KR20040034764A

KR20040034764A - 신균주 스트렙토마이세스 속 ８ｅ１２ 및 이를 이용한제초제

Info

Publication number: KR20040034764A
Application number: KR1020020062810A
Authority: KR
Inventors: 김창진; 이향범; 박동진; 유익동
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-10-15
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2004-04-29
Also published as: KR100477890B1

Abstract

본 발명은 신균주 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) 8E12 및 이를 이용한 제초제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 토양으로부터 분리된 신균주 스트렙토마이세스 속 8E12, 균배양액, 추출물, 그리고 이로부터 분리된 아미노글리코사이드계 항생제인 메톡시하이그로마이신(methoxyhygromycin) 또는 이의 유도체 에피-메톡시하이그로마이신(epi-methoxyhygromycin)이 유효성분으로 함유되어 있어 국내 논, 밭 잡초에 대하여 강한 제초활성을 나타내므로 생물농약으로서 이용 가능한 신규 제초제에 관한 것이다.

Description

신균주 스트렙토마이세스 속 ８Ｅ１２ 및 이를 이용한 제초제{A new Streptomyces sp. 8E12 and its use as a herbicidal agent}

농업생태계에서 잡초종은 대단히 종류가 많고 그 피해는 막대하다. 잡초는 작물의 생장에 필수적인 수분, 영양분, 그리고 태양광선을 작물과 경쟁함으로써 작물의 질과 수량을 저하시켜 작물생산성을 떨어뜨리는 중요한 제한요인이 되고 있다. 현재 잡초방제를 위하여 여러 종류의 유기합성 제초제가 사용되고 있음에도 불구하고 잡초에 의한 작물의 생산 손실은 여전히 많은데, 이는 제초제의 지속적 사용에 따른 잡초군락의 생태학적 변화, 제초제 저항성 유발, 그리고 현재 사용되고 있는 제초제로서는 방제가 어려운 새로운 잡초가 발생하기 때문이다. 지금까지 잡초방제를 위해 유기합성 제초제의 다량 사용에 따른 환경오염 및 인축독성 문제가 매우 심각하여 저독성이고 환경에 친화적인 새로운 미생물 제초제의 개발이 요구되어왔다. 그 결과, 지난 30여 년 간 100 여종 이상의 미생물(대부분이 곰팡이)이 잡초 방제효과가 있는 것으로 밝혀졌고, 현재 이중 10 여종의 미생물제초제(microbial herbicide)가 등록되어 사용되고 있다. 최근 전통적인 방법에 의한 우점 잡초종(dominant weed species)의 방제는 한계에 와 있으며, 경종적 방법과 병행하여 생물학적 방제법을 사용해야 한다는 필요성이 대두되면서 생물 제제의 사용이 선택적 잡초관리 및 방제는 물론 지구생물 다양성 보존 차원에서 매우 적절한 방제방법으로 받아들여지고 있다.

현재 병원성 미생물을 이용한 미생물 제초제의 개발과 관련 보고된 균주로서는 시클포드(sicklepod) 방제용으로서 알터나리아 카시아(Alternaria cassiae), 스퍼드 아노다(spurred anoda) 방제용으로서 알터나리아 마크로스포라(Alternaria macrospora), 이탤리안 티슬(Italian thistle) 방제용으로서 알터나리아 속(Alternariasp.), 프릭크리 시다(prickly sida) 방제용으로서 콜레토트리쿰 말바리움(Colletotrichum malvarium) 등 곰팡이가 대부분이다.

