤及非靶标生物以至于破坏生态平衡等。同时在植物病害的控制中，随着病菌抗药性的不断形成与提高，以及人们越来越担心食物链中化学残留物对健康的影响，要求降低果蔬产品用药量的呼声越来越高，越来越多的化学杀菌剂使用受到了限制，有些已被明令禁止使用。核桃主要种植在山区、丘陵，属水分涵养区，长期大量使用化学农药势必污染土壤和水分，对当地及附近城市居民用水安全造成严重威胁。因此，考虑到经济、环境和安全等问题，这就迫使人们去寻求新的安全有效的防治途径。生物防治是有效的途径之一，在病害的防治中能部分替代或者完全替代化学杀菌剂。
发明内容
本发明的目的是提供一株米修链霉菌菌株JT01，它可以用作生物农药，用来防治核桃、冬枣炭疽病，具有良好的应用前景。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为米修链霉菌(Streptomyces misionensis)菌株JT01，是从山东省青岛市风河入海口沙滩土壤中采用稀释分离法分离获得的，已于2013年9月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.8126。其具有以下微生物学特性：在高氏一号培养基上气生菌丝呈白色至灰白色，基内菌丝呈浅黄至黄褐色，有乳白色色素产生。菌丝无横隔，孢子丝为开环钩形或紧密螺旋形，孢子链状排列，椭圆形，可以较好的利用L-阿拉伯糖和D-果糖，淀粉水解、纤维素水解、牛奶凝固与液化等反应呈阳性，明胶液化、黑色素产生和纤维素利用等反应呈阴性。该菌株的16S rDNA基因序列测定结果如SEQ-1所示。
本发明提供了米修链霉菌菌株JT01的培养方法或繁殖方法：
(1)普通培养保存采用高氏一号培养基，配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2-7.4；
(2)实验室液体培养采用高氏一号液体培养基，配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2-7.4；
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比0.8：1～1：1的比例配制。所述固料由质量比为55：45的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液为：0.1％硝酸钾，0.05％氯化钠，0.05％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.001％硫酸亚铁，剩余为水。
(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述米修链霉菌菌株JT01的微生物菌剂。
上述米修链霉菌菌株JT01的微生物菌剂，由以下方法获得：
(1)将保存的米修链霉菌菌株JT01转移至高氏一号试管斜面中，置于培养箱26℃恒温培养5～7d；
(2)将培养好的米修链霉菌菌株JT01用无菌水以体积比1:10稀释，吸取1mL，置于高氏一号液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(3)按体积比8％～12％的接种比例将种子液接种到固体发酵培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间5～7d，中间多次振荡；
(4)大量固体发酵：将(3)的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，去除粗渣，即为生产菌液，按体积比1:6的接种比例接种于大量发酵培养基；然后置于发酵室(28℃和相对湿度80％以上)中发酵培养7～9d，即可得到发酵液，进一步干燥即可得原粉(含量0.3亿/g)。
该微生物菌剂可以用作生物农药，用于防治核桃、冬枣炭疽病。因此，又一方面，本发明提供米修链霉菌菌株JT01或者其微生物菌剂用于防治核桃、冬枣炭疽病中的用途。
本发明还提供一种用于防治核桃、冬枣炭疽病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的核桃、冬枣施用米修链霉菌菌株JT01或者微生物菌剂。
实验表明，本发明的米修链霉菌菌株JT01具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，其发酵原粉防治核桃炭疽病、冬枣炭疽病效果显著，防治效果分别达到75.65％、73.27％，且核桃、冬枣生长健壮，无药害产生。同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少化学农药的使用，因而在生物防治核桃、冬枣炭疽病中具有重要应用前景。
附图说明
图1为以16SrDNA序列为基础的JT01菌系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1米修链霉菌(Streptomyces misionensis)菌株JT01的分离与鉴定
1.分离：
本发明的米修链霉菌菌株JT01是从山东省青岛市风河入海口沙滩土壤中采用土壤稀释分离法分离获得的，分离方法为：
(1)土样采集：从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；
(2)培养基平板制备：将200mL高氏一号培养基融化，加入0.1g/mL的重铬酸钾溶液200μL，配制成含有100ppm重铬酸钾抑制剂的高氏一号培养基，倒入灭菌的培养皿中，冷却，制成平板；
(3)称取1g土样于灭菌试管中，加100mL无菌水，振荡，制成10-2土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10-7；
(4)取上述土壤悬浮液500μL，加入培养基平板上，用弯玻棒涂匀。置于培养箱28℃恒温培养5-7d。
