CN103045516B

CN103045516B - 一株产纳他霉素的新菌株及其应用

Info

Publication number: CN103045516B
Application number: CN201210581720.2A
Authority: CN
Inventors: 刘伟成; 刘建华; 卢彩鸽; 吴慧玲; 董丹; 张涛涛; 刘霆; 张殿朋; 刘德文; 田兆丰; 裘季燕; 亓芳
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2032-12-27
Also published as: CN103045516A

Abstract

本发明公开了一株产纳他霉素的新菌株及其应用。本发明所提供的产纳他霉素的新菌株为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5562。本发明所提供的利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562，平均产纳他霉素量达到2.43g/L，较出发菌株利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653与利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654分别提高了38.86%和55.77%；并且其发酵周期缩短了40%，计算综合发酵产率较亲本菌株A01提高了132.99%，较亲本菌株A02提高了161.54%；另外，该菌株的培养特性也发生了改变，斜面上观察菌株不产生黄色色素，这有利于下一步的纳他霉素分离纯化工艺。

Description

一株产纳他霉素的新菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一株产纳他霉素的新菌株及其应用。

背景技术

纳他霉素是一种四烯大环内酯类抗生素，为高效、安全的抗真菌天然产物，由于其对哺乳动物细胞的毒性极低，而对真菌的抑制作用极强，抗菌谱极广，并且能够阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成，加之其溶解度低，可用其对食品表面进行处理以增加食品的保质期，却不影响食品的风味和口感，因而是一种十分理想的高效、安全的天然食品防腐剂，多年来在30多个国家被广泛用于乳制品、肉类、水果、饮料等许多食品工业中，是国际上被美国FDA正式批准的仅有的两种生物防腐剂之一。我国1996年食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，1997年3月我国卫生部正式批准其作为食品防腐剂，成为我国已批准使用的3种生物防腐剂之一。纳他霉素通过链霉菌发酵生产，菌株的生产能力是关系到其发酵水平和生产成本的关键因素，因此高产菌种的选育是纳他霉素研究的热点之一。前人报道的纳他霉素产生菌有恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanovgensis）、纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）和褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）；近年北京市农林科学院植保环保所研究发现了纳他霉素新的产生菌利迪链霉菌（S.lydicus）菌株A01（中国专利，申请号为200710187435.1，授权公告号为CN100590194C）和A02（中国专利，申请号为200610065620.9，授权公告号为CN100467588C），其以纳他霉素为主要有效成分的活性产物对包括多种植物病原真菌在内的供试真菌均有强烈的抑制作用。但因其为野生型菌株，在生产能力和工艺性状等方面尚不能满足工业化生产的要求，因此需要通过菌种选育获得性状优良的高产新菌株。

目前纳他霉素生产菌菌种选育的手段有：诱变育种、原生质体育种和基因组重排育种（genome shuffling）和基因工程育种，这些育种手段各有千秋。诱变育种是实验室常规育种手段，其操作简单、成本低，不需要了解菌株的遗传背景。但诱变育种正突变率低，筛选工作量大，故构建一种快速有效的筛选模式是试验成功的关键。鉴于目前对纳他霉素的遗传背景和生物合成途径尚未完全清楚，基因组重排技术在纳他霉素生产菌的遗传改造中将占据重要地位。

发明内容

本发明的目的是提供一株产纳他霉素的新菌株及其应用。

本发明所提供的产纳他霉素的新菌株具体为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117。该菌株是以利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653与利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654为出发菌株，对其进行诱变、基因组重排（Genome shuffling）后所得新菌株。该菌株已于2011年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC No.5562。

所述利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562在制备纳他霉素中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的再一个目的是提供一种制备纳他霉素的方法。

本发明所提供的制备纳他霉素的方法，具体可包括如下步骤：发酵培养所述利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562，收集发酵产物，获得纳他霉素。

在上述方法中，所述发酵培养的培养基（发酵培养基）的溶剂为水，溶质及其终浓度如下：玉米淀粉(35.0-40.0)g/L，棉籽精粉(20.0-25.0)g/L，葡萄糖(10.0-15)g/L，豆粕粉(25.0-28.0)g/L，蛋白胨(5.0-8.0)g/L，MgSO₄·7H₂O(1.0-1.2)g/L，KH₂PO₄(0.2-0.3)g/L，NaCl(4.0-6.0)g/L，(NH₄)₂SO₄(5.0-6.0)g/L和CaCO₃(5.0-8.0)g/L，pH7.0~7.4。

