KR101797820B1

KR101797820B1 - 방선균 유래의 K252d를 유효성분으로 함유하는 벼흰잎마름병균 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101797820B1
Application number: KR1020150157395A
Authority: KR
Inventors: 김정구; 서주원; 성금화
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2017-12-12
Also published as: KR20170054791A

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 MJM30108 균주로부터 생산되는 K252d을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물은 세계 3대 식물 중 하나인 벼의 가장 큰 피해를 야기하는 벼흰잎마름병을 억제하여 벼 재배 지역의 피해를 최소화할 수 있다.

Description

방선균 유래의 K252d를 유효성분으로 함유하는 벼흰잎마름병균 억제용 조성물{Composition containing K252d derived from Streptomyces for rice bacterial blight suppressing activity}

본 발명은 방선균 유래의 K252d를 유효성분으로 함유하는 벼흰잎마름병균 억제용 조성물에 관한 것이다.

벼의 흰잎마름병(Bacterial blight)은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)이 월동기간 동안 기주식물로 알려진 겨풀, 나도겨풀 등의 땅속줄기 또는 뿌리주위나 병든 볏짚, 벼 그루터기에 잠복해 있다가 관개수에 의해 논으로 이동한 후, 벼잎의 물구멍과 공기구멍 부위, 절단된 뿌리 등에 침입하여 벼에 감염되고, 감염된 벼에서 증식하여 2차로 전염되는 것에 의해 7월 초~수확기, 특히 7월 상순~8월 중순에 발병하는 병해로, 최종적으로 벼가 말라 죽게 되어 수확량의 감소를 초래하므로 농가에 피해가 크다.

종래에는 이러한 벼의 흰잎마름병을 예방 및 방제하기 위하여 저수지나 관계수로에 있는 병원균의 기주식물을 제거하는 방법; 질소질 비료의 사용량이 많으면 질소질 비료에 의해 벼가 감수성으로 되어 흰잎마름병의 발병이 촉진되므로, 질소질 비료의 사용량을 조절하는 방법; 벼가 물에 잠기지 않도록 하고, 만약 잠기게 되면 최대한 빨리 물을 빼주어 침수시간을 짧게 하여 병원균과의 접촉을 차단하여 병의 전염을 방지하는 방법; 약제를 사용한 방법 등을 사용하여 왔다.

그러나, 상기한 방법들은 그 효과가 매우 미미한 실정이다. 특히, 약제방제법은 벼흰잎마름병원균을 조기에 발견하여 미연에 벼의 흰잎마름병을 예방 또는 방제하여 농가의 피해를 최소화할 수 있는 새로운 방제방법의 개발이 필요하였지만, 현재는 벼흰잎마름병원균의 검출을 위해서 선택배지를 이용하거나 병원균의 생리, 생화학적 특성의 검정을 수행하는 방법에 의해 검정하거나, 또는 병이 어느 정도 진행된 상태에서 육안으로 병을 인지하여 왔을 뿐이다.

이에, 본 발명자들은 벼흰잎마름병을 억제하는 활성을 나타내는 화합물을 방선균으로부터 분리하여, 본 발명을 완성하였다.

국내 공개특허 제10-2011-0070588호

본 발명의 목적은 K252d을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 K252d의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 벼흰잎마름병 방제 방법을 제공하기 위한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 도 1의 K252d을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.

K252d이란, 인돌로카르바졸 알칼로이드(indolocarbazole alkaloid)의 일종으로 분자량은 457.49 m/z, 분자식은 C₂₆H₂₄N₃O₅ 이다.

본 발명에서 상기 K252d은 벼흰잎마름병균에 대한 동등한 작용을 나타내는 한, 이들 화합물뿐만 아니라 이의 염 또는 유도체를 사용할 수 있다.

상기 K252d은 대표적인 방선균(actinomyces)으로 알려져 있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)의 스트렙토마이세스 MJM30108 균주에서 유래된 것일 수 있다.

방선균이란, 토양·식물체·동물체·하천·해수 등에 균사체 및 포자체로 존재하는 미생물로 세균에 가까운 원핵생물 즉, 세균의 방선균목으로 분류된다. 세포의 크기가 세균과 비슷하며 세포가 곰팡이의 균사처럼 실 모양으로 연결되어 발육하며 그 끝에 포자를 형성한다. 방선균으로는 결핵균이나 한센병균이 알려져 있으며 스트렙토마이세스도 이 종류에 속한다. 토양 중 방선균은 각종 유기물의 분해, 특히 난분해성 유기물 분해에 중요한 역할을 하며 항생물질을 만들기도 한다.

본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물은 상기 K252d이 총 조성물 100 중량부 대비 0.001 내지 90 중량부 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 벼흰잎마름병 방제용 조성물은 상기 K252d 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 충전제, 중량제, 계면활성제 등을 혼합하여 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제조할 수 있다.