(5)将单个菌落在高氏一号培养基上划线，得到单菌落，转移至高氏一号试管斜面培养基中，至28℃恒温培养。
(6)以核桃炭疽病菌、冬枣炭疽病菌为靶标菌，采用对峙培养法，筛选到一株对核桃炭疽病菌、冬枣炭疽病菌具有较强抑制活性的菌株，编号JT01。
所述高氏一号培养基配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2-7.4；
所述0.1g/mL重铬酸钾溶液配制方法为：10g重铬酸钾加入100mL无菌水中，完全溶解，过滤除菌，无菌保存备用。
2.菌株鉴定
(1)微生物学特性：在高氏一号培养基上气生菌丝呈白色至灰白色，基内菌丝呈浅黄至黄褐色，有乳白色色素产生。菌丝无横隔，孢子丝为开环钩形或紧密螺旋形，孢子链状排列，椭圆形，可以较好的利用L-阿拉伯糖和D-果糖，淀粉水解、纤维素水解、牛奶凝固与液化等反应呈阳性，明胶液化、黑色素产生，纤维素利用等反应呈阴性。
(2)分子生物学特性：
16S rDNA基因序列测定结果(SEQ-1)：
GGCTTACAATGCAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATTGACCATCTTGGGCATCTTTGATGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTTCGAAGGT
将JT01菌株的16SrDNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与S.misionensis同源性为99.22％，结合JT01菌株的形态特征、生理生化特性，鉴定JT01为米修链霉菌Streptomycesmisionensis。以16SrDNA序列为基础的JT01菌系统发育树如图1所示。
此菌株已于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.8126。
实施例2米修链霉菌菌株JT01对核桃炭疽病菌、冬枣炭疽病菌室内效果验证
1.实验方法
采用平板对峙培养法，将供试的核桃炭疽病菌、冬枣炭疽病菌菌饼(9mm)移至平板中央，四周2cm处接种米修链霉菌JT01菌株，置28℃生化培养箱培养，每个处理重复3次。待对照菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径、抑菌带直径，计算平均值和相对抑制率。
2.结果
由表1可以看出，米修链霉菌JT01菌株对核桃炭疽病菌、冬枣炭疽病菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，抑菌带直径分别为15.29mm、14.98mm，菌丝生长抑制率分别为83.17％、81.94％。
表2.米修链霉菌JT01菌株对核桃炭疽病菌室内抑菌活性测定
实施例3米修链霉菌JT01原粉的制备
高氏一号培养基，配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2-7.4；
高氏一号液体培养基，配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2-7.4；
固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比0.8：1～1：1的比例配制。其中所述固料由质量比为55：45的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包括0.1％硝酸钾，0.05％氯化钠，0.05％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.001％硫酸亚铁，剩余为水。
大量发酵培养配方：同固体培养基配方。
(1)将保存的米修链霉菌菌株JT01转移至高氏一号试管斜面中，置于培养箱26℃恒温培养5～7d；
(2)将培养好的米修链霉菌菌株JT01用无菌水以体积比1:10稀释，吸取1mL，置于高氏一号液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(3)按体积比10％的接种比例将种子液接种到固体发酵培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间5～7d，中间多次振荡；
(4)大量固体发酵：将(3)的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，去除粗渣，即为生产菌液，按体积比1:6的接种比例接种于大量发酵培养基；然后置于发酵室(28℃和相对湿度80％以上)中发酵培养7～9d，即可得到发酵液，进一步干燥即可得原粉，菌活为0.3亿/g。
实施例4米修链霉菌JT01原粉对核桃炭疽病的防治效果验证
本实施例提供了米修链霉菌JT01原粉针对核桃炭疽病的相关实验。
1.1供试药剂
本发明实施例3制备的米修链霉菌JT01原粉；75％代森锰锌水分散粒剂(市售)。
1.2供试作物与防治对象：
供试作物为核桃，品种为香玲；
防治对象：炭疽病
1.3试验地情况
于2014年在山东省济南市历城区高尔核桃种植园进行林间防治核桃炭疽病试验。土壤为砂土地。核桃树为8年生香玲，株距4m×4m，树势中等偏弱，病害发生较严重。所有试验小区栽培条件及管理措施一致，核桃开花后3周用药，每隔15d施药1次，共计7次。
1.4试验设计及安排
本试验设计了米修链霉菌JT01原粉400倍、500倍、600倍，75％代森锰锌水分散粒剂400倍液及不施药清水作对照共5个处理，重复4次，共20个小区，各小区随机排列，每个小区3棵核桃树。
1.5试验调查及计算方法
1.5.1药效调查、调查时间和次数
采收前5d调查，每个处理随机调查200个果实，计算病果率、防治效果，整个试验调查1次。
1.5.4药效计算方法