在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其终浓度具体如下：玉米淀粉40.0g/L，棉籽精粉25.0g/L，葡萄糖10.0g/L，豆粕粉25.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，KH₂PO₄0.2g/L，NaCl5.0g/L，(NH₄)₂SO₄5.0g/L，CaCO₃7.0g/L，pH7.0~7.4。

在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基中的玉米淀粉为石家庄市天马淀粉厂产品；所述棉籽精粉为北京中棉紫光生物科技有限公司产品；所述葡萄糖为河北省昌黎县淀粉有限公司产品；所述豆粕粉为北京中棉紫光生物科技有限公司产品。

在上述方法中，在发酵培养前，还包括利用种子培养基培养所述利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562获得种子液的步骤，再将所述种子液接种到上述发酵培养基中进行发酵培养。

所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其终浓度如下：可溶性淀粉(10.0-15.0)g/L，葡萄糖(15.0-30.0)g/L，豆粕粉(15.0-30.0)g/L，蛋白胨(5.0-8.0)g/L，MgSO₄·7H₂O(0.8-1.2)g/L，KH₂PO₄(0.2-0.3g/L，NaCl(4.0-5.0)g/L，CaCO₃(8.0-10.0)g/L；pH7.0~7.4。

在本发明的一个实施例中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其终浓度具体如下：可溶性淀粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，豆粕粉20.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，KH₂PO₄0.2g/L，NaCl4.0g/L，CaCO₃10.0g/L；pH7.0~7.4。

在上述方法中，所述发酵培养的时间具体可为60h-120h。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的时间具体为72h。

在上述方法中，所述发酵培养的培养温度具体可为28℃-30℃。在本发明的一个实施例中，所述培养温度具体为30℃。

在上述方法中，所述发酵培养可为摇瓶发酵培养；所述摇瓶发酵培养的培养方式为旋转震荡培养；所述旋转震荡培养的转速为220r/min~260r/min（如220r/min），摇床振幅为26mm。

在上述方法中，所述发酵培养也可为发酵罐发酵培养；所述发酵罐（如5L发酵罐）发酵培养过程中使发酵培养液中的溶氧量为20-30%。

在本发明的一个实施例中，通过控制所述发酵罐发酵培养过程中的通气量为6NL/min（NL/min是发酵过程中通气量的通用单位，读作标准升每分钟，意思是20摄氏度，1大气压的标准状况下的流量是每分钟多少升，转换为每分钟内通过单位体积培养液的空气体积为1.85V／V·min），搅拌转速为260~460r/min，使发酵培养基中的溶氧量达到20%-30%。

在上述方法中，当用发酵罐培养时，在所述发酵培养过程中还需向发酵培养液中补加葡萄糖；所述补加葡萄糖的时间为发酵开始后的12h~60h之间，所述补加葡萄糖为流加50%（50g/100mL）葡萄糖水溶液，使所述发酵培养液中还原糖的终浓度维持在1.0g/100ml。

所述利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562在如下a）或b）中的应用也属于本发明的保护范围：

a）制备纳他霉素敏感菌抑制剂；

b）抑制纳他霉素敏感菌。

本发明所提供的利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562，摇瓶发酵平均产纳他霉素的量达到2.43g/L，较两个亲本菌株利迪链霉菌（Streptomyceslydicus）A01CGMCC No.1653与利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654分别提高了38.86%和55.77%；并且其发酵周期缩短了40%，平均发酵产率（产物浓度/发酵时间）较亲本菌株A01提高了132.99%，较A02提高了161.54%。另外，该菌株表型也发生了改变，高氏一号斜面培养基上不产生黄色色素，这有利于下一步的纳他霉素分离纯化工艺。

保藏说明

菌种名称：利迪链霉菌

拉丁名：（Streptomyces lydicus）

菌株编号：JZB130117

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2011年12月9日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5562

附图说明

图1为纳他霉素标准曲线。

图2为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562与两个亲本菌株利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653与利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654在高氏一号斜面培养基上的培养性状。其中，A为斜面培养基的正面；B为斜面培养基的背面。

