CN101182485A - 一株产纳他霉素的利迪链霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株利迪链霉菌及其应用。该菌株是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653。该菌株能产生纳他霉素，在纳他霉素敏感菌抑制剂的制备中将有广泛的应用。

Description

一株产纳他霉素的利迪链霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域中的一株利迪链霉菌及其应用。

背景技术

纳他霉素(Natamycin)是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，也称游霉素或匹马霉素(Pimaricin)，它由5个多聚乙酰合成酶基因编码的多酶体系合成，能够专性抑制酵母菌和霉菌，阻止丝状真菌中黄曲霉素的形成。其实际使用剂量为10^-6数量级，具有低剂量、高效率，抗菌作用时间长的特点，是一种高效、安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌添加剂，目前已在30多个国家广泛使用，包括欧盟、大部分北美和东欧国家以及一些中东国家，甚至瑞士这样对食品安全非常重视的国家也允许在面包和奶酪产品中使用纳他霉素。1996年我国食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，1997年3月，我国卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂，其商品名称为霉克(Natamycin^TM)。

纳他霉素对几乎所有的霉菌和酵母菌具有抗性，抑菌作用比山梨酸强50倍左右，且连续数年使用也不易引起靶标真菌形成抗性，但对细菌和病毒无效。因此它在以细菌发酵为基础的食品行业有着广泛的应用前景。作为食品防腐剂，可应用于果酱、黄油、桔汁、生肉和沙拉酱等的防霉，延长食品的保质期，防止酵母和霉菌引起的霉变，减少因为变质而引起的食品回收，降低生产成本，且不改变食品的风味，满足消费者对天然食品的要求。纳他霉素也可以作为医学上的高效抗菌剂，对口腔念球菌感染，真菌性眼角膜溃疡，角膜炎，皮肤及粘液膜真菌感染等疾病都有很好的治疗效果。随着研究的不断深入，纳他霉素的应用范围正在继续扩大，发挥着越来越大的作用。

利迪链霉菌(Streptomyces lydicus DeBoer et al.)是习居于土壤的腐生微生物，研究历史悠久，已知有许多菌株在代谢过程中能够产生各种抗菌活性物质。其著名的代表菌株是S.lydicus NRRL2433，该菌株在医药领域研究和应用广泛，可产生具有广谱抗细菌和分枝杆菌作用的利迪霉素(Lydimycin)和抗革兰氏阳性细菌和分枝杆菌的利迪链菌素(Streptolydigin)；另外有产生抗少数大肠杆菌和克氏肺炎杆菌的苹果酸氧霉素(Malioxamycin)的S.lydicus 1574，以及产生抗革兰氏阳性细菌和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的抗生素Lydicamycin的菌株。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株利迪链霉菌，该菌株能产生纳他霉素。

本发明所提供的利迪链霉菌为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCCNo.1653，是从北京密云县蔬菜田土壤中分离筛选获得的，其已于2006年03月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No.1653。

本发明的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653可用于纳他霉素敏感菌抑制剂的制备。

其中，所述纳他霉素敏感菌为纳他霉素对其具有抑制作用的真菌，如霉菌或酵母菌。

所述酵母菌具体可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；所述霉菌具体可为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。

本发明的另一个目的是提供一种纳他霉素敏感菌的抑制剂。

本发明所提供的纳他霉素敏感菌的抑制剂，是发酵所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653得到的代谢产物。

其中，所述利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的发酵培养基为每升培养基中含有：黄豆粉2％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖2％，玉米浆0.25％，(NH₄)₂SO₄ 0.25％，MgSO₄.7H₂O 0.025％，K₂HPO₄ 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，其余为水；其中各组分的百分含量均为质量百分含量。

所述发酵利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的条件为：在28℃的条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速振荡培养96h-120小时。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述任一所述的纳他霉素敏感菌的抑制剂的方法。

本发明所提供的制备上述任一所述的纳他霉素敏感菌的抑制剂的方法，是发酵利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653，得到的代谢产物即为纳他霉素敏感菌的抑制剂。

其中，发酵培养基的组分及发酵条件同上。

本发明的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653能产生纳他霉素，在纳他霉素敏感菌抑制剂的制备中将有广泛的应用。