한편, 국내에서는 에피코코소루스(Epicoccosorus) 균주를 이용하여 논잡초의 하나인 올방개를 방제할 수 있는 미생물 제초제가 특허 출원된 바 있으며, 논잡초 가운데 가장 문제가 되는 피를 방제하기 위하여 엑세로힐룸 모노세라스(Exserohilum monoceras) 균주를 분리하고 이를 이용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 또한, 벗풀과 올미의 방제를 위한 플렉토스포리움(Plectosporium tabacinum)을 이용한 생물 제제의 개발이 시도되고 있다. 1991년에는 역병 증상을 나타내는 칡 병반을 수집하여 파이토프또라 에리뜨로셉티카(Phytophthora erythroseptica) 역병균주를 분리하고, 이 역병균의 포자를 재접종하여 발병정도를 관찰하고 생물 제제로서의 가능성을 제시한 바 있다.최근 한국생명공학연구원에서는 토끼풀(Trifolium repens), 까마중(Solanum nigrum), 자귀풀(Aeschynomene indica), 도꼬마리(Xanthium strimarium), 메꽃(Calystegia japonica) 등 몇 종류의 밭잡초를 효과적으로 방제할 수 있는 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum) 균주를 선발하여 초지용 미생물 제초제로서 개발하고 특허로 등록하는 등 밭잡초 방제용 미생물제초제로서의 활용 가능성을 보여주고 있고, 미로쎄시움 로리둠(Myrothecium roridum) 균주를 이용한 광역 잡초방제용 생물제제를 개발하고 특허로 등록한 바 있다.

이러한 미생물 제초제는 기존의 합성제초제를 대체할 수 있는 자연친화적인 방제법으로 받아들여지고 있다. 최근에는 잡초방제를 위해 미생물 유래의 식물독소(phytotoxins)를 응용한 연구가 많이 이루어지고 있다. 지금까지 제초성 미생물 대사산물로는 사이크로헥시미드(cycloheximide), 허비마이신(herbimycin), 허비사이딘(herbicidin), 아니소마이신(anisomycin), 포살라신(phosalacin) 등을 들 수 있으며 그외 30여 종류의 대사산물이 보고되고 있다. 그 중에서도 방선균 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생산되는 바이알라포스(bialaphos)는 가장 상업적으로 성공한 미생물유래 제초활성 물질이다. 또한, 마이코겐(Mycogen)사에서는 스트렙토마이세스 카시아(Streptomyces cassia)균주를 이용한 제초제 개발 연구를 한 바 있다. 그러나, 국내에서는 아직까지 방선균 자체 및 방선균 유래 제초활성 물질을 이용한 생물학적 잡초방제를 위한 연구는 시도된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 토양유래 방선균을 이용하여 국내 주요 잡초종을 생물학적인 방법으로 방제하는 방법을 연구 개발하던 중, 국내 잡초종에 대해 높은 제초효과를 나타내는 새로운 방선균 균주를 분리하였으며, 동정 결과 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.)임을 확인하였고, 이 균주 자체(포자 등), 균 배양액 및 주요 제초활성 물질로 분리된 메톡시하이그로마이신 또는 에피-메톡시하이그로마이신을 이용하여 잡초 방제 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 잡초종에 대하여 선택적 제초효과를 나타내는 신균주 스트렙토마이세스 속 8E12(KCTC 10336BP), 균배양액, 추출물, 그리고 이로부터 분리된 메톡시하이그로마이신 또는 에피-메톡시하이그로마이신을 이용한 제초제를 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 신균주 스트렙토마이세스 속 8E12(KCTC 10336BP)의 연쇄상 실린더형의 포자를 보여주는 사진이다.

도 2는 신균주 스트렙토마이세스 속 8E12(KCTC 10336BP) 배양액으로부터 분리한 메톡시하이그로마이신의 SI-MS에 의한 분자량분석 그림이다.

도 3은 메톡시하이그로마이신의 수소-핵자기공명(¹H-NMR) 사진을 보여주는 그림이다.

도 4는 메톡시하이그로마이신의 탄소-핵자기공명(¹³C-NMR) 사진을 보여주는 그림이다.

도 5는 메톡시하이그로마이신의 바랭이에 대한 선택적 제초활성 및 백화증상을 보여주는 그림이다[처리농도는 폿트(2반복)당 왼쪽부터 대조구, 16 mg, 8 mg, 4 mg, 1 mg, 0.25 mg, 0.1 mg이며, 처리 2주 후의 실험결과임].

본 발명은 신균주 방선균 스트렙토마이세스 속 8E12(KCTC 10336BP)를 그 특징으로 한다.