图3为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562菌株与其它5株纳他霉素产生菌的RAPD分析结果。其中，A为随机引物P64941所对应的结果；B为随机引物P64944所对应的结果。A和B中，泳道1均为恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）NRRL B-2255；泳道2均为纳塔尔链霉菌（Streptomycesnatalensis）NRRL B-5314；泳道3均为褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）NRRLB-5623；泳道4均为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01；泳道5均为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02；泳道6均为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562。

图4为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）活性产物的HPLC第一次分离谱图。

图5为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）活性产物的HPLC第三次分离谱图。

图6为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）的纳他霉素样品的紫外扫描图谱。

图7为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）的纳他霉素样品的红外吸收光谱。

图8为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）的纳他霉素样品的高分辨质谱图（负离子）。

图9为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）的纳他霉素样品的高分辨质谱图（正离子）。

图10为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）的纳他霉素样品的核磁共振碳谱（500MHz）。

图11为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）的纳他霉素样品的核磁共振氢谱（500MHz）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653：参见中国专利，申请号为200710187435.1，授权公告号为CN100590194C。

利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654：参见中国专利，申请号为200610065620.9，授权公告号为CN100467588C。

恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）NRRL B-2255：美国农业部菌种保藏中心Agricultural Research Service(NRRL)Culture Collection，United StatesDepartment of Agriculture NRRL B-2255；中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCCNo.4.1415。

纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）NRRL B-5314：美国农业部菌种保藏中心Agricultural Research Service(NRRL)Culture Collection，United States Department ofAgriculture NRRL B-5314。

褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）NRRLB-5623：美国农业部菌种保藏中心Agricultural Research Service(NRRL)Culture Collection，United States Department ofAgriculture NRRL B-5623。

下述实施例中，所涉及的纳他霉素检测方法均为紫外分光光度测定法。依据纳他霉素在303nm处（纳他霉素的最大吸收波长为303nm，且该波长附近吸收值稳定范围较宽，即使有小的漂移也不会引起大的检测误差）的光密度（OD值），以质量浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9g/L的纳他霉素标准品（sigma-P9703）溶液做标准曲线（图1），得到回归方程y=0.1028x-0.0009，R²=0.9988，说明在1g/L~9g/L范围内线性关系良好。测得待测发酵上清液在303nm处的OD值，代入上述标准曲线方程，计算得到纳他霉素含量。

实施例1、JZB130117菌株的获得及鉴定

一、JZB130117菌株的获得

1、出发菌株的诱变

以利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653和利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654（以下简称A01和A02）作为出发菌株，进行紫外线和LiCl₂复合诱变。紫外线指波长范围在135~390nm区域内所产生的射线，而诱变育种最有效的波长为260nm，它是一种非电离辐射。本发明所用紫外灯为实验室超净工作台中的15w低功率紫外灯，约为253.7nm，是比较有效的作用光谱，距离控制在30cm处。LiCl₂为增变剂，本身并无诱变作用，但是在抗生素产生菌的诱变育种中表明其与一些诱变因子具有协同作用。本发明LiCl₂的使用浓度为0.5%（0.5g/100ml）。

将LiCl₂、硫酸链霉素和培养基一起加入培养皿中制成平板，使所述LiCl₂的终浓度为0.5%（0.5g/100ml），硫酸链霉素的终浓度为出发菌株的最小抑制浓度。将制备好的出发菌株的孢子悬浮液直接均匀涂布在上述所制平板中，放到距紫外灯30cm下进行诱变，处理时间为通过预实验所测得的出发菌株最佳照射时间。处理后，用报纸包好，避免见光。然后放置在28℃的条件下培养7~8天，挑取长出的菌落（链霉素抗性突变株），转接到斜面培养。

其中，硫酸链霉素对出发菌株A01和A02的最小抑制浓度分别为4.5μg/ml和1.25μg/ml。出发菌株A01和A02的最佳照射时间分别为240s和120~150s，在相应的照射时间下，两个出发菌株均具有80%的致死率。

经摇瓶发酵试验并检测发酵液中纳他霉素含量，结果显示，对于A01菌株，共分离得到5株纳他霉素产量高于出发菌株A01，且5代内遗传稳定的突变株（表1）。对于A02菌株，共分离得到7株纳他霉素产量高于出发菌株A02，且5代内遗传稳定的突变株（表2）。