附图说明

图1A为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653无菌发酵滤液对酵母菌的抑制作用。

图1B为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653无菌发酵滤液对灰葡萄孢的抑制作用。

图2为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性产物的捷克八溶剂系统纸层析结果分析图。

图3为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性物质粗提物的紫外吸收光谱图。

图4为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性产物的HPLC第一次分离谱图。

图5为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653活性产物的HPLC第二次分离谱图。

图6为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性产物纯样品的紫外扫描图谱。

图7为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性产物纯样品的红外吸收光谱。

图8为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性产物纯样品的高分辨质谱图(负离子)。

图9为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性产物纯样品的高分辨质谱图(正离子)。

图10为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性产物纯样品的核磁共振氢谱(500MHz)。

图11为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的活性产物纯样品的核磁共振碳谱(500MHz)。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例中所使用的培养基如下：

1、高氏一号培养基：每升培养基中含有K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，KNO₃ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，其余为水；所述高氏一号培养基的pH为7.2-7.4。

2、利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的种子培养基：每升培养基中含有黄豆粉20g，蛋白胨5g，可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，玉米浆2.5g，(NH₄)₂SO₄ 2.5g，K₂HPO₄ 0.02g，NaCl 4g，CaCO₃ 6g，其余为水；所述利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的种子培养基的pH为7.2。121℃灭菌30min。

3、利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的发酵培养基：每升培养基中含有黄豆粉2％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖2％，玉米浆0.25％，(NH₄)₂SO₄ 0.25％，MgSO₄.7H₂O 0.025％，K₂HPO₄ 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，其余为水；所述利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的发酵培养基的自然起始pH值为约5.6。其中，各百分含量均为质量百分含量。

4、PDA培养基：每升培养基中含有马铃薯200g，蔗糖10-20g，琼脂17-20g，其余为水；pH自然。

5、PDB培养基：每升培养基中含有马铃薯200g，蔗糖10-20g，其余为水；pH自然。

实施例1、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的分离制备

从北京密云县蔬菜田采集土样，取10g加入内装100ml无菌水和适量玻璃珠的三角瓶中，置摇床上于100rpm振荡20min，取0.5ml加入4.5ml无菌水中，再依次稀释10²、10³、10⁴倍，各取以上土壤悬液0.1ml分别均匀涂布在高氏一号培养基平板上，超净工作台内吹至略干；每浓度3个重复，置于28℃恒温箱中培养5-10天，挑取放线菌单菌落进行稀释划线分离纯化，获得纯培养菌株。

初筛：获得的纯培养菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经0.45μm的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液；以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ACCC20036)、黑曲霉(Aspergillus nigerACCC30005)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea ACCC30091)为指示菌，利用管碟法或洋菜打孔法检测发酵液的抗菌活性；

对初筛获得的有抗菌活性的菌株的无菌发酵滤液进行乙醇沉淀去杂质，上清液进行紫外扫描获得紫外图谱，并与多烯类抗生素的图谱进行比较，筛选出具有多烯类典型吸收峰的紫外图谱的菌株；

复筛获得的菌株的无菌发酵滤液去杂浓缩后进行柱层析分离，并用指示菌跟踪检测各分离组分的活性，对主要活性组分进行制备型高效液相色谱分离得到其纯样品；检测鉴定其纯样品，最终筛选出能够产生纳他霉素的菌株——利迪链霉菌A01CGMCC No.1653。

利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的微生物学特性鉴定：

(1)菌体的形态特征

革兰氏染色阳性；在GYM琼脂、JCM42^#琼脂、燕麦粉琼脂等培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝；孢子丝直、柔曲或弯曲，孢子椭圆形。

(2)培养特性

在6种固体培养基上的培养特性如表1所示。

表1  利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的培养特性

培养基	气生菌丝	基内菌丝	可溶色素
				高氏合成1号琼脂ISP4琼脂GYM琼脂Bennett’s琼脂JCM42#培养基燕麦粉琼脂	浅灰白灰黄灰白至浅灰黄灰白白色略灰灰白	微黄黄褐橙褐黄褐黄褐浅褐	无无黄淡黄淡黄浅棕

(3)生理生化特性

利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的生理生化特性如表2所示。

表2利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的生理生化特性

特性	结果	特性	结果
				I.生长及其它3％NaCl5％NaCl7％NaCl10％NaCl45℃纤维素分解淀粉水解七叶苷降解明胶液化柠檬酸盐产酸II.碳源利用甘露糖葡萄糖甘露醇	+W-----++-W++	II.碳源利用山梨醇山梨糖菊糖果糖乳糖半乳糖阿拉伯糖核糖鼠李糖棉子糖蔗糖木糖肌醇α-甲基-D-葡萄糖苷丙二酸盐	W--+++W--++-WW-

