CN104611283B - 一种重组利迪链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组利迪链霉菌及其应用。本发明的重组利迪链霉菌的构建方法，包括将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到纳他霉素产量高于所述宿主菌的重组利迪链霉菌的步骤；所述纳他霉素合成正调控基因编码如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；b)将SEQ IDNo.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与纳他霉素合成相关的由a)衍生的蛋白质。本发明的重组利迪链霉菌，具有比野生型显著提高的产纳他霉素和抑菌能力，可以应用于食品、生物能源及饲料添加等方面。

Description

一种重组利迪链霉菌及其应用
本申请是申请号为201210579816.5、申请日为2012年12月27日、发明创造名称为“产纳他霉素的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因工程菌及其构建方法与应用，特别涉及一种重组利迪链霉菌及其应用。
背景技术
随着农作物种植结构的调整和栽培方式的变化，许多作物真菌性病害的发生和危害日趋严重，如甘蓝枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)、小麦纹枯病菌(R.cerealis)、桃褐腐病菌(M.fructicola)、苹果轮纹病菌(B.berengeriana)、百合根腐病菌(F.oxysporum)等病原菌的危害也十分严重(耿丽华等，2009)。一般的化学农药都难以凑效，且频繁使用增加了病原菌的抗药性，污染了生态环境，因此亟待开发新的、环境友好型的高效微生物农药已成为近年病害生防领域的一大热点。
纳他霉素(natamycin)是一种多烯大环内酯类抗生素，也称匹马菌素或游霉素(Pimaricin),分子式为C33H47O13。研究报道natamycin对几乎所有的酵母菌、霉菌具有抗性，是一种极具有潜力的广谱抗菌剂，能够显著抑制甘蓝枯萎病菌(F.oxysporumf.s.conglutinans)、苹果轮斑病菌(A.mali)、辣椒灰霉病菌(B.cinerea)、葡萄灰霉病菌(B.cinerea)、黄瓜枯萎病菌(F.f.sp.cucumerinum)、茄子早疫病菌(A.solani)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、桃褐腐病菌(M.fructicola)、李子褐腐病菌(M.fructicola)等病原菌的生长，并且不易产生抗药性，在防治植物真菌病害方面显示了良好的应用前景(teWelscher et al.,2008；Du et al.,2009；隋勤等，2007)。此外，natamycin作为食品防腐剂是我国批准使用仅有的2种食品生物防腐剂之一(另一个是乳酸链球菌素，Nisin)，还被应用于临床医疗，用于治疗真菌引起的皮肤和粘膜感染等(Davidson andDoan,1993；程良英，2010)。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供纳他霉素产量高的重组利迪链霉菌及其构建方法。
本发明所提供的构建重组利迪链霉菌的方法，包括将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到纳他霉素产量高于所述宿主菌的重组利迪链霉菌的步骤；
所述纳他霉素合成正调控基因编码如下a)或b)的蛋白质：
a)氨基酸序列如SEQ ID No1所示的蛋白质；
b)将SEQ ID No.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与纳他霉素合成相关的由a)衍生的蛋白质。
其中，SEQ ID No.1由192个氨基酸残基组成。
上述方法中，所述纳他霉素合成正调控基因的编码序列为SEQ ID No.2的第433-1011位。所述纳他霉素合成正调控基因的序列具体可为SEQ ID No.2的第14-1011位。
其中，SEQ ID No.2由1019个核苷酸组成，第1-13位为NdeⅠ识别位点和保护碱基，第14-432位为红霉素抗性基因启动子，第433-1011位为纳他霉素合成正调控基因的编码序列，第1012-1019为EcoRI识别位点和保护碱基。
上述方法中，所述将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括如下步骤：将所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得所述重组利迪链霉菌；所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体中，启动所述纳他霉素合成正调控基因的启动子是红霉素抗性基因启动子。
在本发明的一个实施例中，所述红霉素抗性基因启动子的核苷酸序列是SEQIDNo.3。
其中，SEQ ID No.3由199个核苷酸组成。
在本发明的实施例中，所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体为将所述纳他霉素合成正调控基因插入pIB139的所述红霉素抗性基因启动子下游得到的重组表达载体，具体是将SEQ ID No.2所示的DNA片段经NdeI和EcoRI酶切后插入pIB139的NdeI和EcoRI位点得到的重组表达载体pIB139-slnM。
在本发明的实施例中，所述作为宿主菌的利迪链霉菌可为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654，所述大肠杆菌为去甲基化E.coliET12567(pUZ8002)。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供由上述任一种方法得到的重组利迪链霉菌。