表1A01（1.75g/L）为出发菌株诱变获得突变株的产量

表2A02（1.56g/L）为出发菌株诱变获得突变株的产量

从表1和表2中可以看出，A02菌株经紫外线和LiCl₂诱变后筛选链霉素抗性菌株，其中菌株C16产量达到了2.03g/L，为出发菌株A02产量的130%。由A01诱变得来的菌株E54产量达到2.19g/L，为出发菌株A01的125%。对12株高产菌株进行复筛，最终获得4株纳他霉素产量较高的突变菌株，即C16、C23、E9和E54。

2、突变菌株原生质体的制备及融合

（1）突变菌株原生质体的制备

将突变菌株C16、C23、E9和E54的新鲜斜面适量接入种子液培养基，摇床培养24h，然后移入含预处理剂（0.4%甘氨酸）的种子液培养基中，接种量为10%，培养24h，约为对数生长期，取样离心，转速为3000r/min，离心10min。弃上清液，保留菌丝体。再用高渗缓冲液洗涤、离心。将经过培养取得的菌丝体加入5ml的0.2%溶菌酶溶液，30℃恒温水浴90min。每隔15min，用5ml移液枪吹吸使之加快原生质体的释放，取样镜检，观察原生质体形成和释放情况。待约75min时再加入5m1高渗缓冲液，再次吹吸，使原生质体大量释放，采用梯度离心法，500/3000r/min，弃去上清液，再过一次自制滤器，沉淀原生质体用高渗缓冲液悬浮，血球计数板计数，备用。

（2）突变菌株原生质体的融合

将步骤（1）获得的4株突变菌株的原生质体进行混合，在距紫外灯30cm处照射90s，或50℃水浴30min，使其灭活。在成串频率2.0MHz左右，成串电压值30V，融合脉冲电压550V，脉冲幅宽80μs，脉冲个数3个，槽间距1mm的条件下，让4株突变菌株的原生质体随机地发生融合，并在再生培养基（高氏高渗培养基）中进行再生培养，28℃，培养7~8d。然后收集再生菌株作为亲本，再次酶解去细胞壁，制备原生质体，重新进行原生质体融合，再生。经过2轮递推式多亲本原生质体融合，筛选得到了一株重组菌，将其命名为JZB130117。

二、JZB130117菌株的鉴定

从以下几个方面鉴定步骤一得到的菌株JZB130117：

1、形态学特征鉴定

革兰氏染色阳性；在高氏合成1号琼脂培养基和GYM琼脂培养基上28℃培养7d后在光学显微镜下镜检，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝；孢子丝长，顶端卷曲，孢子卵圆至椭圆形。

2、培养性状测定

在6种固体培养基上28℃培养7d后观察，培养性状如表3所示。

表3菌株JZB130117的培养性状

3、生理生化特性分析

按链霉菌生理生化特性分析的常规方法进行实验，结果如表4。

表4菌株JZB130117的生理生化特性

注：“＋”表示阳性结果；“W”表示弱阳性结果；“－”表示阴性结果。

3、16s rDNA序列同源性分析

上述步骤一得到的菌株JZB130117在高氏合成1号琼脂平板上培养2~3d，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，采用细菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，55.5℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后进行DNA测序，序列拼接及相似性分析，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）在线完成。

菌株JZB130117的16s rDNA的序列详见序列表中序列1。在线BLAST比对的结果表明，该序列与利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）的模式菌株CGMCC4.1412及2个亲本菌株A01和A02的16s rRNA基因序列相似性均为99%。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一得到的菌株JZB130117鉴定为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）。该菌株已于2011年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.5562。

实施例2、利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562在制备纳他霉素中应用

本实施例以亲本利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653和利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654为对照，检测了利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562的遗传特性；并且阐述了利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562在制备纳他霉素中的可观的应用前景。

1、培养性状的检测

高氏一号培养基：可溶性淀粉（上海源聚生物科技有限公司，产品编号C1960，C.A.S.9050-36-6）2%，NaCl0.05%，KNO₃0.1%，FeSO₄.7H₂O0.001%，K₂HPO₄0.05%，MgSO₄0.05%，琼脂2%，蒸馏水1000ml，pH7.2~7.4，121℃灭菌15min。其中，%均表示g/100ml（质量容积比）。

将利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562与亲本利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653和利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654分别接种在斜面培养基（高氏一号培养基）上，置于28℃的培养箱中，培养7~10d。培养后如图2所示，从图中可以看出，与两个亲本相比，利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562的培养性状发生了改变，在高氏一号斜面培养基上不产生黄色色素，这有利于其发酵液中纳他霉素的分离纯化。