注：“W”表示弱阳性结果；“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

(4)16SrDNA序列

利迪链霉菌A01 CGMCC No.1653的部分16SrDNA序列如序列表中序列1所示。与GenBank中相关序列Blast比较的结果表明其属于链霉菌属；其16SrDNA序列与已知的利迪链霉菌菌株NRRL2433相比相似性很高，为100％。

综合其形态学特征、培养特性、生理生化特性和16SrDNA序列分析的结果，将其鉴定为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)，并将此菌株定名为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01。利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01已于2006年03月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号分别为CGMCC No.1653。

实施例2、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653发酵液的抑菌活性测定

斜面培养：将利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653接种到高氏一号斜面培养基上，28℃培养7-10天至其产生足量的孢子；

种子培养：用无菌铂环刮取其孢子3-5环接种于装有100ml种子培养基的500ml三角瓶内，置可控温摇床上，在28℃条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速恒温振荡培养20-24h；

发酵培养：取上述种子培养液按3％(V/V)的接种量接种于装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶内，在28℃条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速恒温振荡培养96h-120h。

活性检测：发酵液经0.45μm的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液，分别以酿酒酵母ACCC20036和灰葡萄孢ACCC30091为指示菌。将酿酒酵母ACCC20036接种在PDB培养基中，在25-28℃、以200rpm的转速振荡培养12-24h获得酿酒酵母ACCC20036的菌悬液；将灰葡萄孢ACCC30091接种于PDA培养基，22℃恒温培养7天，刮取其分生孢子并将其用无菌水配制成10⁶个孢子/ml浓度的灰葡萄孢ACCC30091的菌悬液。将两种菌悬液分别按2％(体积比)的量加入到装有融化后冷却至50℃左右PDA培养基的三角瓶中，混匀后将其倒入直径9cm的培养皿中，每皿30ml，制作带菌平板，凝固后每皿用直径7mm的打孔器等距离打4个孔，每孔中注入利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的无菌发酵滤液80μl，28℃恒温培养48-96h，十字交叉法测量抑菌圈直径。结果表明发酵滤液对酿酒酵母和灰葡萄孢的抑菌圈直径分别达31.0mm和43.0mm(图1A和图1B)。

实施例3、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653代谢产物的抑菌机理

一、发酵液中纳他霉素的粗提和初步鉴定

将实施例2中所得发酵液用3倍体积的无水乙醇预处理，4℃静置2h，以沉淀菌体、固形颗粒、可溶性粘胶状物、核酸、杂蛋白质以及中间代谢产物等，上清液用2层滤纸以布氏漏斗真空抽滤，滤液经旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩，浓缩液即为活性物质粗提物，4℃保存备用。

采用捷克八溶剂系统纸层析来鉴别活性物质的化学类型，同时在190nm～400nm对其进行紫外全波长扫描。

1、捷克八溶剂系统纸层析

溶剂系统为：I.水饱和的正丁醇；II.含2％(质量百分含量)对甲基苯磺酸的水饱和的正丁醇溶液；III.正丁醇∶醋酸∶水(体积比)＝2∶1∶1；IV.含2％(质量百分含量)六氢吡啶的水饱和的正丁醇；V.正丁醇饱和的0.5mol/l pH为7.0的磷酸缓冲液；VI.含2％(质量百分含量)对甲基苯磺酸的正丁醇饱和的水；VII.苯∶甲醇(体积比)＝4∶1，滤纸用0.5mol/l pH 7.0的磷酸缓冲液处理；VIII.甲醇∶3％(质量百分含量)NaCl水溶液(体积比)＝3∶1，滤纸用5％(质量百分含量)硫酸钠水溶液处理；

采用新华一号滤纸，裁成长16×1cm的纸条；层析在20cm×3cm的试管中进行；具体操作步骤如下：

①每支试管中分别加入各溶剂系统展开剂4ml，用橡皮塞封口，让展开剂的蒸汽充满整个展层空间；

②取上述活性物质粗提物，用微量移液器或毛细管在滤纸条的一端分多次点样，每次在自动干手器下边点边以热风吹干，上样量为15μl，点样的直径以不超过5mm为宜；

③待滤纸上的样品吸干后，先将其悬挂在试管内，用橡皮塞密闭管口，使滤纸在展开剂的蒸汽中平衡0.5h后，将其点样端浸于展开剂中上行展层，勿使溶剂与样品直接接触；待展开剂接近前沿时，取出滤纸条悬于通风橱中晾干或用热吹风使溶剂尽量挥发；