또한, 상기 스트렙토마이세스 속 8E12(KCTC 10336BP) 균주 자체, 균배양액, 추출물, 그리고 이로부터 분리된 활성물질 메톡시하이그로마이신(methoxyhygromycin) 또는 에피-메톡시하이그로마이신(epi-methoxyhygromycin)이 제초활성이 있음을 확인하고 생물농약으로서의 이용가능한제조체를 또 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명자들은 식물병 방제를 위한 새로운 미생물을 탐색하고자 전국각지로부터 많은 토양시료를 수집하고, 수집한 토양시료로부터 벤넷 한천(Bennett's agar) 배지를 이용하여 선택적인 제초활성을 보이는 균주를 분리하였다. 분리된 방선균을 액체배양하여in vitro페트리 플레이트상 바랭이 및 피종자 발아저해 및in vivo폿트상 실험 등을 실시하여 활성이 가장 우수한 한 균주를 선발하였다. 또한, 이로부터 아미노글리코사이드계 제초활성 물질인 메톡시하이그로마이신 및 에피-메톡시하이그로마이신을 순수분리하고 이의 화학구조를 구명하였으며in vivo제초활성을 확인하였다.

상기 균주의 동정, 배양, 활성검정 및 활성물질의 분리에 관하여 설명하면 다음과 같다.

가. 균주의 분리, 배양 및 동정

1) 균의 분리 및 동정

아이에스피(ISP; International Streptomycets Project) 규정에 따라 28 ℃에서 14일간 배양하고, 광학현미경 및 전자현미경 하에서 형태적 특성을 조사한 결과, 본 균의 포자의 연쇄형태는 도 1에서와 같이 렉티플렉시빌리스(rectiflexibiles) 형태를 나타내었으며 연쇄상 포자의 수는 5 ∼ 10 혹은 10개 이상이었고, 포자의 표면은 매끄럽고, 포자는 실린더형으로 크기는 0.6 ∼ 0.7 ×1.0 ∼ 1.2 이었다.

2) 배양적 특성

각종 아이에스피 배지조건에서 28 ℃에서 14일간 배양한 후 본 균주의 배양 생리적 특성을 조사하였으며, 그 결과는 다음 표 1과 같다. 본 균주의 생육정도는 효모ㆍ맥아 한천, 타이로신 한천 배지에서는 비교적 양호한 생육정도를 나타내었고 수용성 색소를 잘 형성하였다. 기타 다른 배지에서는 균사생육은 물론 기균사의 생장도 빈약하였다.

배지의 종류	포자체 색상	기균사	기질균사	수용성색소
배지의 종류	포자체 색상	생육정도	색상	수용성색소	생육정도	색상
효모-맥아한천 배지(ISP 2)	백색	보통	백색	빈약	노랑밤색	노랑밤색
오토밀 배지(ISP 3)	백색	보통(빈약)	백색	보통	백색	노랑밤색
무기염류-전분한천 배지 (ISP 4)	백-회색	왜소(빈약)	백-회색	보통	노랑밤색	노랑밤색
글리세롤-아스파라진 한천 배지 (ISP 5)	백색	매우왜소(빈약)	백색	보통	노랑밤색	노랑밤색
티로신한천 배지(ISP 7)	백-회색	보통	백-회색	보통	노랑밤색	멜라노이드

3) 생리적 특성

본 균주의 생리적 특성을 조사하기 위하여 쉴링-거트리브 한천 배지를 사용하여 28 ℃에서 14일간 배양한 후 전분가수분해능, 젤라틴 액화능, 스킴밀크 응집능, 멜라노이드 형성능, 가제인 가수분해능, 식염내성 정도 등을 조사하였으며 이를 다음 표 2에 나타내었다.