상기 벼흰잎마름병은 잔토모나스(Xanthomonas) 속 세균에 의해 발생되는 식물병일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은

a)스트렙토마이세스 MJM30108(Streptomyces sp. MJM30108) 균주를 배양하는 단계;

(b)상기 배양물을 유기용매로 추출하는 단계;

(c)상기 추출물에 대해 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계; 및

(d)상기 활성분획을 정제하는 단계를 포함하는 K252d의 제조방법을 제공한다.

상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 부탄올, 주정, 아세톤, 에틸아세테이트, 에테르, 클로로포름, 펜탄, 헥산, 헵탄, 노난, 데칸, 벤젠, 톨루엔 및 자이렌으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 여기서 '주정'이란 전분질 원료 또는 당질 원료를 발효시킨 후 증류하여 만든 에탄올을 의미한다. 상기 유기용매로써는 메탄올, 에탄올, 부탄올 및 주정 등 알코올인 것이 바람직하고, 메탄올인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 크로마토그래피는 이에 한정되는 것은 아니나, 흡착제로서 실리카겔, 역상실리카겔, 세파덱스류, 다이아이온 레진류, 알루미나, 활성탄, 규산마그네슘, 탄산칼슘, 인산칼슘, 인산마그네슘, 마그네시아 또는 수산화칼륨 등을 사용할 수 있으며, 세파덱스류를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 고성능 액체 크로마토그래피를 한번 더 수행할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 벼, 벼의 종자 또는 벼의 재배 토양에 처리하는 벼흰잎마름병 방제 방법을 제공한다.

상기 방제 방법은 통상적인 식물 병원균의 방제방법이라면 한정되지 않고 적용할 수 있으나. 상기 조성물을 벼흰잎마름병이 발생된 병반 또는 발생이 예상되는 부위에 살포하거나 도포하여 방제하는 방법일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 MJM30108 균주 유래 K252d은 벼흰잎마름병의 병원균인 Xanthomonas oryzae pv. Oryzae KACC 10331의 배양 배지를 포함하는 벼잎 외식편에 투여 시, 벼잎 외식편이 황색이 아닌 녹색을 나타내어 벼흰잎마름병 억제에 현저한 효과가 있음을 확인하였다(도 2).

본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물은 세계 3대 식물 중 하나인 벼의 가장 큰 피해를 야기하는 벼흰잎마름병을 억제하여 벼 재배 지역의 피해를 최소화할 수 있다.

도 1은 스트렙토마이세스 MJM30108 균주에서 유래된 K252d의 화학식이다.
도 2는 C₁₈ RP-HPLC 분리 후, 20번째 분획에서 UPLC-Q-TOF-MS 분석 크로마토그램(이온추출) 및 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 C₁₈ RP-HPLC 분리 후, 20번째 분획에서 UHPLC-LTQ-IT-MS/MS 분석 크로마토그램 및 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 스트렙토마이세스 MJM30108 균주에서 유래된 K252d의 벼흰잎마름병에 대한 벼잎 외식편 스크리닝 결과를 나타낸 도이다; 1컬럼: 음성대조군, 5컬럼: K252d 투여군, 12컬럼: 양성대조군(DAPG, 2,4-Diacetylphloroglucinol).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 스트렙토마이세스 MJM30108( Streptomyces sp . MJM30108 ) 균주의 분리 및 동정

스트렙토마이세스를 분리하기 위하여, 임실군(전북, 한국)에서 얻은 1g의 토양 샘플을 세척하여 60℃에서 30분 동안 가열하고, 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.)를 분리하기 위해 가열된 샘플을 HV(Humic acid vitamin) 한천 배지로 옮겼다.

한천에서 배양된 스트렙토마이세스를 수득하여 GSS 배지(가용 녹말 1%, 글루코스 2%, 대두박 2.5%, 쇠고기 추출물 0.1%, 효모 추출물 0.4%, NaCl 0.2%, K₂HPO₄ 0.025%, CaCO₃ 0.2%, pH 7.2)에서 200rpm, 28℃에서 7일 간 배양하고 16개의 2L 삼각 플라스크에 650 ml씩 나누어 담았다.

스트렙토마이세스를 동정하기 위하여, 전장 16S rDNA를 유니버셜 프라이머 세트(universal primer set)인 27F 프라이머(5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3')(서열번호 1) 및 1492R 프라이머(5'-GGA TAC CTT GTT ACG ACT T-3')(서열번호 2)를 이용하여 증폭하였고, 상기 서열을 NCBI 홈페이지(National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 분석하였다.

그 결과, 분리된 균주는 스트렙토마이세스 균주와 99%의 상동성을 가짐을 확인하였다. 따라서 분리된 스트렙토마이세스 균주를 스트렙토마이세스 MJM30108(Streptomyces sp. MJM30108)로 명명하였으며, 희귀유용미생물추출은행(http://www.ecum.or.kr)에 등록하였다. 상기 균주는 명지대학교에서 분양받을 수 있다. 그리고, 별도로 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 기탁번호 KACC92096P로 기탁하였다(기탁일: 2015.10.16.).

