CN103436458B - 一种链霉菌和以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物和新型医药农药领域，具体为一种海洋链霉菌和以海洋链霉菌产生的spiroteteronate类化合物及其制备和应用。链霉菌为Streptomyces sp.12A35，于2012年12月18日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2012529。以海洋链霉菌产生的spiroteteronate类化合物如(I)所示的lobophorins G和H。本发明所得lobophorins G和H可作为新型抗菌素，lobophorins G抗菌性能和氨苄青霉素相当，所述的化合物能通过微生物发酵生产，其制备方法简单、高效，所得产物纯度高。该发明具有良好的应用前景。

Description

一种链霉菌和以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物及其制备和 应用

技术领域

本发明涉及微生物和新型医药农药领域，具体为一种链霉菌和以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物及其制备和应用。

背景技术

海洋微生物已成为新型医药和农药的重要来源，更是新型药物创制的新的增长点。当前，海洋微生物因具有极其庞大的类群和丰富的代谢产物，越来越受到各国科学家的重视，尤其是深海微生物，因其独特的海洋环境和特殊的微生物类群，新的活性化合物被不断发现。这将为新发生的感染性疾病、耐药病菌的治疗和高效、安全、低毒的兽药和农药的开发提供良好的候选药物。

Spiroteteronates是一类具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗疟疾等广泛生物活性的天然抗生素。目前已发现的spiroteteronates类化合物有kijanimicin,tetrocarcins,chlorothricin,decatromicins，saccharocarcins,antlermicins,versipelostatins,arisostatins,quartromicins，chrolactomycin和lobophorins。其独特的化学结构和生物活性不断吸引药物学家的关注。

发明内容

本发明目的在于提供一种链霉菌和以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物及其制备和应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种链霉菌，链霉菌分类学命名为链霉菌12A35Streptomyces sp.12A35，于2012年12月18日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2012529，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。

以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物，如(I)所示的lobophorinsG和H。

以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物的制备方法，

1)将链霉菌Streptomyces sp.12A35接种于含人工海盐的PSA液体培养基中发酵4-10天；将发酵液和菌丝体固液分离，其中发酵液用大孔吸附树脂吸附，树脂与发酵液质量体积比为之比为1：10-30；吸附完成后，先用蒸馏水洗涤树脂，再用乙醇解吸，回收乙醇溶剂后得spiroteternate的粗提物A；菌丝体经丙酮浸提3次，将浸泡液减压浓缩为浸膏使用甲醇精制得到spiroteternate的粗提物B；

2)将spiroteternate的粗提物A和B合并，采用快速硅胶柱色谱法分离，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为10:0-0:10梯度洗脱，收集体积比为9:1-7:3的二氯甲烷-甲醇(v/v)的洗脱组分，即得含spiroteternate类化合物的色谱流分；

3)上述所得色谱流分再采用反相中压色谱进行纯化，按照甲醇：水(v/v)比为1:9-10:0梯度洗脱，收集体积百分比为80%-95%的甲醇水溶液洗脱液，将收集的组分再以反相HPLC进行纯化，流动相为含0.05%TFA的体积百分比90%的甲醇水溶液等度洗脱，流速为2-5ml/min;收集保留时间分别为7-9min、9-11min、11-15min、15-17min、16-20min的色谱峰即得得到O-β-kijanosyl-(1→17)-kijanolide（4d）、H（4e）、lobophorinsB（4a）、G（4b）和F（4c）。

将链霉菌Streptomyces sp.12A35经海水高氏一号培养基活化后接种于含人工海盐的PSA液体培养基中，温度20-37℃，转速100-300rpm，发酵培养4-10d。

所述含人工海盐的PSA液体培养基为，10.0～30.0g蔗糖，100g～350g土豆浸出液，20.0～40.0g人工海盐，用蒸馏水配平至1L，pH5.0～8.0。

以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物的应用，所述化合物可作为制备成医用、兽用或农用非治疗目的的抗菌剂。所述化合物可作为抗金黄色葡萄球菌或地衣芽孢杆菌的抑菌剂。