조사 항목	특 성
멜라닌색소 생성	양성
겔라틴 액화반응	음성
수용성색소 생성	음성
전분 가수분해	음성
스킴밀크 응집화	음성
내염정도	3% 이하

4) 탄소원 이용성

본 균주의 탄소원 이용성을 조사하기 위하여 쉴링-거트리브 한천배지를 사용하여 28 ℃에서 14일간 배양한 후 탄소원 이용능력을 조사하였으며 그 결과를 다음 표 3에 나타내었다. 본 균주는 공시한 12 종류의 탄소원 중 D-글루코스, L-아라비노스, 미오-이노시톨, D-만니톨, 라피노스, 갈락토스, D-후락토스를 잘 이용하였으나 D-자이로스는 잘 이용하지 못하였다. 또한, 람노스, 살리신, 슈크로스, 셀루로스 등은 전혀 이용하지 못하였다.

당	이용성
D-글루코스(D-glucose)	양성
L-아라비노스(L-arabinose)	양성
D-후락토스(D-fructose)	양성
갈락토스(galactose)	양성
미오-이노시톨(myo-inositol)	음성
D-만니톨(D-mannitol)	양성
라피노스(raffinose)	양성
람노스(rhamnose)	음성
슈크로스(sucrose)	음성
D-자이로스(D-xylose)	미약
셀루로스(cellulose)	음성
살리신(salicin)	음성

5) 균체성분

본 균주의 균체세포벽 성분을 벡커 등의 방법[Becker 등, Applied Microbiology 12: 421-423, 1964]에 따라 조사한 결과 본 균주의 균체 가수분해 성분인 디아미노피메린산(diamino-pimellic acid)은 LL형이었다.

이상과 같이 본 균주의 형태적, 배양적, 생리적 특성 또는 당이용성, 균체성분을 조사한 결과에 따라 본 균주를 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주로 동정하였으며, 본 균주를 스트렙토마이세스 속 8E12(Streptomycessp. 8E12)로 명명하고 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2002년 9월 11일자로 기탁하여 수탁 번호 KCTC 10336BP를 부여받았다.

2. 균주의 배양

본 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 발효용 배지로는 글루코오스 + 가용성녹말(GSS) 배지를 사용하였고, 질소원으로는 거친 콩가루, 효모추출물, 육즙을 사용하며, 디포타시움 하이드로겐포스페이트(dipotassium hydrogenphosphate)를 첨가하고, pH조절을 위하여는 칼시움 카보네이트(calcium carbonate)를 사용하여 배양한다. 배양방법으로는 호기적조건에서 5리터용 발효기(jar fermentor)에서 진탕배양하고, 배양온도는 28℃로 한다. 발효용 배지에 접종할 접종원은 삼각플라스크에서 종균을 3일간 전배양하고 각 발효기에 3% 수준으로 접종한다. 소포제는 네오린(neorin)을 첨가하고, 통기량은 1 vvm, 280 rpm으로 하여 배양하였을 경우 1 ㎖당 10⁹이상의 균밀도를 나태냄으로써 스트렙토마이세스 속 8E12 균배양시 최적배지로 선발되었다.

한편, 스트렙토마이세스 속 8E12 균주의 고체 대량배양을 위하여 액상배양에서 선발된 성분을 함유하는 기존에 상용화된 벤넷 배지(Bennett's broth)를 펄라이트에 흡착하여 배양병에 담아 멸균한 다음 스트렙토마이세스 속 8E12 균주를 접종하여 배양한 결과 접종 7일 후 흡착된 펄라이트에서 1 g당 10⁹수준의 균포자 밀도가 조사되었으며 수분흡수가 용이하여 유용한 미생물제제로 확인되었다.

3. 제초활성 검정

배양조건의 조사를 위하여 매 24시간마다 배양액의 일부를 채취하여 배양액의 제초활성을 검정하였다.

분리된 균주에 대해 소형 폿트(pot)를 이용하여 공시 14종의 잡초종에 대하여in vitro및in vivo활성검정을 실시한 결과, 선택적인 제초활성이 있음을 확인하였다.