药效按式(1)、(2)计算：
2.结果
2.1供试药剂对核桃炭疽病的防治效果
表3米修链霉菌JT01原粉剂防治核桃炭疽病田间药效试验结果
注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著(P<0.05)。
表3结果显示，米修链霉菌JT01原粉对核桃炭疽病有较好的防治效果，其中米修链霉菌JT01原粉400倍、500倍防治效果最好，防治效果分别达75.65％、72.26％，在P<0.05水平上无显著性差异，明显高于600倍和75％代森锰锌的防治效果。
3.小结
从核桃病果率和防治效果来看，米修链霉菌JT01原粉对核桃炭疽病具有较好的防治效果，稀释400倍、500倍后防治效果可达70％以上，明显好于对照药剂，差异显著。
实施例5米修链霉菌JT01原粉对冬枣炭疽病的防治效果验证
1.1供试药剂
本发明实施例3制备的米修链霉菌JT01原粉；75％代森锰锌水分散粒剂(市售)。
1.2供试作物与防治对象：
供试作物为沾化冬枣
防治对象：炭疽病
1.3试验地情况
试验地设在山东省沾化县冬枣种植园中，于2014年进行林间防治冬枣炭疽病试验。试验共设5个处理，其中米修链霉菌原粉设置3个浓度梯度300倍、400倍、500倍，75％代森锰锌水分散粒剂300倍液及不施药清水作对照共5个处理，重复4次，共20个小区，各小区随机排列，每个小区固定成龄树2株。在冬枣炭疽病部分果实发病时开始施药，以后每隔7d施药一次，共计4次。试验采用背负式喷雾器，施药时对整个植株均匀喷雾，以不流淌药液为准，试验期间水肥管理及农事操作正常进行。试验期间的日平均温度为30℃，相对湿度为65％，东南风1～2级。土壤为沙壤土，肥沃，肥水充足。
1.2.3调查方法
在打药前调查病情基数，并于当日施药，施药后30d各调查1次，整个试验调查2次。每小区2株冬枣树均调查，每株分左右两个方向调查2个枝条的全部果实，记录总果数、病果数、病斑数。分别计算各处理小区的防治效果。用邓肯氏新复极差法对试验数据进行统计分析。在施药期间，观察各处理对冬枣有无药害产生。
分级方法：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占积整个果实面积5％以下；
3级：病斑面积占整个果实面积6％～10％；
5级：病斑面积占整个果实面积11％～20％；
7级：病斑面积占整个果实面积20％以上。
病情指数及防治效果的计算方法为：
病情指数＝[∑(各级病果数×相对级数值)/(调查总果数×7)]×100
防治效果(％)＝[∑(空白对照病指数－药剂处理病指数)/空白对照病指数]×100
2.结果
2.1供试药剂对核桃炭疽病的防治效果
表4米修链霉菌JT01原粉剂防治冬枣炭疽病田间药效试验结果
注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著(P<0.05)。
表4结果显示，米修链霉菌JT01原粉对冬枣炭疽病有较好的防治效果，其中米修链霉菌JT01原粉300倍防治效果最好，防治效果达73.27％，与其他处理相比在P<0.05水平上具有显著性差异，明显高于其他处理的防治效果。米修链霉菌JT01原粉300倍、400倍处理浓度的防治效果都高于对照药剂(75％代森锰锌)的防治效果。
3.小结
从冬枣病情指数和防治效果来看，米修链霉菌JT01原粉对冬枣炭疽病具有较好的防治效果，稀释300倍防治效果可达70％以上，明显好于对照药剂，差异显著。

Claims (7)

1.米修链霉菌(Streptomyces misionensis)菌株JT01，所述菌株的保藏号为CGMCCNo.8126。
2.权利要求1所述的米修链霉菌菌株JT01在防治核桃炭疽病、冬枣炭疽病中的用途。
3.一种含有权利要求1所述的米修链霉菌菌株JT01的微生物菌剂。
4.权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将保存的米修链霉菌菌株JT01转移至高氏一号试管斜面中，置于培养箱26℃恒温培养5～7d；
(2)将培养好的米修链霉菌菌株JT01用无菌水以体积比1:10稀释，吸取1mL，置于高氏一号液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(3)按体积比8％～12％的接种比例将种子液接种到固体发酵培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间5～7d，中间多次振荡；
(4)大量固体发酵：将(3)的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，去除粗渣，即为生产菌液，按体积比1:6的接种比例接种于大量发酵培养基；然后置于发酵室中于28℃和相对湿度80％以上发酵培养7～9d；
其中，固体发酵培养基由固料和无机盐溶液按质量比0.8：1～1：1的比例配制；所述固料由质量比为55：45的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液为：0.1％硝酸钾，0.05％氯化钠，0.05％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.001％硫酸亚铁，剩余为水；大量发酵培养基配方同固体发酵培养基。
5.权利要求3所述的微生物菌剂在防治核桃炭疽病、冬枣炭疽病中的用途。
6.一种用于防治核桃炭疽病的方法，其特征是，向具有核桃炭疽病的核桃施用权利要求1所述的米修链霉菌菌株JT01或者权利要求3所述的微生物菌剂。
7.一种用于防治冬枣炭疽病的方法，其特征是，向具有冬枣炭疽病的冬枣 施用权利要求1所述的米修链霉菌菌株JT01或者权利要求3所述的微生物菌剂。
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