所述重组利迪链霉菌具体可为利迪链霉菌AM02，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6815。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供所述重组利迪链霉菌的用途。
本发明所提供的用途是下述1)或2)或3)：
1)所述重组利迪链霉菌在生产那他霉素中的应用；
2)所述重组利迪链霉菌在制备植物病原真菌抑制剂中的应用；
3)所述重组利迪链霉菌在抑制植物真菌病害中的应用。
上述应用中，所述植物病原真菌为下述至少一种：甘蓝枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)；所述植物真菌病害为下述至少一种：由甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)引起的病害。
实验证明，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815纳他霉素产量在YEME培养基上约是野生型菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCCNo.1654的3倍(图3)，在发酵培养基上约是野生型菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654的2倍(图4)。利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)的抑菌活性是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654的1.8倍，对西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)的抑菌活性是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654的2.2倍。本发明的重组利迪链霉菌，具有比野生型显著提高的产纳他霉素和抑菌能力，由于纳他霉素可以作为食品保鲜剂及饲料添加剂，因此，本发明的重组利迪链霉菌可以应用于食品、生物能源及饲料添加等方面。
生物材料信息
分类命名：利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)
菌株编号：AM02
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2012年11月12日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6815
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
附图说明
图1为pIB139-slnM的NdeI和EcoRI酶切结果。
其中，泳道M为DNA分子量标准，1为pIB139-slnM。
图2为阿泊拉霉素抗性PCR验证转化子的电泳图谱。
图3为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02和利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02在YEME培养基中的纳他霉素产量比较。
图4为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02和利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02在发酵培养基中的纳他霉素产量比较。
图5为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02和利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02的抑菌活性比较。
A中的病原菌为甘蓝枯萎病菌，左侧为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02对甘蓝枯萎病菌的抑菌圈，右侧为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02对甘蓝枯萎病菌的抑菌圈。
B中的病原菌为西瓜枯萎病菌，左侧为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02对西瓜枯萎病菌的抑菌圈，右侧为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02对西瓜枯萎病菌的抑菌圈。
图6A为利迪链霉菌活性产物的HPLC第一次分离谱图。
图6B为利迪链霉菌活性产物的HPLC第三次分离谱图。
图7为纳他霉素样品的紫外扫描图谱。
图8为纳他霉素样品的红外吸收光谱。
图9A为纳他霉素样品的高分辨质谱图(负离子)。
图9B为纳他霉素样品的高分辨质谱图(正离子)。
图10A为纳他霉素样品的核磁共振碳谱(500MHz)。
图10B为纳他霉素样品的核磁共振氢谱(500MHz)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的链霉菌表达载体pIB139(Christopher J.Wilkinson，etal.Increasing the Efficiency of Heterologous Promoters inActinomycetes.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2002)4(4):417–426.)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。