4. 활성물질 분리 구조규명

활성물질의 분리정제를 위해서는 발효기상에서 배양한 배양액을 원심분리하여 균체는 제거하고 얻어진 배양상등액을 사용한다. 먼저 배양 상등액을 활성탄 컬럼에 통과시켜 흡착시킨 후 아세톤으로 세척 및 용출시켜 감압농축하였다. 이어 농축액을 부탄올로 3회 추출하였으며 활성분획인 부탄올층을 감압농축하여 클로로포름과 메탄올 혼합액을 용매로 하는 실리카겔 컬럼 상에서 전개시켜 활성분획을 얻고, 다시 감압농축한 후 메탄올을 용매로 하는 컬럼크로마토그래피 상에서 분리하고 HPLC상에서 분석하여, 순수한 제초활성물질을 얻는다. 분리된 활성물질의 분자량(Mass), 핵자기공명(NMR), 자외선(UV) 분석 등을 통하여 아미노글리코시드(aminoglycodisde)계 항생제인 메톡시하이그로마이신(methoxyhygromycin)과 에피-메톡시하이그로마이신임을 확인하였으며 분리비율도 대략 3: 1의 비율로 분리되었다.

이하, 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) 8E12 자체와, 제초활성물질인 메톡시하이그로마이신 및 그 유도체를 이용한 잡초방제에 대하여 다음의 실시예를 통하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다. 물론, 본 발명은 다음에 기술하는 실시예에만 국한되지 않고 방제 대상 잡초종, 배지의 종류, 배양조건 등을 크게 바꾸어도 활성을 나타낼 수 있음을 나타낸다.

실시예 1: 신균주 스트렙토마이세스 속 8E12(KCTC 10336BP) 액체배양

종배지 및 생산배지로서 본 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양하였다. 글루코오스 20%, 가용성녹말 10%, 거친콩가루 25%, 육즙 1%, 효모추출액 4%, NaCl 2%, K₂HPO₄0.25%, CaCO₃2%를 함유한 배지에 pH 7.2로 조정한 후 사용하였다. 500 ㎖의 배플드 플라스크(baffled flask) 2개에 각각 50 ㎖씩 분주한 종배지를 121 ℃에서 20분간 살균하고, 이것에 균주의 한천조각을 접종하고 28 ℃, 150 rpm에서 2일간 진탕 배양하여 배양기의 종배양으로 사용하였다. 121 ℃에서 20분 살균한 1000 ㎖을 함유한 5 ℓ발효기에 종배양액 3%를 접종하여 28 ℃에서 7일간 진탕 배양하였으며, 소포제로는 네오린(neorin)을 0.2% 첨가하였고, 통기량은 1 vvm, 280 rpm의 속도로 배양하였다.

실시예 2: 신균주 스트렙토마이세스 속 8E12(KCTC 10336BP) 고체배양

스트렙토마이세스 속 8E12 균주의 고체 대량배양을 위하여 액상배양에서 선발된 성분, 즉 글루코오스, 효모추출액, 펩톤, 소고기육즙, 비타민을 함유하는 기존에 상용화된 벤넷배지(Bennett's broth)를 펄라이트에 흡착하여 800 cc 배양병에 담아 멸균한 다음 스트렙토마이세스 속 8E12 균주를 접종하여 배양한 결과 접종 7일 후 흡착된 펄라이트에서 1 g당 10⁹수준의 높은 밀도의 균포자가 생성되었는바 펄라이트 흡착방법이 방선균 포자 대량생산을 위한 균배양에 유용한 방법으로 이용될 수 있다.

실시예 3: 제초활성 물질 분리

상기 실시에 의하여 얻은 배양액을 사용하여 제초활성 물질을 순수분리하였다. 분리정제를 위해서는 배양액을 원심분리하여 균체는 제거하고 얻어진 배양상등액을 사용하였다. 먼저 배양상등액을 활성탄컬럼에 통과시켜 흡착시킨 후 30% 아세톤으로 씻어(washing)내고 80% 아세톤으로 활성분획을 용출(eluting)시켜감압농축하였다. 이어 농축액을 부탄올로 3회 추출하였으며 활성분획인 부탄올층을 감압농축하여 클로로포름 : 메탄올(4 : 1, v/v)을 용매로 하는 실리카겔 컬럼(300 cc)상에서 전개시켜 활성분획을 얻고 다시 감압농축한 후 메탄올을 용매로 하는 세파덱스엘에치-20(Sephadex LH-20), 세파덱스지-10(Sephadex G-10)상에서 분리하고 HPLC상에서 분석하여 순수한 제초활성물질 40 mg을 얻었다. 이 과정에서 분리되는 메톡시하이그로마이신과 에피-메톡시하이그로마이신의 양은 대략 3 : 1의 비율로 분리되었다.