2、基因组多态性的检测

从20个随机多态核苷酸序列引物（Lot No:P64928~P64947，购自上海生工生物工程技术服务有限公司）中筛选出多态性明显的2个引物P64941和P64944，以这2个引物分别对利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562与亲本菌株利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653和利迪链霉菌（Streptomyceslydicus）A02CGMCC No.1654进行RAPD分析。实验同时设置了前人报道的3株纳他霉素产生菌的典型菌株恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）NRRLB-2255，纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）NRRL B-5314和褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）NRRL B-5623作为对照：

引物P64941（5'-3'）：ACACGGTCGC；

引物P64944（5'-3'）：CAGGAACTCG。

结果如图3所示，引物P64941的扩增图谱中（图3中A），菌株JZB130117在约1200bp、700bp和600bp处各有一特异性条带，其中第一条带其它5个菌株均不具备，第二和第三条带仅菌株A02在约650bp处有一相近条带；引物P64944的扩增图谱中（图3中B），菌株JZB130117仅在约550bp和350bp处各有一主带，这与菌株A02相近，但菌株A02和NRRL B-5314在约1300bp处，菌株A02和NRRL B-5623在约1100bp处，菌株NRRL B-2255、NRRL B-5314、NRRL B-5623和A01在约600bp处及菌株NRRL B-2255在约1500bp处的4条主带在菌株JZB130117中均已消失或变得极弱。由此可见，菌株JZB130117的基因组多态性与其亲本菌株和其它3个前人报道的纳他霉素产生菌株均明显不同。

3、纳他霉素产量及其稳定性检测

种子培养基具体由如下终浓度的各物质组成：可溶性淀粉（上海源聚生物科技有限公司，产品编号C1960，C.A.S.9050-36-6）10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，豆粕粉20.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，KH₂PO₄0.2g/L，NaCl4.0g/L，CaCO₃10.0g/L；pH7.0~7.4。所述浓度均为各物质在培养基中的终浓度，溶剂为水。

发酵培养基具体由如下终浓度的各物质组成：玉米淀粉（石家庄市天马淀粉厂）40.0g/L，棉籽精粉（北京中棉紫光生物科技有限公司）25.0g/L，葡萄糖（河北省昌黎县淀粉有限公司）10.0g/L，豆粕粉（北京中棉紫光生物科技有限公司）25.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，KH₂PO₄0.2g/L，NaCl5.0g/L，(NH₄)₂SO₄5.0g/L，CaCO₃7.0g/L，pH7.0~7.4。所述浓度均为各物质在培养基中的终浓度，溶剂为水。

将利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562接种在斜面培养基（高氏一号培养基）上连续转接4代，每一代斜面均进行摇瓶二级发酵，即首先在种子培养基中培养获得种子液，再将所述种子液接种到发酵培养基中进一步培养。具体如下：（1）用无菌铂环刮取高氏一号斜面培养基上的新鲜孢子2－3环接种于含有15ml种子培养基的500ml三角瓶内，在28℃条件下，以26mm振幅、180r/min的转速恒温振荡培养24h，获得种子液。（2）将上述种子培养液按体积含量8%的接种量接入含有80ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在30℃条件下，以26mm振幅、220r/min的转速恒温振荡，培养120h。发酵过程中每12h取样测定发酵液中纳他霉素的含量，以纳他霉素产量达最高峰附近、菌体出现自溶前兆（菌体浓度开始下降，镜检菌丝碎片增多）、还原糖浓度下降至0.3%（0.3g/100mL）左右时为发酵终点，以此确定发酵周期，并计算平均发酵产率（产物浓度/产量达峰值时的发酵时间）。第一代检测时，同时设置两个亲本菌株利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653和利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654作为对照。各代检测，以及每代检测中各菌株的在发酵培养基中接种量一致。实验重复三次，结果取平均值。