下述实施例中的去甲基化E.coliET12567(pUZ8002)(Sun-Uk Choi,Chang-KwonLee,Yong-Il Hwang,Hiroshi Kinoshita,and Takuya Nihira(2004)Cloning andFunctional Analysis by Gene Disruption of a Gene Encoding aγ-ButyrolactoneAutoregulator Receptor from Kitasatospora setae.JOURNAL OF BACTERIOLOGY,186:3423–3430.)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。
下述实施例中的病原菌甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)(隋勤,刘伟成,裘季燕,刘霆,潘争艳,刘学敏.利迪链霉菌A02的抑菌谱及其抑菌活性的稳定性.植物保护,2007,33(5)67-71；卢彩鸽，刘伟成，刘霆，董丹，张涛涛，刘德文.利迪链霉菌A01活性代谢产物对甘蓝枯萎病菌的抑制作用及其机理.中国农业科学2012，45(18):3764-3772)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。
实施例1、构建高产纳他霉素的重组利迪链霉菌
一、纤维素酶基因表达载体pIB139-slnM的构建
本实施例构建的纳他霉素合成正调控基因的表达载体名称为pIB139-slnM，该载体中含有纳他霉素合成正调控基因slnM。纳他霉素合成正调控基因slnM的序列如SEQ IDNo.2所示。SEQ ID No.2由1019个核苷酸组成，第1-13位为NdeⅠ识别位点和保护碱基，第14-432位为红霉素抗性基因启动子，第433-1011位为纳他霉素合成正调控基因的编码序列，第1012-1019为EcoRI识别位点和保护碱基。
pIB139-slnM中启动该纳他霉素合成正调控基因转录的启动子是红霉素抗性基因启动子(SEQ ID No.3)。
pIB139-slnM的具体构建方法如下：将SEQ ID No.1所示的两端带有NdeI和EcoRI酶切位点的slnM片段经NdeI和EcoRI酶切后与经过相同酶切的链霉菌表达载体pIB139(携带SEQ ID No.3的红霉素抗性基因启动子PermE)连接，得到将pIB139的NdeI和EcoRI之间的片段替换为带有自身启动子纳他霉素合成正调控基因slnM序列的重组表达载体pIB139-slnM。pIB139-slnM转化大肠杆菌DH5α，以阿泊拉霉素(apramycin)抗性筛选从而获得携带正调控基因及其自身启动子序列的转化子，该转化子以p1(GGAATTCCATATGCGGTCGGAGGTGCGGGCATGAC)和p2(GGAATTCTCACTTCACGAAGTCGTCCAC)为引物进行PCR扩增得到约1101bp的片段，用NdeI和EcoRI酶切pIB139-slnM得到5.9kb的pIB139质粒片段及约998bp的带有自身启动子纳他霉素合成正调控基因slnM序列(图1)，从而确定该正调控基因双启动子表达载体构建成功。
二、利用pIB139-slnM将带有自身启动子纳他霉素合成正调控基因slnM导入利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654得到纳他霉素高产菌株——利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815
将pIB139-slnM载体转化去甲基化E.coliET12567(pUZ8002)，通过两亲接合的方法，转化利迪链霉菌A02，通过阿伯拉霉素抗性筛选得到阳性转化子，PCR验证得到正确的转化子。具体转化方法如下：
1)将pIB139-slnM载体转化去甲基化E.coliET12567(pUZ8002)
通过热激法将pIB139-slnM载体导入E.coliET12567(pUZ8002)并经过60μg/ml阿泊拉霉素抗性筛选得到转入pIB139-slnM载体的重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-slnM。
2)两亲接合构建那他霉素高产的重组利迪链霉菌
参考文献(Bierman M et al.1992)进行两亲接合，具体方法如下：
将重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-slnM接种到含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm，培养过夜，次日早晨按1％的接种量接到新鲜LB培养基中培养至OD600＝0.4-0.6，收集菌液，4℃，4000rpm，离心2min，弃上清，用20mL冰冷的纯的LB培养液重悬沉淀，4℃，4000rpm，离心2min，弃上清，目的是洗去抗生素。用2mL冰冷的纯的LB培养液重悬沉淀。(2)将PDA斜面生长2周的利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02CGMCC No.1654(CN 100467588C)孢子用无菌双蒸水洗脱下来，并用加样器吹打均匀，制备得到孢子悬浮液。(3)250μL链霉孢子悬液加入500μL 2×YT培养液，轻轻混匀。50℃热击10min，活化孢子。500μL重组菌E.coliET12567(pUZ8002)/pIB139-slnM菌液与500μL活化好的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654孢子悬液，轻轻混匀。4000rpm，室温离心3min，去上清，混匀沉淀涂布于MS培养基+10mM/L MgCl2,28℃倒置培养至次日早晨(18h),之后涂抗生素溶液(将0.5mg萘啶酮酸和60μg阿泊拉霉素溶于1mLddH2O中得到的液体)。2-3天后挑取单菌落到新的加入上述抗生素溶液的MS平板上。挑取在该MS平板上的菌落用上述p3(AGCTCATCGGTCAGCTTCTC)和p4(GGCATCGCATTCTTCGCATC)进行PCR扩增阿泊拉霉素抗性基因，将其中一株可以得到731bp的扩增产物的重组菌命名为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02。利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02已于2012年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6815。