本发明所具有的优点：经本发明提供了一种分离自深海的链霉菌Streptomyces sp.12A35，其能发酵产生较高含量的spiroteteronate类化合物，尤其是能产生新型的spiroteteronate类抗生素lobophorins G和H。它们可作为医用、兽用或者农用的抗菌药物，lobophorins G抗菌性能与氨苄青霉素相当，同时本发明所提供的制备方法简单、高效，所得产物纯度高。该发明具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的Streptomyces sp.12A35基于其16S rRNA基因序列构建的进化树。

图2为本发明实施例提供的化合物4a(lobophorin B)的HRESIMS图。

图3为本发明实施例提供的化合物4a(lobophorin B)的¹H NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图4为本发明实施例提供的化合物4a(lobophorin B)的¹³C NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图5为本发明实施例提供的化合物4b(lobophorin G)的HRESIMS图。

图6为本发明实施例提供的化合物4b(lobophorin G)的¹H NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图7为本发明实施例提供的化合物4b(lobophorin G)的¹³C NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图8为本发明实施例提供的化合物4b(lobophorin G)的HSQC(BrukerAV600，CDCl₃)光谱图。

图9为本发明实施例提供的化合物4b(lobophorin G)的HMBC(BrukerAV600，CDCl₃)光谱图。

图10为本发明实施例提供的化合物4b(lobophorin G)的¹H-¹HCOSY(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图11为本发明实施例提供的化合物4c(lobophorin F)的HRESIMS图。

图12为本发明实施例提供的化合物4c(lobophorin F)的¹H NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图13为本发明实施例提供的化合物4d(O-β-kijanosyl-(1→17)-kijanolide)的HRESIMS图。

图14为本发明实施例提供的化合物4d(O-β-kijanosyl-(1→17)-kijanolide)的¹H NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图15为本发明实施例提供的化合物4d(O-β-kijanosyl-(1→17)-kijanolide)的¹³C NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图16为本发明实施例提供的化合物4e(lobophorin H)的HRESIMS图。

图17为本发明实施例提供的化合物4e(lobophorin H)的¹H NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图18为本发明实施例提供的化合物4e(lobophorin H)的¹³C NMR(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

图19为本发明实施例提供的化合物4e(lobophorin H)的HSQC(BrukerAV600，CDCl₃)光谱图。

图20为本发明实施例提供的化合物4e(lobophorin H)的HMBC(BrukerAV600，CDCl₃)光谱图。

图21为本发明实施例提供的化合物4e(lobophorin H)的¹H-¹HCOSY(Bruker AV600，CDCl₃)光谱图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明，但本专利的保护内容不仅限于此。

实施例1深海放线菌12A35的鉴定

放线菌12A35，分离自中国南海-2134m的深海沉积物(17°59.928′N111°36.160′E),于2012年12月18日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2012529。

将菌株12A35液体培养72h后，提取总DNA，经纯化后采用通用引物进行16S rDNA基因序列的PCR扩增，PCR产物经检测、纯化后进行测序，得到16S rDNA序列如下所示，在GenBank核酸序列数据库进行相关种属序列比较，结果显示，菌株12A35与Streptomyces pactum NBRC13433^T,Streptomyces olivaceus NBRC12805^T,和Streptomyces parvulus NBRC13193^T的同源性最高分别达100%,100%,and99.65%。在进化树上12A35和上述3种菌在同一分支上（见图1），因此将菌株12A35初步鉴定为链霉菌属的成员。

>12A3516S rRNA

CGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTG

CACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATTGACCTTCACGGGCATCTGTG

AGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATG

GCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACA

CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCA

GCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAA

AGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG

GCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGT

GAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAG

ATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCG

GATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCC

TGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGC

AGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA

CGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGC

实施例2菌株12A35发酵制备spiroteteronate类化合物

2.1菌种活化：将菌株12A35用划线法接种于人工海水高氏一号平板上，28℃恒温培养72h；

所述人工海水高氏培养基为：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，人工海水（含2.5%海盐）1L，琼脂20g，pH7.0-7.2,115℃高温灭菌30min。

2.2种子液的制备：在平板上菌株生长浓密处用打孔器取直径5mm菌块，接种于250mL三角瓶装有50mL含人工海盐的PSA液体培养基中，28℃180rpm恒温摇床培养72h；