对于产纳他霉素峰值时间（发酵液中纳他霉素含量最高的时间点）的确定结果显示，利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562产纳他霉素峰值时间由亲本菌株A01和A02的120h提前到了72h，发酵周期缩短了40%。各菌株在其产纳他霉素峰值时间点时（JZB130117为72h，菌株A01和菌株A02为120h），相应发酵液中纳他霉素含量测定结果如表5所示，利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562生产纳他霉素的产量（四代平均产量为2.43g/L）显著高于作为对照的两个亲本菌株A01和A02，较亲本菌株A01和A02在同等条件下的产量1.75g/L和1.56g/L分别提高了38.86%和55.77%。计算利迪链霉菌（Streptomyceslydicus）JZB130117CGMCC No.5562的平均发酵产率（产物浓度/产量达峰值时的发酵时间）达0.034g/(L·h)，较亲本菌株A01提高了132.99%，较亲本菌株A02提高了161.54%。另外，四代利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562生产纳他霉素的平均产量稳定在2.39~2.47g/L之间，利用SPSS13.0进行差异显著性检验，结果显示各代的产量在α＝0.05水平上无显著性差异，表明重排菌株利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562高产纳他霉素的特性能稳定遗传。

表5不同代次利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562生产纳他霉素的产量比较（单位：g/L）

注：不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著。

4、利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562产生纳他霉素的小试发酵工艺

（1）种子培养

种子培养：用高氏一号斜面培养的利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562新鲜孢子适量接入种子培养基中，种子培养基装液量为15ml/500ml三角瓶，摇床转速220r/min，培养温度30℃，培养时间24h，得到种子液，准备用于发酵罐发酵培养。

（2）发酵培养

发酵培养基：玉米淀粉（石家庄市天马淀粉厂）40.0g/L，棉籽精粉（北京中棉紫光生物科技有限公司）25.0g/L，葡萄糖（河北省昌黎县淀粉有限公司）10.0g/L，豆粕粉（北京中棉紫光生物科技有限公司）25.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，KH₂PO₄0.2g/L，NaCl5.0g/L，(NH₄)₂SO₄5.0g/L，CaCO₃7.0g/L，pH7.0~7.4。所述浓度均为各物质在培养基中的终浓度，溶剂为水。

发酵培养：将步骤1所得的种子液接入发酵培养基，发酵罐（5L）装料系数（料液体积占罐总体积的比例即称为填充系数，也称装料系数）65%，接种量（V／V）10%。培养温度为30℃，通气量为6NL/min（转换为每分钟内通过单位体积培养液的空气体积为1.85（V／V·min）），搅拌转速为260~460r/min，使发酵培养基中的溶氧量达到20%-30%。在发酵培养过程中随着葡萄糖的不断消耗，需要及时补充50%（50g/100ml）的葡萄糖溶液，使发酵培养液中还原糖的终浓度维持在1.0%（1.0g/100ml）左右，补入时间：发酵12h~60h，补入方式为流加。发酵过程中每12h取样测定发酵液中菌体浓度、还原糖和纳他霉素的含量，以纳他霉素产量达最高峰附近、菌体出现自溶前兆（菌体浓度开始下降，镜检菌丝碎片增多）、还原糖浓度下降至0.3%（0.3g/100ml）左右时为发酵终点，以此确定发酵周期。实验重复三次，结果取平均值。

发酵培养72h时，测得发酵液中纳他霉素含量平均达3.12g/L（表6），较摇瓶发酵提高了28.40%。

表65L发酵罐发酵利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562生产纳他霉素产量的三次重复结果（单位：g/L）

重复1	重复2	重复3	平均值
				3.16	3.18	3.02	3.12

综合本实施例的结果，本发明以利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01CGMCC No.1653和利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654作为亲本菌株，经典诱变获得的4株正突变菌株（C16、C23、E9、E54），对其进行2轮递推式多亲本原生质体融合、再生，经过摇瓶发酵筛选，得到稳定、高产的重组体利迪链霉菌（Streptomyceslydicus）JZB130117CGMCC No.5562。其连续传4代纳他霉素产量稳定，摇瓶发酵平均产量达到2.43g/L，较亲本菌株A01和A02分别提高了38.86%和55.77%；并且其发酵周期缩短了40%，平均发酵产率较亲本菌株A01提高了132.99%，较A02提高了161.54%。利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117CGMCC No.5562菌株培养特性也发生了改变，高氏一号斜面上观察菌株不产生黄色色素，这有利于下一步的纳他霉素分离纯化工艺。