利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815菌体的形态特征如下：革兰氏染色阳性；在GYM琼脂培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝；孢子丝柔曲或弯曲，孢子椭圆形。
三、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815的合成纳他霉素能力
所用的培养基如下：
高氏一号斜面培养基：K2HPO40.5g，NaCl 0.5g，KNO31.0g，FeSO4·7H2O0.01g,MgSO4·7H2O 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml；pH 7.2-7.4。
种子培养基：15g黄豆粒(加蒸馏水煮沸0.5-1h，取滤液)，5g蛋白胨，2.5g硫酸铵，20g葡萄糖，10g淀粉，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7-8后，加1g碳酸钙，加水定容至1000ml。
发酵培养基：15g黄豆粒(加蒸馏水煮沸0.5-1h，取滤液)，5g蛋白胨，2.5g硫酸铵，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7-8后，加1g碳酸钙，加水定容至1000ml。
不加蔗糖的YEME培养基：3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麦芽提取物，10g葡萄糖，加水定容至1000ml，灭菌后加2ml 2.5M MgCl2。
A、在发酵培养基中生产纳他霉素
将利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815分别接种到高氏一号斜面培养基上，28℃培养7-10天，待其产生足量的孢子，用无菌铂环刮取其孢子2－3环接种于250ml三角瓶内的50ml种子培养基内，置可控温摇床上，在28℃条件下，200rpm(旋转半径13mm)恒温振荡培养24h-30h；然后在无菌条件下将其分接于60个500ml三角瓶内的发酵培养基内(每瓶装液量为100ml)，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815的接种量相同，每瓶接种后OD600值均为0.1；接种后的摇瓶在31℃条件下，以240rpm(旋转半径13mm)的转速振荡培养0、24、48、72、96、120h，取发酵液测定纳他霉素的产量。实验重复三次。
B、在不加蔗糖的YEME培养基中生产纳他霉素
将利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815分别接种到高氏一号斜面培养基上，28℃培养7-10天，待其产生足量的孢子，用无菌铂环刮取其孢子2－3环接种于250ml三角瓶内的50ml种子培养基内，置可控温摇床上，在28℃条件下，200rpm(旋转半径13mm)恒温振荡培养24h-30h；然后在无菌条件下将其分接于70个500ml三角瓶内的不加蔗糖的YEME培养基内(每瓶装液量为100ml)，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815的接种量相同，每瓶接种后OD600值均为0.1；接种后的摇瓶在31℃条件下，以240rpm(旋转半径13mm)的转速振荡培养0、24、48、72、96、120h，取发酵液测定纳他霉素的产量。实验重复三次。
C、纳他霉素产量分析
将以上步骤获得的1mL发酵液加入9mL甲醇,充分振荡后,进行30min超声波提取,5000rpm/min离心10－15min沉降菌丝体及固形物，上清液稀释10倍后用0.45μm的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液，所得样品用于HPLC检测。色谱柱:C18柱(5μm,4.6mm×200mm)；检测波长:303nm；流速:1.00mL/min；进样量:10μL；检测柱温:30℃；实验流动相为V(甲醇)∶V(水)＝65∶35。以纳他霉素(sigma-P9703)为标准品采用外标法(标准曲线法)对纳他霉素进行定量。
实验结果表明，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815摇瓶发酵在不加蔗糖的YEME培养基上发酵72小时产量为1.148g/L培养基，在发酵培养基上发酵96小时产量为5.338g/L培养基；利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654摇瓶发酵在不加蔗糖的YEME培养基上发酵72小时产量为0.375g/L培养基，在发酵培养基上发酵96小时产量为2.546g/L培养基。说明利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCCNo.6815纳他霉素产量在不加蔗糖的YEME培养基上约是野生型菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654的3倍(图3)，在发酵培养基上约是野生型菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654的2倍(图4)。