< 실시예 2> 스트렙토마이세스 MJM30108 균주로부터 벼흰잎마름병 억제 활성 화합물의 분리 및 동정

벼흰잎마름병 억제 활성 화합물을 분리하기 위하여, 스트렙토마이세스 MJM30108 균주를 실시예 1에 따른 GSS 배지에서 28일 간 배양한 후 배양액을 제거하고 균개에 80% 메탄올을 첨가하여 공지의 방법으로 마쇄하였다. 상기 마쇄한 균개에 에틸아세테이트 300ml를 첨가하고 4℃에서 10분간 15,000rpm으로 원심분리 한 후, SepPak SPE(고체상 추출, Solid phase extraction) 시료를 이용한 세파덱스(Sephadex) LH-20 컬럼 크로마토그래피로 분획하였다. 이후, C₁₈ 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reverse-phase high-performance liquid chromatography, C₁₈ RP-HPLC)로 활성 화합물을 분리하였으며, HPLC의 20번째 분획에서 활성 화합물의 함량이 가장 높은 것을 확인하였다.

수득한 활성 화합물을 UPLC-Q-TOF/MS(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry)로 분석한 결과, 분자량은 457.49 m/z, 분자식은 C₂₆H₂₄N₃O₅ 이었다(도 2). 또한, LC-ESI-MS/MS(Liquid chromatography tandem mass spectrometry)로 분석한 결과, MSⁿ 토막 이온(Fragment ion)은 458>312>269 m/z이었으며, UV λ_max는 223, 248, 260, 268, 280, 290, 320, 322, 335, 347, 364 nm이었다(도 3, 표 1).

Tentative identification	UPLC-Q-TOF-MS						LC-ESI-MS/MS
	RT	Measured mass (m/z)		Elemental Composition (+)	Error (ppm)	i-Fit (norm)	MSⁿ Fragment ions (m/z)		UVλ_max(nm)
		(+)	(-)				(+)	(-)
K252d	5.5	458.168	456.151	C₂₆H₂₄N₃O₅	1.3	2.9	458>312>269	456>310	217, 289, 334, 348, 366

그 결과, 분리된 벼흰잎마름병 억제 활성 화합물은 K252d인 것을 확인하였다(도 1).

< 실시예 3> 스트렙토마이세스 MJM30108 균주 유래 화합물의 벼흰잎마름병에 대한 억제 활성

K252d의 벼흰잎마름병에 대한 억제 활성을 확인하기 위하여, 96웰 플레이트에서 2배 연속 희석법을 수행하였다. 벼흰잎마름병의 병원균인 Xanthomonas oryzae pv. Oryzae KACC 10331의 배양 배지를 벼잎 외식편에 투여하였다. 벼잎 외식편의 병원균 감염 정도는 육안으로 확인하였다.

그 결과, K252d를 투여한 96웰 플레이트의 5컬럼 내 벼잎 외식편이 황색이 아닌 녹색을 나타내어, 양성대조군인 DAPG(2,4-Diacetylphloroglucinol)보다 우수한 병원균 감염 억제 효과가 있음을 확인하였다(도 4).

농업생명공학연구원

KACC92096P

20151016

<110> Republic of Korea <120> Composition containing K252d derived from Streptomyces for rice bacterial blight suppressing activity <130> P15R12D1400 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> 27F primer_forward <400> 1 agagtttgat catggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> 1492R primer_reverse <400> 2 ggataccttg ttacgactt 19

Claims

하기 화학식Ⅰ의 K252d을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물;
[화학식Ⅰ]

.
제1항에 있어서,
상기 K252d은 스트렙토마이세스 MJM30108(Streptomyces sp. MJM30108, 수탁번호 KACC92096P) 균주에서 유래된 것인 벼흰잎마름병 방제용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 K252d은 총 조성물 100 중량부 대비 0.001 내지 90 중량부 포함되는 것인 벼흰잎마름병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 벼흰잎마름병은 잔토모나스(Xanthomonas) 속 세균에 의해 발생되는 식물병인 벼흰잎마름병 방제용 조성물.
(a)스트렙토마이세스 MJM30108(Streptomyces sp. MJM30108, 수탁번호 KACC92096P) 균주를 배양하는 단계;
(b)상기 배양물을 유기용매로 추출하는 단계;
(c)상기 추출물에 대해 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계; 및
(d)상기 활성분획을 정제하는 단계를 포함하는 K252d의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 에테르, 클로로포름, 펜탄, 헥산, 헵탄, 노난, 데칸, 벤젠, 톨루엔, 자이렌 및 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 K252d의 제조방법.
제1항의 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 벼, 벼의 종자 또는 벼의 재배 토양에 처리하는 것인 벼흰잎마름병 방제 방법.