④在无菌条件下用定制的方形玻璃盘制备PDA平板，取适量培养好的灰葡萄孢ACCC30091的孢子悬浮液均匀涂布在平板上；将层析后的滤纸条依次贴于平板上，室温静置约30min，使纸条上相应部位的活性物质渗透扩散到培养基中；用无菌小镊子取出纸条，并标记其在平板上的位置；将平板置25℃恒温培养箱培养48h进行生物学显影；

⑤根据生物活性显示的结果，测量有效成分在不同pH下的展层距离，按下述公式计算迁移率Rf值，画出pH层析谱：

Rf＝原点到抑菌圈中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

层析图谱(图2)表明，在溶剂II和溶剂VI中不显迹，溶剂VII中不移动，即Rf值为0，这与多烯类抗生素在八溶剂系统中的纸层析图谱相近。这表明活性物质可能属于多烯类抗生素。其中在溶剂III中在点样量大时偶尔出现一大(Rf＝0.333)一小(Rf＝0.754)两个抑菌区域，表明该活性物质至少有两个活性组分。

2、紫外扫描

将上述活性物质粗提物用去离子水稀释40倍，以去离子水做空白对照，采用日立UV-VIS 3010紫外可见分光光度计在190nm～400nm范围内进行全波长扫描。

结果表明：紫外吸收光谱中，虽然杂质峰较多，但在292nm、305nm和319nm处有明显的三个吸收峰(图3)，多次重复该试验发现样品的浓度越大吸收峰的峰值越高，表明活性物质的含量越高。这三个典型的吸收峰是多烯类中四烯类抗生素所特有的特征峰，这与捷克八溶剂系统纸层析的测定结果一致。

据上述分析，初步确定活性物质的有效组分属于四烯类抗生素。

二、活性物质的分离纯化

通过大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和高效液相色谱仪HPLC进行逐步分离纯化。

1、大孔树脂吸附柱层析

选用40cm×2.6cm玻璃层析柱，D4006大孔树脂(天津南开大学化工厂)，大孔树脂按厂家说明预处理后用适量去离子水调匀，缓慢加入装有1/3体积去离子水的层析柱中，同时从柱底部以匀速缓慢放出蒸馏水，使柱中液面始终保持在树脂层上面。装至约3/4柱高度，自然沉降6～10h，使平衡后的装柱体积为150ml。

将纳他霉素粗提物与树脂按2∶1的体积比进行动态吸附；吸附完毕后，关闭与柱所连的恒流泵，层析柱静置2h，然后依次用1倍柱体积的去离子水、1.5倍柱体积的50％(体积百分含量)甲醇和2.5倍柱体积的80％(体积百分含量)乙醇洗脱，洗脱速度为0.5ml/min，用自动部分收集器分管收集洗脱液，每管15ml。以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。

结果表明活性洗脱液集中在第35～45管(即自流出量为3.5倍柱体积至4.5倍柱体积之间的洗脱液)。

合并有活性的洗脱液，45℃下减压浓缩后供下一步分离。

2、硅胶吸附柱层析

选用40cm×2.6cm玻璃层析柱，200～300目硅胶，以体积比为1∶2∶1的正丁醇、甲醇和水的混合液为洗脱液；取约150g硅胶用去离子水浸泡3h，倾去细小颗粒，布氏漏斗真空抽滤除去水分；再用6mol/L HCl浸泡12h，然后用去离子水洗至中性，真空抽干；用无水乙醇浸泡过夜，真空抽干；临用前在120℃下活化2h，干燥至恒重；层析柱中装入1/3柱体积的洗脱液，然后缓慢加入用洗脱液混合均匀的硅胶，约至3/4柱高时停止加入，静置6～10h，使硅胶缓慢沉降。然后用2～3倍体积的洗脱液以1mL/min的流速冲洗柱体，使之平衡。平衡后的柱体积为150ml。取步骤1的大孔树脂活性洗脱浓缩液10ml上柱进行动态吸附，用2～3倍柱体积的洗脱液按0.5ml/min的流速进行洗脱，用自动部分收集器分管收集洗脱液，每管5ml。以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。