其中，利迪链霉菌发酵液中纳他霉素的粗提和鉴定方法如下：
一)发酵液中纳他霉素的粗提
将上述利迪链霉菌的发酵液分别用3倍体积的无水乙醇预处理，4℃静置2h，以沉淀菌体、固形颗粒、可溶性粘胶状物、核酸和杂蛋白质以及中间代谢产物等，上清液用2层滤纸以布氏漏斗真空抽滤，滤液经旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩，浓缩液即为纳他霉素粗提物，4℃保存备用。
二)、纳他霉素粗提物的分离纯化
通过大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和高效液相色谱仪HPLC进行逐步分离纯化。
1、大孔树脂吸附柱层析
选用40cm×2.6cm玻璃层析柱，X-5大孔树脂(天津南开大学化工厂)。大孔树脂按厂家说明预处理后用适量去离子水调匀，缓慢加入装有1/3体积去离子水的层析柱中，同时从柱底部以匀速缓慢放出蒸馏水，使柱中液面始终保持在树脂层上面。装至约3/4柱高度，自然沉降6～10h，使平衡后的装柱体积为150ml。
取纳他霉素粗提物与树脂按1﹕1的体积比进行动态吸附。洗脱过程为：2倍柱体积的无离子水洗脱除去部分色素和大量水溶性杂质；2倍柱体积的30％(体积百分含量)甲醇洗脱去色素；最后用2倍柱体积的70％(体积百分含量)乙醇洗脱活性成分。分管收集洗脱液，每管15ml，滤纸片法进行活性测定。
结果表明活性洗脱液集中在第48～56管(即自4.8倍柱体积至5.6倍柱体积之间的洗脱液)。将活性洗脱液，45℃下减压浓缩后供下一步分离。
2、硅胶吸附柱层析
选用40cm×2.6cm玻璃层析柱，100目～200目硅胶，以体积比为8﹕1﹕1的乙醇、氨水和水的混合液为洗脱液；取约150g硅胶用去离子水浸泡3h，倾去细小颗粒，布氏漏斗真空抽滤除去水分；再用6mol/L HCl浸泡12h，然后用去离子水洗至中性，真空抽干；用无水乙醇浸泡过夜，真空抽干；临用前在120℃下活化2h，干燥至恒重；层析柱中装入1/3柱体积的洗脱液，然后缓慢加入用洗脱液混合均匀的硅胶，约至3/4柱高时停止加入，静置6～10h，使硅胶缓慢沉降。然后用2～3倍体积的洗脱液以1mL/min的流速冲洗柱体，使之平衡。平衡后的柱体积为150ml。取步骤1的大孔树脂活性洗脱浓缩液10ml上柱进行动态吸附，用2～3倍柱体积的洗脱液按0.5ml/min的流速进行洗脱，用自动部分收集器分管收集洗脱液，每管5ml。以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。结果表明：其洗脱液中的活性组分集中在第7～36管(即自0.23倍柱体积至1.2倍柱体积之间的洗脱液)。将活性洗脱液，45℃下减压浓缩后供下一步分离。
3、制备型HPLC分离纯化
采用LC-9101型循环制备HPLC，JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱。
取步骤2的硅胶柱层析后的活性洗脱浓缩液，用0.45μm微孔滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量6ml；以甲醇：水(体积比为7：3)为流动相进行分离，利用UV检测器在波长305nm处检测并自动形成分离图谱；利用馏分收集器分别收集图谱中各曲线峰所对应的洗脱液；以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。以2ml/min的泵流速进行第一次分离后，再以3ml/min的泵流速相继分离2次。
实验结果表明，第一次HPLC分离共检测到30个峰，其中保留时间为57.866min的强吸收峰为活性峰(图6A)，其相对峰面积为35.121％；对其进行的第二次分离检测到6个峰，其中保留时间为41.699min的峰为活性峰，其相对峰面积为97.020％；第三次分离检测到保留时间为39.766min的峰为活性峰(图6B)，通过峰面积计算其纯度为99.845％。
将第三次分离得到的活性峰样品进行真空浓缩，干燥后呈白色或奶油色粉末，该样品即为纳他霉素样品。利用岛津分析型HPLC采用下述方法对其进行纯度验证：取少量样品溶于70％甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为：C18反相柱，柱温30℃，UV检测器，检测波长305nm，SIL-10ADVP自动进样器进样10μl，以1ml/min的流速洗脱60min。梯度洗脱步骤如下：
结果显示洗脱曲线为单一的峰，说明其为单一组分，纯度达到化学结构测定的要求。
四、纯化样品化学结构的解析鉴定
1、紫外吸收光谱(UV)
将上述步骤三纯化的纳他霉素样品极微量溶于超纯水中，用日立UV─VIS 3010紫外可见分光光度计在190nm～400nm波长范围内以超纯水为空白对照进行全波长扫描，自动形成紫外吸收图谱。
由紫外扫描图谱可见，纳他霉素样品表现出典型的四烯类抗生素谱型，即在波长281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共轭四烯发色基团的吸收峰，其中波长305nm处吸收值最大，281nm处吸收值最小(图7)，说明该物质属于多烯类中的四烯抗生素。
2、红外吸收光谱(IR)
采用KBr压片法，用德国BRUKER公司TENSOR 27傅立叶红外光谱仪进行400cm-1-4000cm-1区域内扫描。
纳他霉素样品的红外光谱如图8所示，其中νmax 3416.78cm-1为-OH的特征吸收峰；νmax 3288.23cm-1为N-H的伸缩振动特征吸收峰；νmax 2940.44和2980.27cm-1是-CH3的特征吸收峰；νmax 3017.23cm-1是-CH2的特征吸收峰；νmax1715.38cm-1表现典型的羰基强吸收峰；νmax1571.44cm-1表现-C＝C-的强吸收峰；νmax 1634.40cm-1表现-C＝C-的弱吸收峰。