1) UV 스펙트럼

UV 스펙트럼은 시료를 MeOH에 녹여서 측정하였다. 실리카겔 박층크로마토그래피 판에서는 클로로포름 : 메탄올(4 : 1, v/v)을 전개용매로 하였을 때는 Rf치 0.22, 부탄올: 메탄올: 물(4: 1: 1, v/v)를 전개용매로 하였을 때는 Rf치 0.70을 나타내었다. 스트렙토마이세스 속 8E12 균배양체로부터 분리정제된 제초활성물질의 특성을 조사한 결과 이는 수용성 물질로서 물에는 아주 잘 녹고 메탄올에도 잘 녹으나 기타의 유기용매, 에틸아세테이트, 클로로포름, 벤젠 등에는 잘 녹지 않았다. 스트렙토마이세스 속 8E12 균주가 생산하는 제초활성물질의 UV 흡수특성은 중성에서는 최대흡수파장(λmax)이 214, 270, 300 nm이었으며, 산성에서는 이동(shift)이 일어나지 않았지만, 알칼리성에는 250, 280, 322 nm를 나타냈다.

2) Mass(SI-MS) 스펙트럼

분자량을 조사하기 위해 SI-MS(selective ion mass spectroscopy) 스펙트럼을 분석한 결과 도 2에서 보는 바와 같이 (M+H)⁺이온 피크가 514로 실제 분자량은 513으로 확인되었으며 기존의 메톡시하이그로마이신과 동일물질인 것으로 확인하였다.

3) 수소- 및 탄소-핵자기공명(¹H- 및¹³C-NMR) 스펙트럼

구조확인을 위하여 조사한¹H-NMR 및¹³C-NMR 스펙트럼을 조사하였으며 표준물질로는 TMS를, 용매는 CD₃OD를 사용하였다. 도 3 및 4에서처럼¹H-NMR 및¹³C-NMR 스펙트럼을 분석한 결과 분자구조가 C₂₃H₃₁NO₁₂로 다음 화학식 1로 표시되며, 기존의 Yoshida 등(1990) 및 Chida 등(1991)의 보고와 일치하는 것으로 나타났다.

신균주로부터 분리된 메톡시하이그로마이신의 물리화학적 성상

성상	백색분말
분자량(SI-MS, m/z)	514 (M+H)⁺
UV 최대흡수파장(메탄올) nm	214 270 300 (s)
UV 최대흡수파장(MeOH-HCl) nm	214 270 300 (s)
UV 최대흡수파장(MeOH-NaOH) nm	250 280 (s) 322
용해성	물, 메탄올에 수용성; 에틸아세테이트, 클로로포름,벤젠 등에 비수용성
박층 크로마토그래피(실리카겔)	0.22(클로로포름: 메탄올, 4: 1, v/v)

이상의 결과 본 제초활성물질은 하이그로마이신-A(hygromycin-A)와 유사한 메톡시하이그로마이신 및 에피-메톡시하이그로마이신으로 동정되었는바 지금까지 메톡시하이그로마이신의 항세균활성에 대해서는 보고된 바 있으나 제초활성 등에 관하여는 본 연구가 처음이다.

실시예 4: in vitro 활성검정

분리균의 1차in vitro제초활성 실험은 바랭이 및 피의 종자발아 저해법을 통하여 실시하였다. 종자발아 저해검정법은 바랭이 및 피 종자를 습실 처리된 플레이트 상에 깔고 그 위에 균배양액 및 추출물 메톡시하이그로마이신 등을 접종 처리한 후 종자발아 및 유묘신장 정도를 조사하는 방법과, 3 ∼ 4 일간 미리 종자발아를 유도시킨 후 유묘체에 직접 처리하는 방법이다. 즉, 여과지 3장을 살균수에 묻혀 플레이트에 깐 후 바랭이, 피 등의 발아전 종자와 발아된 유묘에 균배양액 및 추출된 메톡시하이그로마이신을 원액에서 수배까지 희석하여 일정농도로 처리하고 광조건 하의 습실 배양기에서 치상하는 방법이다.