结果表明：其洗脱液中的活性组分集中在第10～18管(即自0.33倍柱体积至0.6倍柱体积之间的洗脱液)。

合并活性洗脱液，45℃真空减压浓缩，浓缩液用于下一步分离。

3、制备型HPLC分离纯化

采用LC-9101型循环制备HPLC，JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱。

取步骤2的硅胶柱层析后的活性洗脱浓缩液，用0.45μm微孔滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量6ml；以甲醇∶水(体积比为7∶3)为流动相进行分离，利用UV检测器在波长305nm处检测并自动形成分离图谱；利用馏分收集器分别收集图谱中各曲线峰所对应的洗脱液；以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。以2ml/min的泵流速相继分离2次。

实验结果表明，第一次HPLC分离共检测到6个峰，其中在保留时间为57.399min的峰为主要活性峰(图4)；对其进行的第二次分离检测到保留时间为38.399min的峰为活性峰(图5)，其相对峰面积百分比为99.503％，表明样品纯度达99.503％以上。

对最终样品进行真空浓缩，干燥后呈白色或奶油色粉末。利用岛津分析型HPLC分别采用下述两种方法对其进行纯度验证。

1)取少量样品溶于70％甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为：C₁₈反相柱，柱温30℃，UV检测器，检测波长305nm，SIL-10ADVP自动进样器进样10μl，以1ml/min的流速洗脱60min。梯度洗脱步骤如下：

时间(分)	A(％)	B(％)
			0～1011～2021～3031～4041～5051～60	3550658095100	6550352050

结果显示洗脱曲线为单一的峰，说明其为单一组分，纯度达到化学结构测定的要求。

2)取少量样品溶于70％甲醇水溶液，以乙腈(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为：C₁₈反相柱，柱温30℃，UV检测器，检测波长305nm，SIL-10ADVP自动进样器进样10μl，以1ml/min的流速洗脱60min。梯度洗脱步骤如下：

时间(分)	A(％)	B(％)
			0～1516～3031～4546～60	355070100	6550300

结果显示洗脱曲线为单一的峰，说明其为单一组分，纯度达到化学结构测定的要求。

两种验证方法得到的结果一致。

三、纯化样品化学结构的解析鉴定

1、紫外吸收光谱(UV)

将上述步骤二纯化的样品极微量溶于超纯水中，用日立UV-VIS 3010紫外可见分光光度计在190nm～400nm波长范围内以超纯水为空白对照进行全波长扫描，自动形成紫外吸收图谱。

由紫外扫描图谱可见，活性物质的紫外吸收峰均表现出典型的四烯类抗生素谱型，即在波长281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共轭四烯发色基团的吸收峰，其中波长305nm处吸收值最大，281nm处吸收值最小(图6)，再次验证了该活性物质属于多烯类中的四烯抗生素。

2、红外吸收光谱(IR)

采用KBr压片法，用德国BRUKER公司TENSOR 27傅立叶红外光谱仪进行400cm^-1-4000cm^-1区域内扫描。

活性物质纯化样品的红外光谱如图7所示，其中v_max3593、3493、3280cm^-1为分子中N-H和-OH的伸缩振动特征吸收峰；v_max3017、2978、2940cm^-1为分子中-CH₃和-CH₂的伸缩振动特征吸收峰；v_max1716cm^-1为C＝O的强吸收特征峰；v_max1634、1570cm^-1为C＝C伸缩振动的特征吸收峰；另外，在v_max1401、1267、1190、1107、1060、1003、885、847、798cm^-1等处都有吸收峰。

3、高分辨质谱

采用德国BRUKER公司超高分辨率9.4T混合型四级杆傅立叶串联质谱仪(9.4TQ-FT-MS)；条件：capillary 4000，Dry Gas：4.0l/s，源温：180℃，scan range：300～2000，syringe pump：1.5ml/min，数据分析软件为Bruker DaltonicsDataAnalysis 3.4。

由高分辨质谱可见，正离子检测方式，检测到分子离子峰[M+Na]⁺为m/z＝688.2938的化合物(图9)；负离子检测方式检测到分子离子峰[M-H]^-为m/z＝664.2976的化合物(图8)。