3、高分辨质谱
采用德国BRUKER公司超高分辨率9.4T混合型四级杆傅立叶串联质谱仪(9.4TQ-FT-MS)；条件：capillary 4000，Dry Gas：4.0l/s，源温：180℃，scan range：300～2000，syringe pump：1.5ml/min，数据分析软件为Bruker Daltonics DataAnalysis 3.4。
结果表明，纳他霉素样品进行分析的图谱中，采用正离子检测方式检测到加合离子[M+Na]+为m/z688.2937(图9B)；采用负离子检测方式检测到准分子离子[M-H]+为m/z664.2975的化合物(图9A)；采用正、负离子检测方式对纳他霉素样品进行检测分析，确定664.2975为分子离子峰。
综上所述，纳他霉素样品的主要活性组分的分子式均为C33H47NO13，分子量为665；由公式：不饱和度(n)＝1+Nc+(Nn-Nh)/2(Nc：碳原子数；Nn：氮原子数；Nh：氢原子数)计算其分子式的不饱和度为11，表明其分子结构中含有多个不饱和键与环等。
4、核磁共振谱(NMR)
以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)为溶剂，以四甲基硅烷(TMS)为内标，室温下测定。
采用Bruker AVANCE DRX-500核磁共振谱仪(德国Bruker光谱仪器公司)，以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标，进行氢谱(1HNMR)和碳谱(13CNMR)的测定；前者共振频率为500.1325156MHZ，采样次数32768次；后者共振频率125.7577612MHZ，采样次数为65536次。
实验结果表明，纳他霉素样品的核磁共振13C图谱(图10A)中可以看出，分子中有一个羧基碳原子的化学位移(δ165.217)；一个羰基碳原子的化学位移(δ178.603)；一组共轭四烯碳原子的化学位移(δ125.089～145.447)；一组与羟基相连的碳原子的化学位移(δ66.102～70.326)；糖环上五个碳原子共振峰(δ71.194～97.894)；甲基碳原子共振峰(δ18.062，δ20.360)。500兆赫的核磁共振1H图谱(图10B)中可以看出，多烯环上和四个双键相连的质子氢(-CH＝CH-)的化学位移(δ5.686～6.625ppm)；五个羟基中的质子氢的化学位移值(δ4.187～4.741ppm)；五个亚甲基和两个甲基中的质子氢的化学位移(δ1.274～2.439ppm)。
综合分析上述实验数据，纳他霉素样品的主要活性组分为纳他霉素，其化学结构式为：
实施例2、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815的抑菌活性高于利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654
该实施例中，所用的培养基如下：
高氏一号斜面培养基：K2HPO40.5g，NaCl 0.5g，KNO31.0g，FeSO4·7H2O0.01g,MgSO4·7H2O 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml；pH 7.2-7.4。
种子培养基：15g黄豆粒(加蒸馏水煮沸0.5-1h，取滤液)，5g蛋白胨，2.5g硫酸铵，20g葡萄糖，10g淀粉，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7-8后，加1g碳酸钙，加水定容至1000ml。
发酵培养基：15g黄豆粒(加蒸馏水煮沸0.5-1h，取滤液)，5g蛋白胨，2.5g硫酸铵，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7-8后，加1g碳酸钙，加水定容至1000ml。
1、植物真菌病害抑制剂的制备
将利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815分别接种到高氏一号斜面培养基上，28℃培养7-10天，待其产生足量的孢子，用无菌铂环刮取其孢子2－3环接种于250ml三角瓶内的50ml种子培养基内，置可控温摇床上，在28℃条件下，200rpm/min(旋转半径13mm)恒温振荡培养24h-30h；然后在无菌条件下将其分接于10个500ml三角瓶内的发酵培养基内(每瓶装液量为100ml)，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815的接种量相同，每瓶接种后OD600值均为0.1；接种后的摇瓶在31℃条件下，以240rpm/min(旋转半径13mm)的转速振荡培养96h；此时菌株已在发酵液中产生高浓度的抑菌活性代谢产物。
将1mL发酵液加入9mL甲醇，充分振荡后，进行30min超声波提取，5000rpm/min离心10－15min沉降菌丝体及固形物，上清液用甲醇稀释10倍后用0.45μm的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液，该滤液即为利迪链霉菌代谢物的甲醇溶液。分别取利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02CGMCC No.1654代谢物甲醇溶液和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815代谢物甲醇溶液，进行下述步骤2的抑菌活性试验。
2、抑菌活性试验
供试靶标病原菌为甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)。