그 결과, 스트렙토마이세스 속 8E12 균 배양체와 배양체 추출물이 바랭이 및피에 높은 선택적 제초활성이 있음을 확인하였으며 이러한 정보를 토대로in vivo폿트 상에서의 제초활성 실험을 실시하게 되었다.

실시예 5: 온실 조건하 in vivo 폿트 활성 실험

잡초에 병원성 및 제초 활성이 있는 균주를 선발하기 위하여 1차 스크리닝은 대상잡초(수수, 돌피, 개밀, 바랭이, 미국개기장, 까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽃, 바랭이, 돌피, 명아주 및 토끼풀 등)의 잎에 균 배양액 또는 포자 현탁액을 직접 폿트에 처리하여 검정하였다.In vivo제초활성 검정을 위한 식물체는 멸균되지 않은 사질토양에 적당량의 비료를 혼합시킨 다음, 시험용 폿트(150, 350 cm²)에 담고 파종구를 만들어 잡초 또는 작물종자를 파종한 후 곱게 친 흙으로 복토한 후 온실에서 자란 것을 공시하였으며 처리할 배양액 및 분리물질인 메톡시하이그로마이신 용액(0.2%의 Tween 20 용액 미량 첨가) 용액을 만들어 손분무기(hand sprayer)로 처리하며 경엽 처리하였다.

배양액은 원액에서 수배까지 희석하여 처리하였으며 배양추출물은 폿트당 각 활성물질 유효농도 0.1 ∼ 16 mg의 농도로 처리한 후 온실에서 2주일간 생육시키면서 처리 4일 및 14일 후에 나타나는 제초활성 효능을 형태학적, 생리학적 관찰근거에 의해 달관 조사하였다. 처리는 발아 전(pre-emergence)과 발아 후(post-emergence)로 나누어 제초활성을 조사하였다. 무방제의 경우를 0, 완전방제의 경우를 100%으로 하여 각각의 제초활성 정도를 평가하는데 70% 이상의 등급을 가지면 실제적으로 그 식물에 대하여 제초효과가 있는 것으로 간주하며 80% 이상의 제초효과를 보인 초종을 방제가능 초종으로 간주하였다. 그 결과는 다음 표 5 및 도 5에 나타내었다.

메톡시하이그로마이신의 제초효과

자엽	잡초종	화합물(kg/ha)
자엽	잡초종	4	2	1	0.5	0.25
단자엽	Sorghum bicolor(수수)	100^*	90	80	70	45
	Echinochloa crus-galli(피)	100	100	100	90	90
	Agropyron smithii(개밀)	65	50	40	0	0
	Digitaria sanguinalis(바랭이)	100	100	100	80	90
	Panicum dichotomiflorum(미국개기장)	100	100	60	10	20
쌍자엽	Solanum nigrum(까마중)	90	50	50	0	0
	Aeschynomene indica(자귀풀)	90	90	90	80	50
	Abutilon avicennae(어저귀)	50	40	60	20	0
	Xanthium strumarium(도꼬마리)	30	20	0	0	0
	Calystegia japonica(메꽃)	65	60	20	0	0
^*제초효과는 처리 14일 후 평가되었으며 0: 비효과, 10-30: 미세효과, 40-60: 중도효과, 70-90: 강한 효과, 100: 완전한 제초효과를 나타냄

또한, 도 5에서 보는 바와 같이 메톡시하이그로마이신은 바랭이, 피 등에 대해 선택적인 제초활성을 나타냈으며 특히 백화현상(albino symptom)을 일으키는 특징을 나타내 색소저해(pigment inhibition) 활성능을 가지는 것으로 판단되었다.