所述所述人工海盐的PSA液体培养基：20.0g蔗糖糖，200g土豆浸出液，25.0g人工海盐，用蒸馏水配平至1L，pH5.0～8.0。

2.3大瓶发酵：用容量为3L的三角瓶，每瓶装含人工海盐的PSA液体培养基0.75L，115℃灭菌30min后备用。每瓶接种种子液35mL，28℃180rpm恒温摇床培养7d；

2.4粗提物的获得：将发酵物于4000rpm离心20min，收集上清液，离心所得沉淀，待用；收集的上清液以每1000mL上清液中加入60mL湿HP20大孔吸附树脂，在摇床上以180rpm处理2h，处理后再以清水洗涤HP20并弃去洗涤液，然后用10%乙醇洗脱并弃去溶媒，最后用95%乙醇洗涤数次并收集洗脱液，至大孔树脂接近初始颜色为止，将得到的洗脱液减压蒸馏、冷冻干燥，即得发酵液粗提物A。

上述离心所得的菌体沉淀用丙酮超声提取3次，同样经减压蒸馏并冷冻干燥得到粗提物B。

使用Acclaim120反相C18分析柱(4.6mm×250mm)完成粗体物A和B的HPLC指纹图谱分析，检测波长：210nm和254nm，梯度洗脱液为甲醇：0.05%TFA水溶液，其中45min内甲醇由10%→100%的梯度洗脱，流速：0.53ml/min。粗体物A和B峰型相似，故合并粗体物A和B即为spiroteteronate类抗生素粗体物。

2.5快速硅胶柱色谱初步砍段分离：首先将合并后spiroteteronate类抗生素粗提物,用甲醇溶解，待不溶物静置沉降后，轻轻吸出溶液后按沉降物产物与硅胶质量比约为1:2的比例拌样，减压蒸馏至完全干燥。同时准备好500-600目柱层析硅胶柱，通过轻轻敲打使硅胶和减压使其密实平整。干法上样后，按照二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱分离（v/v10:0-0:10）。收集体积比为9:1-7:3的二氯甲烷-甲醇(v/v)洗脱下的洗脱组分，即得含spiroteternate类化合物的色谱流分。

2.6反相中压色谱进行纯化：填料为ODS；色谱柱规格为15mm×70mm；ODS装量4.0g。采用体积百分比为80%-95%的甲醇水溶液洗脱，即得较高纯度的spiroteternate混合组分。进一步用反相HPLC进行纯化。HPLC条件为：色谱柱规格为10mm×250mm；流速2.5ml/min;检测波长220nm；流动相为含0.05%TFA的体积百分比90%的甲醇水溶液等度洗脱;收集保留时间分别为8.9min、9.6min、11.5min、15.2min、16.8min的色谱峰即得到O-β-kijanosyl-(1→17)-kijanolide（4d）、H（4e）、lobophorins B（4a）、G（4b）和F（4c）。其纯度大于95%。

实施例3Spiroteteronate类化合物的结构解析

化合物4a（Rt:11.5min），白色粉末状，HR-ESI-MS：m/z1185.5970[M-H]^-和m/z1209.5901[M+Na]⁺推断其分子式为C₆₁H₉₀N₂O₂₁。¹H-NMR和¹³C-NMR（CHCl₃）显示其与lobophorin B数据完全一致（表1），因此鉴定4a为lobophorin B。

化合物4b（Rt:15.2min），白色粉末状，HR-ESI-MS：m/z1183.5807[M-H]^-和m/z1209.5901[M+Na]⁺推断其分子式为C₆₁H₈₈N₂O₂₁。¹H-NMR和¹³C-NMR（CHCl₃）显示其与lobophorin B有一些差异，主要是连氧的甲基δH4.22(2H,m,H-32)和δC64.9(C-32)被δH9.51(1H,s,H-32)和δC193.3(C-32)取代，并造成H-21向低场位移约1ppm（由δ5.50到δ6.55），这一改变也通过HMBC和¹H-¹H COSY得到确认（图10）。由此命名化合物4b为新的spiroteternate类抗生素lobophorin G（表1）。

化合物4c（Rt:16.8min），白色粉末状，HR-ESI-MS：m/z1025.5203[M-H]^-和m/z1049.5055[M+Na]⁺推断其分子式为C₅₄H₇₈N₂O₁₇。¹H-NMR显示其与lobophorin F数据完全一致，因此鉴定4c为lobophorin F。