刮取PDA平板上培养产生的甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)的分生孢子，用无菌水制成菌悬液，均匀地涂于新制备的PDA平板上，置超净工作台内吹干；用直径7mm的无菌打孔器在平板四周对称位置打孔，然后每孔中注入利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654代谢物甲醇溶液200μl或利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815代谢物甲醇溶液200μl，以200ul甲醇为对照；28℃下培养3天，十字交叉法测量抑菌圈直径。每处理三个重复。
实验结果表明利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654代谢物甲醇溶液和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815代谢物甲醇溶液在PDA平板上可对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)均产生明显的抑菌圈，甲醇在PDA平板上对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)均不能产生抑菌圈。利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815代谢物甲醇溶液对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)抑菌圈直径分别为36±1.1mm、47±1.4mm，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654代谢物甲醇溶液对甘蓝枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)抑菌圈直径分别为20±1.2mm、21±1.1mm(图5)。说明利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCCNo.6815代谢物甲醇溶液对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)的抑菌活性是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654的1.8倍，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AM02CGMCC No.6815代谢物甲醇溶液对西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)的抑菌活性是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCCNo.1654的2.2倍。

Claims (10)

1.由构建重组利迪链霉菌的方法得到的重组利迪链霉菌，其特征在于：所述构建重组利迪链霉菌的方法包括将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)中筛选得到纳他霉素产量高于所述宿主菌的重组利迪链霉菌的步骤；
所述纳他霉素合成正调控基因编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；
所述作为宿主菌的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)为利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02CGMCC No.1654。
2.根据权利要求1所述的重组利迪链霉菌，其特征在于：所述纳他霉素合成正调控基因的编码序列为SEQ ID No.2的第433-1011位。
3.根据权利要求1或2所述的重组利迪链霉菌，其特征在于：所述纳他霉素合成正调控基因的序列为SEQ ID No.2的第14-1011位。
4.根据权利要求1或2所述的重组利迪链霉菌，其特征在于：所述将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)包括如下步骤：将所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)进行双亲接合获得所述重组利迪链霉菌；所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体中，启动所述纳他霉素合成正调控基因的启动子是红霉素抗性基因启动子。
5.根据权利要求4所述的重组利迪链霉菌，其特征在于：所述重组利迪链霉菌的菌株号为AM02，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.6815。
6.权利要求1-5中任一所述的重组利迪链霉菌在生产纳他霉素中的应用。
7.权利要求1-5中任一所述的重组利迪链霉菌在制备植物病原真菌抑制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物病原真菌为下述至少一种：甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)。
9.权利要求1-5中任一所述的重组利迪链霉菌在抑制植物真菌病害中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物真菌病害为下述至少一种：由甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)引起的病害。
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