본 연구결과 진탕배양의 경우 90시간 배양함으로써 활성물질의 생산이 최고에 달함을 확인하였으며 본 균주는 물론 분리된 제초활성물질과 함께 생물제제원으로 사용될 수 있음을 보여주었다.

실시예 6: 미생물제초제의 제초효과

상기 실시예 2에서 스트렙토마이세스 속 8E12 균주를 고체배양하여 1 ×10⁷포자/g의 농도 수준으로 미생물제초제를 만들고 멸균수에 현탁하여 바랭이 등을 비롯한 잡초종에 처리하고 그 제초활성을 관찰하였다. 균주의 제초작용을 상기 실시예 5에서와 유사한 기준에 의해서 평가하였다. 그 결과는 다음 표 6에서 나타낸 바와 같다.

스트렙토마이세스 8E12 제제의in vivo제초활성

학명	일반명	방제효과
Abutilon avicennae	Velvetleaf(어저귀)	+
Aeschynomene indica	Indian jointvetch(자귀풀)	+++
Agropyron smithii	Cheatgrass(개밀)	+-
Calystegia japonica	Bindweed(메꽃)	+-
Digitaria sanguinalis	Large crabgrass(바랭이)	+++
Echinochloa crus-galli	Barnyardgrass(돌피)	+++
Oryzae sativa	Rice(벼)	+-
Panicum dichotomiflorum	Fall panicum(미국개기장)	+
Sagittaria pygmaea	Arrow head(올미)	+
Solanum nigrum	Black nightshade(까마중)	+-
Sorghum bicolor	Sorghum(수수)	++
Xanthium strumarium	Cocklebur(도꼬마리)	+-
* 방제가는 접종 4주 후의 결과임+: <30%, +-:<50%, ++: <70%, +++: <90%

상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 신균주는 여러 밭잡초종과 몇몇 논잡초종에 대하여제초활성을 나타내며, 특히 바랭이, 자귀풀, 미국개기장 등의 밭잡초종과 피 등의 논잡초종에 대하여 강한 제초효과를 나타내었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 바랭이, 피 등 잡초종에 대해 선택적인 제초활성을 나타내는 우수한 균주를 분리하여 균주의 형태적, 생화학적 특성을 분석한 결과, 이를 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.)으로 동정하였으며, 스트렙토마이세스 8E12 균체, 균배양액, 추출물, 이로부터 분리된 메톡시하이그로마이신 또는 에피-메톡시하이그로마이신이 선택적인 제초활성이 있음을 확인하고 이러한 생물활성에 대한 정보에 착안하여 친환경형 생물농약으로서 유용한 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

제초활성을 가지는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) 8E12[KCTC 10336BP] 균주.
스트렙토마이세스 속 8E12[KCTC 10336BP] 균 배양액 또는 추출물과 농학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제초제.
메톡시하이그로마이신 또는 에피-메톡시하이그로마이신과 농학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제초제.
글루코오스, 효모추출물, 펩톤, 소고기육즙, 바타민을 함유하는 배지를 펄라이트에 흡착하여 멸균시킨 후 균을 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 포자대량생산을 위한 고체배양법.
제 4 항에 있어서, 상기 균은 스트렙토마이세스 속 8E12[KCTC 10336BP]인 것을 특징으로 하는 고체배양법.
1) 스트렙토마이세스 속 8E12[KCTC 10336BP]의 배양액에서 균체를 제거하고 배양상등액을 얻는 단계;

2) 상기 배양상등액을 활성탄컬럼에 흡착시킨 후 아세톤으로 활성분획을 용출시켜 감압농축시키는 단계;

3) 상기 농축액을 부탄올로 추출하여 부탄올층을 감압농축하고 클로로포름과 메탄올의 혼합액을 실리카겔 컬럼상에서 전개시켜 활성분획을 얻는 단계; 및

4) 상기 활성분획을 감압농축하고 메탄올로 컬럼크로마토그래피 상에서 분리하여 HPLC 상에서 분석하는 단계를 포함하는 메톡시하이그로마이신 및 에피-메톡시하이그로마이신의 분리방법.