化合物4d（Rt:8.9min）,白色粉末状，HR-ESI-MS：m/z781.3917[M-H]^-推断其分子式为C₄₂H₅₈N₂O₁₂。¹H-NMR和¹³C-NMR（CHCl₃）显示其与O-β-kijanosyl-(1→17)-kijanolide数据完全一致，因此鉴定4d为新天然产物O-β-kijanosyl-(1→17)-kijanolide（表1）。

化合物4e（Rt:9.5min），白色粉末状，HR-ESI-MS：m/z911.4544[M-H]^-和m/z913.4522[M+H]⁺推断其分子式为C₄₈H₆₈N₂O₁₅。¹H-NMR和¹³C-NMR（CHCl₃）显示其比lobophorin B少2个糖基，进一步通过HSQC，HMBC和¹H-¹H COSY等2D-NMR确定其结构，并命名为新的抗生素lobophorin H（表1）。

Table1.化合物12A35-4a,4b,4c（lobophorin F）,4d,4e的部分¹H和¹³C NMR(CDCl₃)归属

实施例4活性产物生物活性的测定

首先将活化金黄色葡萄球菌ATCC29213和地衣芽孢杆菌CMCC63501备用。采用微量肉汤稀释法测定几种化合物的MIC，以氨苄青霉素作为阳性对照，空白培养基为阴性对照。将活化好的测试菌株制备成浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经LB培养液1∶500稀释后，向每孔中加100μl；将上述实施例制备所得化合物按照每孔终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.782μg/ml加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，每个浓度三个重复。35℃普通生化培养箱中，孵育24h判断结果。结果如表2所示，5个化合物都有不同程度的抗菌活性，lobophorin G（4b）抗活性最好，抗Bacillus subtilis活性与对照药氨苄青霉素相当，4c对两种菌均有较好的活性。

表2五种化合物的MIC(μg/ml)

Claims (3)

1.一种链霉菌，其特征在于：链霉菌为Streptomyces sp.12A35，于2012年12月18日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2012529。

2.一种权利要求1所述的链霉菌产生的spirotetronate类化合物，其特征在于：如(I)所示的lobophorins G和lobophorins H；

3.一种权利要求2所述的链霉菌产生的spirotetronate类化合物的制备方法，其特征在于：

1)将链霉菌Streptomyces sp.12A35接种于含人工海盐的PSA液体培养基中发酵4-10天；将发酵液和菌丝体固液分离，其中发酵液用大孔吸附树脂吸附，树脂与发酵液质量体积比为1：10-30；吸附完成后，先用蒸馏水洗涤树脂，再用乙醇解吸，回收乙醇溶剂后得spirotetronate的粗提物A；菌丝体经丙酮浸提3次，将浸泡液减压浓缩为浸膏使用甲醇精制得到spirotetronate的粗提物B；

2)将spirotetronate的粗提物A和B合并，采用快速硅胶柱色谱法分离，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为10:0-0:10梯度洗脱，收集体积比为9:1-7:3的二氯甲烷-甲醇(v/v)的洗脱组分，即得含spirotetronate类化合物的色谱流分；

3)上述所得色谱流分再采用反相中压色谱进行纯化，按照甲醇：水v/v比为1:9-10:0梯度洗脱，收集体积百分比为80％-95％的甲醇水溶液洗脱液，将收集的组分再以反相HPLC进行纯化，流动相为含0.05％TFA的体积百分比90％的甲醇水溶液等度洗脱，流速为2-5ml/min；收集保留时间分别为7-9min、9-11min、11-15min、15-17min、16-20min的色谱峰即可得到O-β-kijanosyl-(1→17)-ki janol ide、lobophorins H、 lobophorins B、lobophorins G和lobophorins F；

将链霉菌Streptomyces sp.12A35经海水高氏一号培养基活化后接种于含人工海盐的PSA液体培养基中，温度20-37℃，转速100-300rpm，发酵培养4-10d；

所述含人工海盐的PSA液体培养基为，10.0～30.0g蔗糖，100g～350g土豆浸出液，20.0～40.0g人工海盐，用蒸馏水配平至1L，pH 5.0～8.0。