本实施例中，利迪链霉菌发酵液中纳他霉素的提取和鉴定方法如下：

一）发酵液中纳他霉素的粗提

将上述利迪链霉菌的发酵液分别用3倍体积的无水乙醇预处理，4℃静置2h，以沉淀菌体、固形颗粒、可溶性粘胶状物、核酸和杂蛋白质以及中间代谢产物等，上清液用2层滤纸以布氏漏斗真空抽滤，滤液经旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩，浓缩液即为纳他霉素粗提物，4℃保存备用。

二）纳他霉素粗提物的分离纯化

通过大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和高效液相色谱仪HPLC进行逐步分离纯化。

1、大孔树脂吸附柱层析

选用40cm×2.6cm玻璃层析柱，X-5大孔树脂（天津南开大学化工厂）。大孔树脂按厂家说明预处理后用适量去离子水调匀，缓慢加入装有1/3体积去离子水的层析柱中，同时从柱底部以匀速缓慢放出蒸馏水，使柱中液面始终保持在树脂层上面。装至约3/4柱高度，自然沉降6～10h，使平衡后的装柱体积为150ml。

取纳他霉素粗提物与树脂按1﹕1的体积比进行动态吸附。洗脱过程为：2倍柱体积的无离子水洗脱除去部分色素和大量水溶性杂质；2倍柱体积的30%（体积百分含量）甲醇洗脱去色素；最后用2倍柱体积的70%（体积百分含量）乙醇洗脱活性成分。分管收集洗脱液，每管15ml，滤纸片法进行活性测定。

结果表明活性洗脱液集中在第48～56管（即自4.8倍柱体积至5.6倍柱体积之间的洗脱液）。将活性洗脱液，45℃下减压浓缩后供下一步分离。

2、硅胶吸附柱层析

选用40cm×2.6cm玻璃层析柱，100目～200目硅胶，以体积比为8﹕1﹕1的乙醇、氨水和水的混合液为洗脱液；取约150g硅胶用去离子水浸泡3h，倾去细小颗粒，布氏漏斗真空抽滤除去水分；再用6mol/L HCl浸泡12h，然后用去离子水洗至中性，真空抽干；用无水乙醇浸泡过夜，真空抽干；临用前在120°C下活化2h，干燥至恒重；层析柱中装入1/3柱体积的洗脱液，然后缓慢加入用洗脱液混合均匀的硅胶，约至3/4柱高时停止加入，静置6～10h，使硅胶缓慢沉降。然后用2～3倍体积的洗脱液以1mL/min的流速冲洗柱体，使之平衡。平衡后的柱体积为150ml。取步骤1的大孔树脂活性洗脱浓缩液10ml上柱进行动态吸附，用2～3倍柱体积的洗脱液按0.5ml/min的流速进行洗脱，用自动部分收集器分管收集洗脱液，每管5ml。以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。结果表明：其洗脱液中的活性组分集中在第7～36管（即自0.23倍柱体积至1.2倍柱体积之间的洗脱液）。将活性洗脱液，45℃下减压浓缩后供下一步分离。

3、制备型HPLC分离纯化

采用LC-9101型循环制备HPLC，JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱。

取步骤2的硅胶柱层析后的活性洗脱浓缩液，用0.45μｍ微孔滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量6ml；以甲醇：水（体积比为7：3）为流动相进行分离，利用UV检测器在波长305nm处检测并自动形成分离图谱；利用馏分收集器分别收集图谱中各曲线峰所对应的洗脱液；以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。以2ml/min的泵流速进行第一次分离后，再以3ml/min的泵流速相继分离2次。

实验结果表明，第一次HPLC分离共检测到30个峰，其中保留时间为57.866min的强吸收峰为活性峰（图4），其相对峰面积为35.121%；对其进行的第二次分离检测到6个峰，其中保留时间为41.699min的峰为活性峰，其相对峰面积为97.020%；第三次分离检测到保留时间为39.766min的峰为活性峰（图5），通过峰面积计算其纯度为99.845%。

将第三次分离得到的活性峰样品进行真空浓缩，干燥后呈白色或奶油色粉末，该样品即为纳他霉素样品。利用岛津分析型HPLC采用下述方法对其进行纯度验证：取少量样品溶于70%甲醇水溶液，以甲醇（A）和水（B）为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为：C₁₈反相柱，柱温30℃，UV检测器，检测波长305nm，SIL-10ADVP自动进样器进样10μl，以1ml/min的流速洗脱60min。梯度洗脱步骤如下：