综上所述，分析确定活性物质的主要活性组分的分子式均为C₃₃H₄₇NO₁₃，分子量为665；由公式：不饱和度(n)＝1+Nc+(Nn-Nh)/2(Nc：碳原子数；Nn：氮原子数；Nh：氢原子数)计算其分子式的不饱和度为11，表明其分子结构中含有多个不饱和键与环等。

4、核磁共振谱(NMR)

以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)为溶剂，以四甲基硅烷(TMS)为内标，室温下测定。

采用Bruker AVANCE DRX-500核磁共振谱仪(德国Bruker光谱仪器公司)，以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标，进行氢谱(¹HNMR)和碳谱(¹³CNMR)的测定；前者共振频率为500.1325156MHz，采样次数32768次；后者共振频率125.7577612MHz，采样次数为65536次。

实验结果表明，活性产物纯样品的¹H-NMR图谱(图10)中，由于采用DMF做溶剂，使得羧基上的氢被中和，δ＝12的峰消失，同时增加了δ＝3和8的两处溶剂峰，δ＝6附近的一组峰代表了共轭多烯上的氢，δ＝5左右的一组峰则代表羟基；¹³C-NMR图谱(图11)中，强度最大的峰系由溶剂DMF产生，δ＝180和165的峰表明分子中羧基和酯基的存在，δ＝130左右的一组峰则由共轭多烯产生；当θ＝135°时，DEPT谱图中CH和CH₃峰的谱线朝上，CH₂峰的谱线朝下，分子中共有5个-CH₂。

综合分析上述实验数据，判定活性产物的主要活性组分为纳他霉素，其化学结构式为：

序列表

<160>1

<210>1

<211>1270

<212>DNA

<213>利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)

<400>1

gggtctaata ccggatacga cacggggtcg catgacctcc gtgtggaaag ctccggcggt    60

gaaggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtggggtg atggcctacc aaggcgacga    120

cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc    180

tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa agcctgatgc agcgacgccg    240

cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag cagggaagaa gcgagagtga    300

cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg    360

cgcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggcttg tcacgtcgga    420

tgtgaaagcc cggggcttaa ccccgggtct gcattcgata cgggcaggct agagttcggt    480

aggggagatc ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg    540

tggcgaaggc ggatctctgg gccgatactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa    600

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgttgg gaactaggtg tgggcgacat    660

tccacgtcgt ccgtgccgca gctaacgcat taagttcccc gcctggggag tacggccgca    720

aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc agcggagcat gtggcttaat    780

tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacataca ccggaaaacc ctggagacag    840

ggtccccctt gtggtcggtg tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga    900

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttctg tgttgccagc atgcccttcg    960

gggtgatggg gactcacagg agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt    1020

caagtcatca tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaatga    1080

gctgcgatac cgcgaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc    1140

tgcaactcga ccccatgaag tcggagttgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg    1200

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga    1260

agccggtggc                                                           1270

Claims (10)

1.利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653。

2.利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653在制备纳他霉素敏感菌抑制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述纳他霉素敏感菌为酵母菌和霉菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述酵母菌为酿酒酵母。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述霉菌为灰葡萄孢。

6.一种纳他霉素敏感菌的抑制剂，是发酵所述利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A01 CGMCC No.1653得到的代谢产物。

7.根据权利要求6所述的抑制剂，其特征在于：所述利迪链霉菌A01 CGMCCNo.1653的发酵培养基为每升培养基中含有：黄豆粉2％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖2％，玉米浆0.25％，(NH₄)₂SO₄ 0.25％，MgSO₄.7H₂O 0.025％，K₂HPO₄ 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，其余为水；所述百分含量均为质量百分含量。

8.根据权利要求6或7所述的抑制剂，其特征在于：发酵所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的条件为：在28℃的条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速振荡培养96h-120小时。

9.一种制备权利要求6-8中任一所述的纳他霉素敏感菌的抑制剂的方法，是发酵所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653，得到的代谢产物即为纳他霉素敏感菌的抑制剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述利迪链霉菌A01 CGMCCNo.1653的发酵培养基为每升培养基中含有：黄豆粉2％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖2％，玉米浆0.25％，(NH₄)₂SO₄ 0.25％，MgSO₄.7H₂O 0.025％，K₂HPO₄ 0.002％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，其余为水；所述百分含量均为质量百分含量；

所述发酵利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 CGMCC No.1653的条件为：在28℃的条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速振荡培养96h-120小时。

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