结果显示洗脱曲线为单一的峰，说明其为单一组分，纯度达到化学结构测定的要求。

三）纯化样品化学结构的解析鉴定

1、紫外吸收光谱（UV）

将上述步骤三纯化的纳他霉素样品极微量溶于超纯水中，用日立UV─VIS3010紫外可见分光光度计在190nm～400nm波长范围内以超纯水为空白对照进行全波长扫描，自动形成紫外吸收图谱。

由紫外扫描图谱可见，纳他霉素样品表现出典型的四烯类抗生素谱型，即在波长281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共轭四烯发色基团的吸收峰，其中波长305nm处吸收值最大，281nm处吸收值最小（图6），说明该物质属于多烯类中的四烯抗生素。

2、红外吸收光谱（IR）

采用KBr压片法，用德国BRUKER公司TENSOR27傅立叶红外光谱仪进行400cm^-1-4000cm^-1区域内扫描。

纳他霉素样品的红外光谱如图7所示，其中ν_max3416.78cm^-1为-OH的特征吸收峰；ν_max3288.23cm^-1为N-H的伸缩振动特征吸收峰；ν_max2940.44和2980.27cm^-1是-CH₃的特征吸收峰；ν_max3017.23cm^-1是-CH₂的特征吸收峰；ν_max1715.38cm^-1表现典型的羰基强吸收峰；ν_max1571.44cm^-1表现-C=C-的强吸收峰；ν_max1634.40cm^-1表现-C=C-的弱吸收峰。

3、高分辨质谱

采用德国BRUKER公司超高分辨率9.4T混合型四级杆傅立叶串联质谱仪（9.4TQ-FT-MS）；条件：capillary4000，Dry Gas：4.0l/s，源温：180°C，scan range：300～2000，syringe pump：1.5ml/min，数据分析软件为Bruker Daltonics DataAnalysis3.4。

结果表明，纳他霉素样品进行分析的图谱中，采用正离子检测方式检测到加合离子[M+Na]⁺为m/z688.2937（图8）；采用负离子检测方式检测到准分子离子[M-H]⁺为m/z664.2975的化合物（图9）；采用正、负离子检测方式对纳他霉素样品进行检测分析，确定664.2975为分子离子峰。

综上所述，纳他霉素样品的主要活性组分的分子式均为C₃₃H₄₇NO₁₃，分子量为665；由公式：不饱和度（n）=1+Nc+（Nn-Nh）/2（Nc：碳原子数；Nn：氮原子数；Nh：氢原子数）计算其分子式的不饱和度为11，表明其分子结构中含有多个不饱和键与环等。

4、核磁共振谱（NMR）

以氘代-二甲基甲酰胺（d-DMF）为溶剂，以四甲基硅烷（TMS）为内标，室温下测定。

采用Bruker AVANCE DRX-500核磁共振谱仪（德国Bruker光谱仪器公司），以氘代-二甲基甲酰胺（d-DMF）为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标，进行氢谱（¹HNMR）和碳谱（¹³CNMR）的测定；前者共振频率为500.1325156MH_Z，采样次数32768次；后者共振频率125.7577612MH_Z，采样次数为65536次。

实验结果表明，纳他霉素样品的核磁共振¹³C图谱（图10）中可以看出，分子中有一个羧基碳原子的化学位移（δ165.217）；一个羰基碳原子的化学位移（δ178.603）；一组共轭四烯碳原子的化学位移（δ125.089～145.447）；一组与羟基相连的碳原子的化学位移（δ66.102～70.326）；糖环上五个碳原子共振峰（δ71.194～97.894）；甲基碳原子共振峰（δ18.062，δ20.360）。500兆赫的核磁共振¹H图谱（图11）中可以看出，多烯环上和四个双键相连的质子氢（-CH=CH-）的化学位移（δ5.686～6.625ppm）；五个羟基中的质子氢的化学位移值（δ4.187～4.741ppm）；五个亚甲基和两个甲基中的质子氢的化学位移（δ1.274～2.439ppm）。

综合分析上述实验数据，纳他霉素样品的主要活性组分为纳他霉素，其化学结构式为：

Claims

1.利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5562。

2.权利要求1所述的利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117在制备纳他霉素中的应用。

3.权利要求1所述的利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）JZB130117在如下a）或b）中的应用：

a）制备纳他霉素敏感菌抑制剂；

b）抑制纳他霉素敏感菌。